全 文 ：中国特有濒危裸子植物白豆杉 RAPD反应体系的优化
欧阳蒲月1 ,2 , 　　苏应娟2 , 　　易　俗2
(1.广东化工制药职业技术学院 , 广东 广州　510520;　2.中山大学 生命科学学院 , 广东 广州　510275)
摘　要:采用改进的 CTAB法提取中国特有濒危裸子植物白豆杉 (Pseudotaxus chienii)嫩叶总 DNA , 进行 RAPD
分析.分别研究了模板 DNA、 引物 、 dNTPs、 Mg2+和 TaqDNA聚合酶用量对 RAPD PCR扩增反应结果的影响.筛选并建
立了适合于白豆杉 RAPD扩增的反应体系:总体积 25 μL , 其中 10×PCR缓冲液 (500 mmol L KCl , 100 mmol L Tris-
HCl , 1.0%Triton X-100 , 20 mmol L MgCl2)2.0μL , 引物 (1.5μmol L)0.5 μL , dNTPs (10 mmol L)0.4μL, 模板 1μL
(35 ng), Taq酶 0.8 μL (0.5 U), 水 20.3 μL.
关键词:白豆杉;　RAPD;　反应体系;　优化
中图分类号:Q493.99　　　文献标识码:A　　　文章编号:1671-9743 (2007)02-0076-03
收稿日期:2006-11-10
基金项目:国家自然科学基金资助项目 (No:30270153).
作者简介:欧阳蒲月 (1978-), 女 , 湖南邵阳人 , 广东化工制药职业技术学院助讲 , 硕士 , 主要研究药用植物资源和药
用植物分子生物学.
　　白豆杉(Pseudotaxus chienii(Cheng)Cheng)为常绿
灌木或小乔木 ,高达4 m ,雌雄异株 ,种子成熟时肉质杯
状假种皮呈白色 ,染色体数目 2 n=24;是我国特有裸
子植物[ 1] .分类上 ,白豆杉被单独处理成白豆杉属
(Pseudotaxus Cheng),归在红豆杉科(Taxaceae).白豆杉
在浙江南部 、江西西南部 、湖南南部和西北部 、广西北
部以及广东北部均有分布[ 1] ,生长在海拔 800 ～ 1500
m ,地势高峻的陡坡 、沟谷两侧或悬岩上.由于其天
然种群数量已十分有限 ,现被列为国家二级保护珍稀
植物[ 1 , 2] .应用 RAPD(random amplified polymorphic
DNA)技术对其进行遗传多样性分析 ,了解其遗传变
水平可以为其制定保护策略 ,实施有效管理 ,直至为
最终建立可自我持续发展的种群提供必需的基础资
料[ 3].随机扩增多态性 DNA(RAPD)技术现已成为在
种内水平上检测物种分子多态性的常规方法.RAPD
标记使用的引物长度一般为 10个碱基 , Tm 值较低 ,
因而其PCR反应易受实验条件的影响.对白豆杉进
行RAPD分析 ,首先要建立一个稳定的反应体系 ,以
确保 RAPD 结果的可靠性 .为此 , 本文就白豆杉
RAPD 反应中的模板 DNA 、引物 、dNTP 、Mg2+和 Taq
DNA聚合酶用量对反应结果的影响进行了探讨 ,筛
选并建立一个稳定的反应体系 ,为白豆杉的遗传分析
提供一个标准化程序.
1　材料与方法
1.1　模板 DNA的制备及其质量检测
将采自湖南张家界森林公园天子山的白豆杉个
体的新鲜叶片 , 按改进的 CTAB 法[ 4] 提取模板总
DNA.紫外光吸收以确定DNA浓度和纯度.
1.2　RAPD反应体系优化
以 白 豆 杉 总 DNA 为 模 板 , 采 用 S178
(TGCCCAGC CT)为引物 , 在 Thermal Cycler (美国
MJ公司)上进行 RAPD扩增反应.初始条件为:总
体积 25μL , 其中 10×PCR缓冲液 (500 mmol L KCl ,
100 mmol LTris-HCl , 1.0%Triton X-100 , 20 mmol
L MgCl2)2.5μL , 引物 (1.5μmol L)0.3μL , dNTPs
(10 mmol L)0.5μL , 模板 2 μL (35 ng), Taq酶 0.5
μL (0.5 U).扩增条件:94 ℃200 s预变性;94 ℃
60 s , 36 ℃60 s;72 ℃120 s , 40 个循环;72 ℃延
伸 10 min , 之后 4 ℃保存.扩增产物用 100 bp DNA
ladder作为相对分子量标准 , 用 1.4%琼脂糖凝胶
(配制时已经加了溴化乙锭)于 3V cm电场中电泳.
在 254 nm 紫外灯下观察 、 照像记录.RAPD反应体
系优化时 , 固定扩增程序 , 每次改变 RAPD反应中
的 1个参数 , 以确定该参数对 RAPD 结果的影响.
筛选的参数包括:(1)模板 DNA 质量浓度;(2)
Taq DNA聚合酶用量;(3)引物用量;(4)dNTPs浓
度;(5)Mg2+浓度.
上述所用 RAPD引物 、 酶及相关试剂均购自上
海 Sangon公司.
第 26 卷第 2期　　 　 　　　　　　怀化学院学报　　 　 　　　　　　Vol.26.No.2
2 0 0 7 年 2 月　 　 　 　 　JOURNAL OF HUAIHUA UNIVERSITY 　 　 　 　 　 　Feb., 2 007
2　结果与分析
2.1　模板 DNA质量浓度对 RAPD的影响
模板 DNA质量浓度是影响 RAPD扩增产物产率
与特异性的一个重要因子.模板质量浓度太低 , 则
扩增产物产量低或不稳定;模板质量浓度太高 , 则
可能增加非特异产物的扩增.图 1 (A)泳道 1 ～ 6
是不同模板 DNA 质量浓度 (150 ng uL 、 100 ng uL 、
60 ng uL 、 35 ng uL、 10 ng uL、 1 ng uL)下 , 以引物
S178进行 RAPD 扩增的结果.从图 1 (A)可以看
出 , 模板 DNA用 10 ng uL , 带比较弱 , 1500 bp左右
的带不能得到有效扩增.模板 DNA 质量浓度高的
(100 ng uL 以上)则扩增结果产生弥散现象 , 背景
有点模糊.说明对于白豆杉的 RAPD扩增 , 较适的
模板 DNA质量浓度范围为 35 ng 左右 , 这与 Lowe[ 5]
等的研究结果基本一致.Lowe[ 5] 等认为 50 uL 的反应
体积 , 模板 DNA的量在 5 ～ 500 ng 之间常可以得到
较好的结果 , 10 ～ 50 ng 是最适宜的.
2.2　TaqDNA聚合酶用量对 RAPD的影响
在PCR反应中 , Taq DNA 聚合酶用量受到反应
体积 、 酶活 、 酶的耐热性及反应程序等因素的影
响.为了确定白豆杉的 RAPD反应中 Taq DNA 聚合
酶的适宜用量 , 试验选择 6个酶梯度 , 分别为 3 u 、
2.5 u 、 2 u 、 1.5 u 、 1 u 、 0.5 u (图 1 (B)泳道 1 ～
6).结果表明 Taq DNA 聚合酶的用量在 0.5 u 时 ,
背景比较清晰 , 大于 0.5 U时 , 背景比较模糊.因
此0.5 u的酶量对 25 uL的反应体积已足够.
2.3　引物浓度对 RAPD的影响
分别以 0.036 、 0.030 、 0.024 、 0.018 、 0.012 、
0.006 umol L、 0.001 umol L 6 个引物浓度梯度图 1
(C) (泳道 1 ～ 6)进行 RAPD扩增 , 结果表明引物
浓度对 RAPD扩增结果有较大的影响.从图 1 (C)
可以看出 , 当引物 S178浓度为 0.006 umol L 时 , 所
得的扩增带较弱 , 基本上看不到.当引物浓度为
0.012 umol L时 , 最小的那条带有点弱.然而当浓度
为0.030 、 0.024 、 0.018 、 0.012 umol L 这个范围内 ,
扩增结果较为一致 .所以 0.018 umol L 最为清晰 ,
且背景相对带来说比较淡 , 从而选择 0.018 umol L
引物浓度 , 从而 1.5μmol L的引物就只需要 0.3 μL.
2.4　dNTPs浓度对 RAPD的影响
dNTPs是 TaqDNA聚合酶的底物 , 其浓度将直接
影响 RAPD扩增产物的量 , 同时也可能影响 TaqDNA
聚合酶的活性和扩增的特异性.用引物 S178对 50 、
100 、 200 、 250 、 300 、 350 umol L 6 个水平的 dNTPs
浓度进行的试验 (图 1 (D)中 1-6泳道)结果表
明 , 当 dNTPs浓度低于 150 umol L 时 , 扩增条带相
对来说比较弱.在 200 ～ 350 umol L 范围内扩增带则
基本一致 , 但带的强度有明显的不同.考虑到带的
强度和清晰度 、 节约试剂三方面 , 选择 250 umol L
dNTPs浓度进行白豆杉的 RAPD扩增.
2.5　Mg2+浓度对 RAPD的影响
Mg
2+是 Taq DNA聚合酶的激活剂 , 太低或太高
都将影响酶的活性 , 此外其浓度还影响引物与模扳
的解链与退火.图 1 (E)中 1 -6 泳道分别表示
1.5 、 2.0 、 2.5 、 3.0 、 3.5 、 4.0 mmol LMg2+显示了
不同 Mg2+浓度对 RAPD扩增结果的影响 .结果表
明 , 以 S178 为引物 , Mg2+浓度为 1.5 ～ 2.5 mmo L
时 , 能扩增出清晰的 DNA 条带 , 随着 Mg2+浓度的
进一步提高 , 扩增条带逐渐减弱 , 有些有效带反而
不能扩增.因此 2.0 mmol L 的Mg2+浓度是进行白豆
杉 RAPD扩增的最适浓度.
综合考虑上述各因素对 RAPD扩增的影响 , 最
后选定白豆杉的 RAPD扩增反应体系为:总体积 25
μL , 其中 10 ×PCR 缓冲液 (500 mmol L KCl , 100
mmol L Tris-HCl , 110% Triton X-100 , 20 mmol L
MgCl2)2.5 μL , 引物 (1.5 μmol L)0.3 μL , dNTPs
(10 mmol L)0.5μL , 模板 1 μL (70 ng), Taq酶 0.5
μL (0.5 U).扩增条件:94 ℃200 s预变性;94 ℃
60 s , 36 ℃60 s;72 ℃120 s , 40个循环;72 ℃延伸
10 min , 之后 4 ℃保存.
参考文献:
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(RAPD) [ J] .Plant Genetic Resources New sletter , 1996 ,
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·77·第 26 卷第 2 期　　　　欧阳蒲月 , 苏应娟 , 等:中国特有濒危裸子植物白豆杉 RAPD反应体系的优化
图 1
Optimal Choice for Reaction System in RAPD Analysis of
Pseudotaxus Chienii(Taxaceae)
OUYANG Pu-yue1 , 2 , 　　SU Ying-juan2 , 　YI Su2
(1.Guangdong Vocational &Technical College of Pharmaceutical Engineering , Guangzhou , Guangdong 510520;
2.School of Life Sciences , Sun Yat-sen University , Guangzhou , Guangdong 510275)
Abstract:The DNA templates of Pseudotaxus chienii (Taxaceae)extracted from young leaf were amplified by RAPD.Effects
of the content of DNA temlates , primers , dNTP , Mg2+ and Taq DNA polymerase on experimental results were tested and the
optimal reaction system of RAPD for Pseudotaxus Chienii (Taxaceae)was determined as follows:35 ng DNA template , 2.0
mmol LMg2+ , 0.018 umol L primer , 250 umol L dNTPs , 0.5 u Taq DNA polymerase in total 25 uL reaction volume.
Key words:Pseudotaxus chienii (Cheng)Cheng ;　RAPD;　reaction system;　optimal choice
·78· 怀化学院学报　　　　 　　　　　　　　　　　　　　2007 年 2月