全 文 ：收稿日期: 2007-05-17　　修回日期:2007-12-06
基金项目:美国弗吉尼亚理工学院与州立大学自然资源学院林学系基金资助项目。
作者简介:吴丽君 (1968-), 女 , 福建浦城人 , 高级工程师 , 从事林木 、 花卉生物技术研究。
长叶松优良家系的体胚发生研究
吴丽君1, 2
(1.福建省林业科学研究院 , 福建 福州 350012;2.美国弗吉尼亚
理工学院与州立大学 , 弗吉尼亚黑堡 24061)
摘要:以长叶松优良家系 20-820、 20-803、 20-822、 20-805、 20-825不同采收期的大配子体为外植体 , 选用针叶树体
细胞胚胎发生专利培养基 AL、 TX、 LP、 DS分别与 AL、 TX、 LP培养基激素组合及无激素组合形成 16种体胚诱导培养基 ,
开展家系 、 专利基本培养基 、 球果采收期对长叶松体细胞胚胎发生率影响的研究。结果表明:诱导体胚最理想的球果采收期
为 7月16日和 24日 , 即合子胚发育第 1、 2阶段 , 参试的 5个家系间的胚性胚柄细胞团 (ESM)诱导率不存在显著差异 , 基
本培养基 、 激素组合 2因素对 ESM诱导率有极显著影响 , LP基本培养基与 TX激素组合最适宜诱导长叶松体胚 , 其体胚诱导
率为 28%。
关键词:长叶松;体细胞胚胎发生;专利培养基;诱导率;胚性胚柄细胞团
中图分类号:Q943.1 文献标识码:A 文章编号:1001-389X(2008) 01-0042-06
Studyonsomaticembryogenesisofelitelongleafpinefamilies
WULi-jun1, 2
(1.FujianAcademyofForestry, Fuzhou, Fujian350012, China;2.Virginia
PolytechnicInstituteandStateUniversity, VirginiaBlacksburg24061)
Abstract:Usingthemegagametophyteincludingimmaturezygoticembryosfromthediferentconecolectiontimeoftheelitelongleaf
pinefamilies20-820, 20-803, 20-822, 20-805, 20-825 asexplants, combiningthe4patentmediaAL, TX, LP, DSforso-
maticembryogenesiswithdifferenthormonesanditslevelsorwithouthormonetoform16initiationmedia, theefectsofdiferentpatent
media, families, conecolectiontimeoninitiationratewerestudied.Theresultsshowedthatthemostsuitablecollectiondateofcone
forsomaticembryogenesisisJuly16andJuly24 whenimmaturezygoticembryosisatdevelopmentstage1, 2.Thereisnotsignificant
differenceinembryogenicsuspensormassinitiationrateamong5 families, butinitiationrateofdiferentbasicmedia, differenthormone
combinationshavesignificantdiference.ThecombinationofLPbasicmediumwithTXhormoneismostsuitableforinitiationofsomatic
embryosoflongleafpine, inwhichinitiationrates28%.
Keywords:Longleafpine;somaticembryogenesis;patentmedia;initiationrate;embryogenicsuspensormass
植物体细胞胚胎发生方式被认为是最有潜力 、 自动化快速繁殖无性系良种壮苗的组培快繁技术[ 1-2] ,
自 Hakmanetal[ 3]首次报道获得挪威云杉胚性组织以来 , 云杉属的体细胞胚胎发生研究取得很大进展 , 至
今已有 9个云杉属树种获得体胚苗 [ 2] 。然而试验证明相对于云杉属和冷杉属 , 松属的体细胞胚胎发生的组
织培养及植株再生技术仍然是困难的 [ 1, 4-5] , 松属中 , 研究报道较多且较为成功的体胚发生的树种主要有
辐射松 (Pinusradiata)、湿地松 (P.eliti)、火炬松 (P.taeda)及北美乔松 (P.strobus)。
长叶松 (P.palustris)是美国东南沿海极为重要的软木树种 , 其针叶长 、树皮厚 , 对地表火有一定的
耐火力 , 且对松梭形锈病有较强的抗性。长叶松在生长量及抗病性方面存在较大的遗传变异[ 6] , 通过无
性繁殖技术繁育生长量大 、 抗病性强的长叶松良种壮苗极具研究和应用价值 。Sommeretal[ 7]对长叶松器
官发生植株再生技术开展过研究 , 并已获得小批量的组培苗 , 但存在继代周期长 、 步骤多 、生根率低 、 成
本高等问题 。 1993年 Nagmanietal[ 6]对长叶松体胚发生进行初步的研究 , 仅获得了 3.5%的胚性培养物诱
导率 , 低的体胚诱导率大大阻碍了长叶松进一步体胚发育 、 成熟及再生植株的研究 。筛选适宜体胚诱导的
优良基因型及适宜的外植体 , 进一步通过优化长叶松体胚诱导培养基营养组分 , 改善培养条件 , 提高长叶
松体胚诱导率无疑是长叶松体胚发生技术研究的关键及体胚发生的产业化应用的基础。
福建林学院学报　2008, 28 (1):42-47 第 28卷 第 1期
JournalofFujianColegeofForestry 2008年 1月
DOI :10.13324/j.cnki.j fcf.2008.01.011
1　材料与方法
1.1　材料来源及合子胚发育阶段的检测
长叶松球果由美国弗吉尼亚州长叶松优良家系种子园提供。在长叶松优良家系种子园选定 5个优良家
系分别为 20-820、 20 -803、 20-822、 20-805、 20-825;根据合子胚的生长发育状况 , 确定 (2006
年)6月 27日 、7月 10、 16、 24日及 8月 1日为 5个外植体采收期 , 采集其未成熟球果 , 通过冷藏运输贮
藏在5 ℃冰箱备用。
为研究长叶松体细胞胚胎发生诱导率与合子胚发育阶段的相关性 , 掌握最适宜的体胚诱导的合子胚发
育阶段 , 对 5个采集期所采集的球果的合子胚发育阶段进行检测 。每个家系 、 每个采集期随机抽取 3个球
果 , 每个球果剥取 5个未成熟种子 , 在 20-50倍的解剖镜下对未成熟种子进行解剖 、 镜检 , 根据 Pulman
etal[ 8]的松属合子胚发育阶段划分标准判断不同家系 、不同采集期合子胚的发育阶段 。
1.2　诱导培养基的设计
适宜的诱导培养基是针叶树种体细胞胚胎诱导极为关键的因素。试验以针叶树体细胞胚胎发生专利培
养基 AL[ 9] 、 TX(加拿大 Celfor公司设计)、 LP[ 10] 、 DS[ 11]分别与 AL、 TX、 LP三种培养基的激素组合
(6-BA11.25mg· L-1 、 2, 4-D2.2mg· L-1 +6-BA1.0 mg·L-1、 NAA2.0 mg· L-1 +6-BA0.63 mg
· L-1 +KT0.61 mg· L-1)及无激素对照组 CK形成 16种体胚诱导培养基 (AL-AL、 AL-TX、 AL-LP、
AL-CK;TX-AL、 TX-TX、 TX-LP、 TX-CK;LP-AL、 LP-TX、 LP-LP、 LP-CK;DS-AL、 DS-TX、 DS-LP、 DS-
CK)。
1.3　外植体的无菌处理
用体积分数为 75%的酒精及体积分数为 40%的漂白水稀释液对球果进行常规无菌消毒后 , 用无菌水
清洗 3次以上。经消毒的球果在无菌条件下剥出其未成熟种子后 , 剥取其完整的大配子体 , 水平接种在半
固体状态的诱导培养基上。每个的培养皿 (3.5cm×1.0 cm)接种 1个大配子体 , 各家系 、不同培养基
均接种 50个以上的外植体 , 并确保各采收期 、 各家系 、 不同培养基均接有 10个以上外植体 。培养温度
20-22 ℃,诱导全过程均保持在全暗的培养条件。
2　结果与分析
2.1　合子胚发育阶段镜检结果
对 5个家系的 5个采收期的合子胚进行随机
抽样检测 , 检测结果表明不同家系合子胚发育进
度有一定的差异 (表 1)。检测到的较为典型的合
子胚发育阶段 2、 3如图 1所示 , 发育阶段 2的合
子胚在显微镜下可见多个胚头 (图 1A);发育阶
段 3的合子胚可见一个胚头明显伸长 , 其余胚头
已明显退化 , 而胚柄也明显缩短 、增粗 (图 1B)。
表 1　不同家系合子胚的发育进度
Table1　Developmentalprogressofzygoticembryoindiferentfamily
家系 发育进度 (日 /月)未见合子胚 第 1阶段 第 2阶段 第 3阶段
20-820 27/6 10 /7 16/7、 24 /7 1 /8
20-803 27/6、 10/7 16 /7 24/7 1 /8
20-822 27/6 10 /7、 24/7 16/7、 1 /8
20-805 27/6 10 /7 16/7、 24 /7 1 /8
20-825 27/6、 10/7 16 /7 24/7 1 /8
S.胚柄 , H.胚头。
图 1　长叶松合子胚发育阶段
Fig.1　Thedevelopmentstagesofzygoticembryotestedinlongleafpine
43　第 1期 吴丽君:长叶松优良家系的体胚发生研究
2.2　不同培养基大配子体的形态反应
长叶松大配子体的诱导培养态可分为胚性胚柄细胞团 (embryogenicsuspensormass, ESM)、 非胚性愈
伤组织 、外植体褐化及无形态反应 4种类型 。ESM是一种白色 、透明的具有粘性的胚性组织 , 在显微镜
下可见发育 1-2阶段的合子胚有明显的胚头及细丝状胚柄结构;非胚性愈伤组织可在大配子任何部位产
生 , 为白色 、黄色或褐色非透明没有粘性的组织 , 有的肉眼可见松散的颗粒状大细胞 , 有的组织结构紧
实 , 有的具有较快的增殖速度 , 但没有器官再生能力。
长叶松大配子体接种 20 d后出现体褐化现象 。培养 35 d后即可观察到少量的胚性组织在大配子体表
面产生 , 产生的胚性胚柄细胞团似喷射而出 (图 2A, 图 2B为图 2A中的胚状体)。 Lambardi[ 12]在落叶松
体胚发生的研究中发现胚性胚柄细胞团总是产生于大配子体珠孔端 , 认为 ESM可能源于合子胚的胚柄细
胞 , 本试验也观察到在珠孔处形成 ESM, 如图 2C所示 。Liaoetal[ 1]在湿地松体胚发生的研究中认为以发
育早期合子胚为外植体诱导的胚性组织可能源于合子胚;但发育在 C阶段后的合子胚从珠孔端诱导出胚
性组织后 , 仍可见合子胚保留在大配子内 , 推断是合子胚在大配子体内诱导产生胚性组织后从珠孔端伸
出 。Lambardi[ 12]认为落叶松体胚发生中 , 产生非胚性愈伤组织的外植体上不可能再诱导出胚性组织 , 但
本试验观察到 ESM组织与非胚性愈伤组织同时发生在同一个外植体上 (图 2D), 愈伤化的合子胚也能诱
导出胚性组织。在整个诱导试验中 , 值得关注的是 , 在参试的 16种培养基和 5个家系中 , 平均约有 60%
的大配子胚未产生任何形态变化。
M.大配子体 , S.胚柄, H.胚头 , Ca.愈伤组织。
图 2　20-615家系大配子体在不同培养基上的形态反应
Fig.2　Diferentmorphologicalresponseofmegagametophyteindiferentmidia
图 3　ESM诱导率与球果收集期的相关性
Fig.3　TherelationshipbetweenESMinitiationrateandcolectiondateofcone
2.3　采收期对 ESM诱导率的影响
　　Becwaretal[ 13]和 Davidetal[ 14]认为针叶树种
合子胚的发育阶段是体细胞胚诱导的关键 , 且能对
体胚诱导处理产生反应的合子胚发育期短至几天。
Liaoetal[ 1]在湿地松体细胞胚胎发生的研究中 , 观
察到合子胚的发育阶段不仅影响 ESM的诱导率而
且决定所诱导的 ESM的质量。本试验 5个家系不
同采收期 ESM诱导率的变化规律如图 3, 从图 3可
见 5个家系均在 7月 16日和 7月 24日 2个采收期
44 福　建　林　学　院　学　报 第 28卷　
获得较高的诱导率 , 这 2个采收期的球果主要为发育第 1、 2阶段的合子胚;其中 20-822和 20-803两
家系在 7月 24日采收期 , 即合子胚的第 2发育阶段获得高达 30%以上的诱导率。这与 Nagmainietal[ 6]所
开展的长叶松体胚发生研究结果相似 。对图 4中 5个家系不同采收期的 ESM诱导率进行单因素方差分析 ,
F检验结果表明不同采收期间 ESM诱导率达 0.05显著水平 。
2.4　不同家系不同培养基的 ESM诱导率及其方差分析
Jainetal[ 15] 、 Pulmanetal[ 16] 、 Liaoetal[ 1]通过湿地松 、 火炬松等松属体胚发生试验证明外植体基因
型是体胚诱导的关键因素 。唐巍等 [ 17]报道湿地松胚性组织诱导率因材料的来源地不同而不同。 Nagmaniet
al[ 6]对长叶松体胚发生研究未开展家系间的对比试验。本试验 , 对参试长叶松 5个家系不同培养基 ESM
诱导率进行方差分析 (表 3), 结果表明 , 家系间 ESM诱导率不存在显著差异 , 20-820、 20-803、 20 -
822、 20-805、 20-825在 16种培养基上的平均诱导率分别为 4%、 6.5%、 13%、 9%和 10.8%, 这一
结果是
　　否表明长叶松外植体基因型对 ESM诱导率没有显著的
影响效果 , 还有待于进一步扩大参试外植体基因型的范围。
但从图 5可知 , 不同家系对培养基的适应性显然是不同的 ,
尽管 20-803家系仅在 3种培养基上获得体胚 , 在 16种培
养基上平均诱导率较低 , 但在以 LP为基本培养基的 3种组
合中获得高达 20%以上的体胚诱导率 。 20-820家系在参
试的 10种培养基上获得体胚 , 但各培养基的 ESM诱导率
均较低 。
图 4　5个家系在 16种组合培养基的 ESM诱导率
Fig.4　ESMintiationrateof5familiesindiferentinitiationmedia
　　基本培养基及激素种类 、 浓度组合是影响 ESM诱导率重要因素。 Duncanetal[ 18]认为一些体胚发生困
难的基因型是可以通过培养基等培养条件的优化得以克服的 , 大量试验也说明基因型与培养条件间存在强
的互作效应 。
从 4种专利基本培养基 ESM诱导率分析 , 专利培养基 LP的基本培养基是最为理想 , 总诱导率为
58%, 除 20-825家系因外植体污染所致 , 各家系均在以 LP为基本培养基添加 AL、 TX、 LP三种激素组
45　第 1期 吴丽君:长叶松优良家系的体胚发生研究
图 5　不同组合培养基 5个家系总 ESM诱导率
Fig.5　TotalESMinitiationrateof5families
合的 3种培养基上获得较高的诱导率 , 20 -822、 20-
805家系分别在 LP-LP、 LP-TX培养基上获得了 37%和
33%的诱导率。由图 5可知 , 长叶松在 AL基本培养基上
也获得较高的诱导率。从激素种类与浓度组合因素分析
ESM诱导率 , 可见添加专利培养基 TX的激素种类与浓度
(2, 4-D2.2mg· L-1 +6-BA1.0 mg· L-1)的组合最
为理想 , 其次为 LP激素组合 (NAA2.0 mg· L-1 +6-
BA0.63mg·L-1 +KT0.61mg· L-1), 其 ESM诱导率
分别为 42%和 33%。
为进一步分析不同基本培养基 (A)、不同激素组合
(B)及培养基与激素组合的相互作用 (A×B)对 ESM诱导率的影响 , 对图 5中不同家系 、 基本培养基 、
激素组合的 ESM诱导率进行 3因素方差分析 , 方差分析结果列表 2。从表 2可知 , 基本培养基 、激素组合
及 16种组合培养基 (处理间)的 ESM诱导率差异均达 0.05显著水平;将 5个家系在不同培养基的总
ESM诱导率列图 5所示 , 参试的 16种组合的培养基中 , LP-TX、 LP-LP、 LP-AL、 AL-TX较适宜长叶松体
胚的诱导 , 其体胚诱导率分别为 28%、 27%、 18%、 14%。综合 ESM诱导率与所诱导的 ESM质量评价
(ESM质量主要表现为 ESM存活力及增殖能力), LP-TX、 LP-LP、 AL-TX三种组合培养基更适宜于长叶松
胚性组织的诱导 。
表 2　家系 、 培养基及激素组合对 EMS诱导率的方差分析
Table2　VarianceanalysisofESMinitiationratewithfamiliesandcombinationsofmediaandhormone
离差来源 自由度 离差平方和 均方差 均方比 (F) Fa
家系 C 4 412.2 103.2 1.98 F0.05 (4, 60) =2.53
处理 15 4861.0 324.1 6.23＊＊ F0.05 (15, 60) =1.84
基本培养基A 3 2769.0 923.0 17.75＊＊
激素组合 B 3 1110.4 370.1 7.12＊＊ F0.05 (3, 60) =2.76
A×B 9 982.3 109.1 2.10＊ F0.05 (9, 60) =2.04
误差 60 3122.0 52.0
总和 79 8396.0
3　结语与讨论
体细胞胚胎发生植株再生技术是植物组织培养快速繁殖的一个重要 、 有效的途径 , 它以其繁殖系数
高 、周期短 、结构完整等优点而被广泛采用 [ 19] 。
长叶松不同家系间体细胞胚诱导率不存在显著差异 , 这一结果是否表明长叶松外植体基因型对 ESM
诱导率没有显著的影响效果 , 还有待于进一步扩大参试外植体基因型的范围。
外植体种类及生理状态和发育程度直接影响体细胞胚的发生[ 20] , 外植体生理代谢旺盛而分化程度较
低的组织有利于体细胞胚的诱导 [ 21] 。目前松属体胚发生外植体仍然限制于未成熟合子胚 , 且合子胚的发
育阶段是体胚诱导成功的关键 。长叶松 5个家系均在 7月 16日和 7月 24日 2个采收期即合子胚的发育第
1、 2阶段获得较高的诱导率。通过改良培养条件打破外植体种类及生理状态限制是长叶松体胚诱导研究
的方向 。
Lambardi认为落叶松体胚发生中 , 产生非胚性愈伤组织的外植体上不可能再诱导出胚性组织[ 15] , 但
本试验观察到 ESM组织与非胚性愈伤组织发生在同一个外植体上 , 初步推断可能与所选用的培养基及浓
度组合不同有关 。
基本培养基 、植物激素对诱导体细胞胚胎发生起着重要的作用[ 22] , 优化基本培养基及激素种类与浓
度组合能大大提高 ESM的诱导率。在长叶松的体胚诱导中 , LP是首选的基本培养基 , 在添加 LP(NAA
2.0mg·L-1 +6-BA0.63mg·L-1 +KT0.61mg·L-1)和 TX(2 , 4-D2.2 mg·L-1 +6-BA1.0 mg·
L-1)专利培养基激素组合的培养基 , 其体胚诱导率显著提高 , 可见生长素 2, 4-D或 NAA的添加有助于
促进了体胚的诱导。
46 福　建　林　学　院　学　报 第 28卷　
体胚的发育和成熟是体胚发生植株再生技术的关键 。除筛选体胚成熟培养基外 , 通过 ABA、 PEG、 麦
芽糖等外源物质来调控体细胞成熟 、完善成熟胚发芽生根同步化体系 , 提高体胚成苗率是今后研究的重点。
致谢:本试验得到美国弗吉尼亚理工学院与州立大学自然资源学院林学系 UlrikaEgersdocter, BaryFlinn
教授的指导及研究生 AlejandraLara的支持与配合 , 在此一并致谢。
参考文献
[ 1] LiaoYK, AmersonHV.Slashpinesomaticembryogenesis:Initiationofembryogenesisfromimmaturezygoticembryos[ J] .
NewForests, 1995, 10:145-163.
[ 2] 廖宇赓.台湾云杉 (PiceamorisonicolaHay.)体胚发生与植株再生 [ J] .中华林学季刊 , 1999, 32 (2):161-170.
[ 3] HakmanI, FowkeLC, VonArnoldS.Thedevelopmentofsomaticembryosintissueculturesinitiatedfromimmatureembryosof
Piceaabies[ J] .PlantSci, 1985, 38:53-59.
[ 4] LiaoYK, AmersonHV.Slashpinesomaticembryogenesis:Maturationofsomaticembryosandplantregeneration[ J] .New
Forest, 1995, 10:165-182.
[ 5] TangW, OuyangF, GuoZC.Plantregenerationthroughorganogenesisfromcallusinducedfrommaturezygoticembryosofloblol-
lypine[ J] .PlantCellReports, 1998, 17:557-660.
[ 6] NagmaniR, DinerAM, SharmaGC, etal.Somaticembryogenesisinlongleafpine[ J] .CanJForRes, 1993, 23:873 -
876.
[ 7] SommerHE, BrownCL, KormanikPP.Differentiationofplantletsinlongleafpine[ J] .BotanicalGazete, 1975, 136 (2):
196-200.
[ 8] PulmanGS, JohnsonS, PeterG, etal.Improvingloblollypinesomaticembryomaturation:Comparisonofsomaticandzygotic
embryomorphology, germinationandgeneexpression[ J] .CellBiologyandMorphogenesis, 2003, 21:747-758.
[ 9] KvaalenH, DaehlenOG, RognstadAT.SomaticembryogenesisforplantproductionofAbieslasiocarpa[ J] .CanJForRes,
2005, 35:1 053-1 060.
[ 10] PulmanGS, JohnsonS, TasselSV, etal.SomaticembryogenesisinloblollypineandDouglasfir:Improvingcultureinitiation
andgrowthwithMESPHbuffer, biotinandfolicacid[ J] .PlantCelTissueandOrganCulture, 2005, 80:91-103.
[ 11] SmithDR.Growthmedium:US, 5565355 [ P] .1996-10-15.
[ 12] LambardiM.SomaticEmbryogenesisinCypress[ M] ∥JainSM, GuptaPK, NewtonRJ.SomaticEmbryogenesisinWoody
Plants.Dordrecht:KluwerAcademicpublishers, 1995, 6:553-568.
[ 13] BecwarMR, NagmaniR, WannSR, etal.Initiationofembryogenicculturesandsomaticembryodevelopmentinloblollypine
[ J] .CanJForRes, 1990, 20:810-817.
[ 14] DavidA, LaineE, DavidH.SomticEmbryogenesisinPinuscaribaea[ M] ∥JainSM, GuptaPK, NewtonRJ.SomaticEm-
bryogenesisinWoodyPlants.Dordrecht:KluwerAcademicpublishers, 1995, 3:145-181.
[ 15] JainSM, GuptaPK.ProtocolofSomaticEmbryogenesisinWoodyPlants[ M] .Dordrecht:KluwerAcademicPublishers,
2005:76-83.
[ 16] PullmanGS, MeinJ, JohnsonS, etal.Gibberelininhibitorsimproveembryogenictissueinitiationinconifers[ J] .PlantCell
Reports, 2005, 23:596-605.
[ 17] 唐巍 , 欧阳藩.湿地松体细胞胚胎发生和植株再生 [ J] .植物资源与环境 , 1997, 6 (2):8-11.
[ 18] DuncanDR, WilliamsME, ZehrBE, etal.Theproductionofcalluscapableofplantregenerationfromimmatureembryosof
numerousZeamaysgenotypes[ J] .Planta, 1995, 165:322-332.
[ 19] 胡适宜.裸子植物胚胎学 [ M] .北京:高等教育出版社 , 1982:237-247.
[ 20] MotRL, AmersonHV, FramptonJ.Annualprogressreport:Specialprojectontissueculture[ J] .AgricultureResearch
Service, 1987:145.
[ 21] 崔凯荣 , 陈克明 , 王晓哲 , 等.植物体细胞胚发生研究的某些现状 [ J] .植物学通报 , 1993, 10 (3):14-20.
[ 22] 袁澍 , 贾勇炯 , 林宏辉.诱导植物体细胞胚发生的几个生理因素 [ J] .植物生理学通讯 , 2003, 39 (5):508-512.
(责任编辑:卢凤美)　　
47　第 1期 吴丽君:长叶松优良家系的体胚发生研究