全 文 ：·应用技术·
收稿日期：２０１５－０８－２５
基金项目：成都市科技惠民技术研发项目（编号：２０１４－ＨＭ ０１－００１６２－ＳＦ）。
作者简介：唐 旭（１９９１—），男，四川省德昌县人；在读硕士研究生，研究方向：药用植物；Ｅ－ｍａｉｌ：６４１２３１９７２＠ｑｑ．ｃｏｍ。
通讯作者：王跃华（１９６３—），女，山东青岛人；教授，主要从事药用植物生物技术的教学、科研工作；Ｅ－ｍａｉｌ：１９６１６８９６３６＠ｑｑ．ｃｏｍ。
金钱松细胞悬浮培养关键技术研究
唐 旭１，２， 何诗虹１，２， 王跃华２， 马腾香２， 彭雪婷２， 李红芳２
（１．四川师范大学生命科学院， 成都６１０１０１； ２．成都大学生物产业学院， 四川 成都６１００１６）
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ｔｈｅ Ｋｅｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｌａｒｃｈ Ｃｅｌ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ
ＴＡＮＧ Ｘｕ１，２，ＨＥ Ｓｈｉｈｏｎｇ１，２，ＷＡＮＧ Ｙｕｅｈｕａ２，ＭＡ Ｔｅｎｇｘｉａｎｇ２，ＰＥＮＧ Ｘｕｅｔｉｎｇ２，ＬＩ Ｈｏｎｇｆａｎｇ２
摘 要：目的：建立金钱松细胞的悬浮培养体系，并筛选出金钱
松细胞的最佳培养基配方和其培养条件。方法：利用金钱松叶
原基诱导产生的翠绿色、较分散的愈伤组织为悬浮培养材料，
通过研究其不同激素配比、接种量、蔗糖浓度以及ｐＨ 值对金
钱松细胞悬浮培养的影响。结果：在金钱松细胞的悬浮培养过
程中，最佳的培养基配方为 ＭＳ＋２，４－Ｄ ０．３ｍｇ／Ｌ＋６－ＢＡ １．０
ｍｇ／Ｌ，并且选择的最佳蔗糖浓度为４０ｇ／Ｌ、ｐＨ 值为６．０以及
接种量为２．０ｇ／Ｌ。
关键词： 金钱松；细胞；悬浮培养
ＤＯＩ编码： １０．１６５９０／ｊ．ｃｎｋｉ．１００１－４７０５．２０１６．０１．１２６
中图分类号： Ｓ ７９１．２３ 文献标志码： Ａ
文章编号： １００１－４７０５（２０１６）０１－０１２６－０３
金钱松（Ｐｓｅｕｄｏｌａｒｉｘ ａｍａｂｉｌｉｓ（Ｎｅｌｓｏｎ）Ｒｅｈｄ．）是
我国特有的古老孑遗松科（Ｐｉｎａｃｅａｅ）树种，属于单属
单种［１－３］，由于其特殊的商业和药用价值，目前已处于
濒临灭绝的状态，被国家列为二级保护植物［４－７］。当前
对金钱松的研究主要集中在栽培技术、化学成分和药
理作用等方面［８－１０］；据报道，金钱松含有二萜类、三萜
类和三萜内酯类成分，具有抗真菌、抗生育和抗肿瘤等
作用［１０－１２］，因此，对金钱松植物的需求量也大大增加
了。
为了更好地解决金钱松植物供不应求的状况，积
极开展对金钱松植物的组织培养研究，最终实现利用
细胞发酵技术大规模生产含有效成分的金钱松细胞，
以满足各级市场对金钱松及其所含有效成分的需求。
通过查阅资料可知，何佳等［１３－１４］在金钱松内生真菌方
面进行了大量的工作，但还未见有采用细胞悬浮培养
技术来大规模发酵生产金钱松细胞的；本研究的开展
可寻求一条有效解决当前金钱松资源短缺的新途径。
１ 材料和方法
１．１ 材 料
本实验材料采自四川省成都市植物园，经成都大
学植物鉴定室鉴定为金钱松属（Ｐｓｅｕｄｏｌａｒｉｘ Ｇｏｒｄ．）
植物（Ｐｓｅｕｄｏｌａｒｉｘ ａｍａｂｉｌｉｓ（Ｎｅｌｓｏｎ）Ｒｅｈｄ）金钱松。
本研究采用金钱松叶原基诱导产生的优良翠绿色愈伤
组织为实验材料。
１．２ 方 法
１．２．１ 愈伤组织的获取
选取在 ＭＳ＋６－ＢＡ １．０ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ ０．５ｍｇ／Ｌ
培养基中进行了增殖培养２０ｄ的金钱松愈伤组织细
胞进行悬浮培养，以建立金钱松细胞的悬浮培养体系。
１．２．２ 细胞悬浮体系建立
通过对不同激素配比、接种量、蔗糖浓度和ｐＨ值
等培养条件的筛选，以获得金钱松细胞悬浮培养的最
佳条件。
１．２．３ 悬浮培养细胞的鲜重测量
取充分摇匀的悬浮细胞在４ ０００ｒ／ｍｉｎ的条件下
离心１０ｍｉｎ后，倒掉上清液并进行称重，即为鲜重。
试验重复３次。
１．２．４ 计算公式以及数据分析
生物量增殖倍数＝（收获鲜重量－接种鲜重量）／
接种鲜重量。生长速率＝（收获鲜重－接种鲜重量）／
培养天数。细胞增殖倍数和生长速率均计算平均值和
标准差（ｘ±ｓ）。
２ 结果与分析
２．１ 不同激素配比对金钱松悬浮细胞生长的影响
本实验研究了６－ＢＡ、ＮＡＡ和２，４－Ｄ不同激素组
合对金钱松悬浮培养细胞快速增殖的影响，其中６－ＢＡ
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第３５卷 第１期 ２０１６年１月 种 子 （Ｓｅｅｄ） Ｖｏｌ．３５ Ｎｏ．１ Ｊａｎ． ２０１６
的浓度为１．０ｍｇ／Ｌ；ＮＡＡ 的浓度范围为０．３，０．５
ｍｇ／Ｌ和１．０ｍｇ／Ｌ；２，４－Ｄ的浓度范围为０．３，０．５
ｍｇ／Ｌ和１．０ｍｇ／Ｌ。试验每２天观察记录１次，培养
３０ｄ的统计结果见表１。
表１ 不同激素配比对金钱松悬浮细胞生长的影响
编号 ６－ＢＡ（ｍｇ／Ｌ）
ＮＡＡ
（ｍｇ／Ｌ）
２，４－Ｄ
（ｍｇ／Ｌ）
细胞增殖
（倍数）
生长速率
（ｇ／ｄ）
Ａ １ １．０ ０．３ ０．８２５±０．２２ ０．１２４±０．０４０
Ａ ２ １．０ ０．５ １．３５０±０．７１ ０．２０３±０．１２３
Ａ ３ １．０ １．０ ２．０７５±０．４４ ０．３１１±０．０７６
Ａ ４ １．０ ０．０ ０．３ ３．３７５±０．４４ ０．５０６±０．０７６
Ａ ５ １．０ ０．５ １．４００±０．８０ ０．１７０±０．１４０
Ａ ６ １．０ １．０ １．５００±０．７６ ０．２２５±０．１３１
注：培养３０ｄ的统计结果。下同。
从表１可以看出，不同激素配比对金钱松悬浮培
养细胞的增殖有很大影响。配制的６个激素配比中，
以Ａ ４即以６－ＢＡ １．０ｍｇ／Ｌ和２，４－Ｄ ０．３ｍｇ／Ｌ时，在
悬浮培养３０ｄ后其金钱松细胞的增殖倍数和生长速
率都是最高的，即增殖倍数为３．３７５±０．４４、生长速率
为０．５０６±０．０７６；另外，通过分析６－ＢＡ与２，４－Ｄ和
ＮＡＡ激素配比对金钱松细胞的增殖生长具体影响是
完全不同的；其中在６－ＢＡ浓度保持不变的条件下，随
着ＮＡＡ浓度由０．３ｍｇ／Ｌ到１．０ｍｇ／Ｌ的逐渐增高，
其细胞增殖倍数和生长速率也随着增高，在 Ａ １、Ａ ２
和Ａ ３的３个激素配比中，以Ａ ３即６－ＢＡ １．０ｍｇ／Ｌ
和ＮＡＡ １．０ｍｇ／Ｌ的激素配比最适宜金钱松细胞的
增殖生长；而在由６－ＢＡ与２，４－Ｄ组合的激素配比 Ａ
４、Ａ ５和 Ａ ６的３个配方中，随着２，４－Ｄ浓度由０．３
ｍｇ／Ｌ到１．０ｍｇ／Ｌ的逐渐增高，其增殖倍数和生长速
率却呈现出逐渐降低的趋势。由此可见，在金钱松细
胞悬浮培养过程中，采用不同种类的激素配比，其所需
要的具体激素浓度也是不同的。
２．２ 不同接种量对金钱松悬浮细胞增殖的影响
方文娟等在植物细胞悬浮培养影响因子的研究中
指出，在细胞悬浮培养中接种量对细胞增殖生长有很
大影响［１５－１７］。本实验分别采用在１５０ｍＬ的锥形瓶中
装有４０ｍＬ培养液后，再分别接入了１．０，２．，３．０ｇ和
４．０ｇ分散状况良好的翠绿色金钱松愈伤组织进行悬
浮培养；每２天观察记录１次细胞生长状况，培养３０ｄ
后统计结果见表２。
从表２可以看出，不同接种量对金钱松悬浮培养
细胞的增殖倍数和生长速率都有较大影响；当接种量
由１．０ｇ升高为２．０ｇ时，经３０ｄ培养后其细胞的增殖
倍数和生长速率都是最高的，增殖倍数为２．８４０±
０．５６０、生长速率为０．４８７±０．０９６；但随着接种量进一
步升高超过２．０ｇ时，其细胞的增殖倍数和生长速率
却出现了下降，并且，当接种量增加到４．０ｇ时，其细
胞的增殖倍数和生长速率都是最低（表２），即增殖倍
数仅为１．３４０±０．３２、生长速率也仅为０．１６１±０．０３９。
由此可见，正如王娟等［１８］所说，当接种量较少时，不但
细胞生长的延迟期较长，而且在培养期中的增殖倍数
也较低，但接种量过多时，对数生长期缩短，培养基中
营养成分不足，导致细胞生长缓慢，增殖倍数也相对较
低。当接种量适宜时，悬浮细胞的增殖倍数最多。
表２ 不同接种量对金钱松悬浮细胞的影响
编号
接种量
（ｇ）
细胞增殖
（倍数）
生长速率
（ｇ／ｄ）
Ｂ １ １．０ ２．１４０±０．３４ ０．３０６±０．０４９
Ｂ ２ ２．０ ２．８４０±０．５６ ０．４８７±０．０９６
Ｂ ３ ３．０ １．８００±０．２５ ０．２２５±０．０３２
Ｂ ４ ４．０ １．３４０±０．３２ ０．１６１±０．０３９
２．３ 不同蔗糖浓度对金钱松悬浮细胞增殖的影响
蔗糖浓度也是影响细胞生长和次生物质生产的重
要因子。实验设置的蔗糖浓度分别为２０，３０，４０ｇ／Ｌ
和５０ｇ／Ｌ，实验每２天进行１次观察记录，培养３０ｄ
后统计（结果见表３）。
表３ 不同蔗糖浓度对金钱松悬浮细胞增殖的影响
编号
蔗糖
（ｇ）
细胞增殖
（倍数）
生长速率
（ｇ／ｄ）
Ｃ １ ２０ １．７４０±０．４４ ０．１７４±０．０４４
Ｃ ２ ３０ ２．１６０±０．５７ ０．３５３±０．１３５
Ｃ ３ ４０ ２．７００±０．５２ ０．４６３±０．０８９
Ｃ ４ ５０ ２．３００±０．６７ ０．２３０±０．０６７
从表３可以看出，蔗糖浓度从Ｃ １的２０ｇ／Ｌ增加
到Ｃ ４的５０ｇ／Ｌ，其培养的金钱松细胞呈现出不同的
生长状况。具体分析可以发现，当蔗糖浓度由２０ｇ／Ｌ
升高到４０ｇ／Ｌ时，经３０ｄ培养后其细胞的增殖倍数和
生长速率都呈现出升高的趋势，其中以蔗糖浓度为４０
ｇ／Ｌ时的细胞增殖倍数和生长速率为最高，分别是
２．７００±０．５２和０．４６３±０．０８９；但随着蔗糖浓度进一
步升高到５０ｇ／Ｌ时，细胞增殖倍数和生长速率又开始
出现下降。这进一步说明，糖作为碳源，不仅为细胞提
供合成新化合物的碳骨架、为细胞的呼吸代谢提供底
物与能源；而且糖还用以维持一定的渗透势，是培养物
渗透环境的主要调节者［１８－１９］。研究表明，过高的蔗糖
浓度对细胞生长也是不利的。蔗糖浓度越高，培养基
的渗透压就越大；而过高的渗透压会抑制培养细胞的
生长，甚至会产生非常明显地毒害作用。
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应用技术 唐 旭 等：金钱松细胞悬浮培养关键技术研究
２．４ 不同ｐＨ值对金钱松悬浮细胞增殖的影响
不同种类的植物细胞在培养过程中所需要的ｐＨ
值是不同［２０－２２］。本实验设置的ｐＨ值分别为４、５、６和
７，实验每２天进行１次观察记录，培养３０ｄ后统计
（结果见表４）。
表４ 不同ｐＨ值金钱松悬浮细胞增殖的影响
编号 ｐＨ
细胞增殖
（倍数）
生长速率
（ｇ／ｄ）
Ｄ １ ４ １．３７５±０．２１ ０．１８４±０．０２７
Ｄ ２ ５ １．４７５±０．４１ ０．４４３±０．１２３
Ｄ ３ ６ ２．３２５±０．３４ ０．４６５±０．０６８
Ｄ ４ ７ １．４２５±０．３１ ０．１９０±０．０４１
表４实验结果显示，在金钱松细胞增殖生长过程
中，培养基中的ｐＨ值为６．０时，其悬浮培养细胞的增
殖倍数和生长速率都是最高的。通过观察金钱松细胞
在不同ｐＨ值的培养基中的生长状况可以发现，ｐＨ值
偏高或偏低都不利于金钱松细胞的生长，且均出现不
同程度的细胞褐变情况，细胞的生长速度也明显地降
低。这主要是因为不同的ｐＨ值会引起培养基中的各
成分状态的改变（过高的ｐＨ会使Ｆｅ沉淀）、细胞通透
性和酶的活性改变，以及培养细胞对营养物质的吸收
利用程度的改变；因此，在进行不同细胞的培养过程
中，选择适宜的ｐＨ 值是非常重要的。
３ 结果与讨论
植物细胞的悬浮培养对细胞进行快速大规模、工
业化生产提供了技术手段。金钱松作为我国国家二级
保护植物，又是具有重要作用的药用植物，其资源严重
匮乏，无法满足市场需求，因此急需探讨出大量生产金
钱松或获取金钱松有用成分的方法。
本实验主要研究了影响金钱松细胞悬浮培养的各
种主要因素，通过对激素配比，接种量，蔗糖浓度以及
ｐＨ值的研究，从而找出最佳培养条件，以构建完整的
金钱松细胞悬浮体系，通过实验，金钱松悬浮的最佳组
合为 ＭＳ＋６－ＢＡ １．０＋２，４－Ｄ ０．３＋蔗糖浓度４０ｇ／Ｌ＋
接种量１．２ｇ／４０ｍＬ＋ｐＨ ６．０，继代培养天数为１０ｄ，
延迟期为０～３ｄ，指数期为３～７ｄ，衰落期为７～２０ｄ，
试验中发现，在培养中，开始细胞逐渐在锥形瓶壁上积
累，然后在积累细胞周围长出绿色的细胞，试验中出现
的褐变速率快慢的现象也与实验中金钱松愈伤组织的
质量状况有关，完全翠绿的褐变速度慢，而黄绿色或黄
色的愈伤组织褐变的速率快。
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第３５卷 第１期 ２０１６年１月 种 子 （Ｓｅｅｄ） Ｖｏｌ．３５ Ｎｏ．１ Ｊａｎ． ２０１６