全 文 ：植 物 掌 报 1 98 9, 3 1 ( 5 ) : 3 6 1一 3 6 6
滋时 a B o t o n fe 口 iS n re a
欧当归原生质体培养中体细胞胚胎
发生和细胞学变化
贾敬芬 石继红 王毓美 张世瑜
( 兰州大学细胞生物学研究室 ,兰州 7 30 00 0
摘 要
从继代培养的欧当归 ( L 。 。 i了` i: r` m o了f i c i ” a l o K o e h ) 愈伤组织分离的原生 质 体在 c s l v
培养基中培养 ,得到了较高频率的持续分裂 。 形成的细胞团转移到固体培养基上后 , 发展成了
白色松软型的愈伤组织 。 将其转移到附加 6 一节氨基凛吟和叫噪丁酸的 N 6 培养基上继续培养
了 2一 3 个月后 , 表面出现了浅黄色 、 颗粒状的胚性愈伤组织 。 后者在附加叫嗓丁酸和蔡乙酸
的 M s 培养基上培养 , 可通过体细胞胚胎发生途 径分化出大量小植株 。 对供体愈伤组织和原
生质体再生植株进行了细胞学观察 。
关键词 欧当归 ; 原生质体培养 ; 体细胞胚胎发生 ;植株再生 ;核学变化
欧当归又名拉维纪草 ( l o v ag e ) , 是伞形花科一种多年生药用草术植物 1I] 。 用欧当归
茎切段和叶切块进行组织培养已获得再生植株 〔刃 , 而原生质体培养方面的工作国内外 尚
未见棍道 。 然而最近有人尝试用欧当归叶肉原生质体作为一个亲本 , 与芹菜原生质体进
行融 兮试验 , 目的是想将欧当归的抗晚疫病 ( l a et bl i g ht ) 特性转移到芹菜中去 [’1 , 但 尚
未取得成功 。 本文就欧当归愈伤组织原生质体的分离 、 培养 、 并进一步诱导体细胞胚胎发
生和值株再生的条件进行了研究 , 并对供体组织和原生质体再生植株进行了细胞核和染
色体变异情况的观察比较 。
材 料 和 方 法
(一 ) 供体材料和原生质体的分离
用继代培养两年之久的欧当归 (乙。 ,行 ; i : “ m 时f i `动 。 份 K o c h) 茎切段愈伤组织作为
份离原生质体的材料 。 供体愈伤组织在加有 1 . (j m g / 1 2 , 4 一 D 的 M S培养基 〔10J 上每 月转移
一次。 取转移后生长 7一 10 天的讼软愈伤组织放在酶液中 。 一酶液的组成为 : 1 . 0务 (W /
丫 ) 纤维素酶 ( O n o z u k a R 一 10 ) , 1 . 0沁果胶酶 ( s e r v a ) , 0 . 2务崩溃酶 ( d r i s e j a s e , F lu k 。 ) ,
司 · 3 8m o l八 葡 萄 糖 , o . o s m o l八 C a C I, · ZH ZO 和 0 . 1多 2一 N 一吗 琳 乙 烷 磺 酸 (M 形S ) ,
p H 头 8一 .6 2。 在室温 ( 20 ℃ )下静置 12 一 14 小时 , 收集前在振荡器上振荡 ( 7 0r pm ) 30 分
钟 。 酶解液用 74 那m 孔径的不锈钢筛过滤 , 除去未充分酶解 的组织 。 加人等体积的 。 . 16
本文于 l , 8 8 年 , 月收到 , l , 8 8 年 “ 月收到修改搞。
植 物 学 报 31 卷
裹 1 欧当归原生质体培养过程中培养基的种类和组成 ( m g / ) l
Ta b le 1
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0 ff矛c i , a l o K o e h ) P r o t o P l a s t c u l t u r e ( m g / l )谈 原生质体 起始分裂 诱导愈伤组织的培养基 , 胚状体发生和植株再生主江 二盏全 澡仁 T II 培养基 , l r x似 e Q l u m I o r I n 生兀l a t l n g M e d iu m 〔 o r i n d u c i n g M e d i u m f o r e m l、 r y o g e -P r o t o P l a s t (l i v i s i o n e m b r y o g e n i c ` a l l i n e s i s a n d P l a n t l e 仁I II r e g e n e r a t i o n 111基本培养基 C s l V [ 7 1 N 6〔 , , M S L l o 〕B a ` i c m e d i u m渗透剂 葡 萄 糖 蔗 精 蔗 精
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水解酩蛋白 水解酩蛋白 水解酩蛋白
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8一 6 . 2 ) , 以 6 0 0转 /分的速度离心 , 分钟左右 。 然后吸出上清 `
液 ,将下沉的原生质体悬浮在 12 多 蔗糖溶液 ( p H 5 . 8一 6 . 约中 ,再用同样速度离心 3一 5分 -
钟 。 收集漂浮在蔗糖溶液上层的纯净原生质体 , 再用 C a cl Z · ZH ZO 溶液洗涤 2 次 , 离心 ·
收集 。
(二 ) 原生质体的培养
将收集的原生质体以 1 , 0 x l护 Zm l 的培养密度悬浮在培养基 (I 表 l) 中 , 放在 25 ℃ :
士 2℃ , 黑暗或弱光条件下静置培养 。 大约在培养后两周左右 , 细胞团形成以后 , 加人等
体积 、 渗透剂减少一半的新鲜培养基 , 并将培养物分装 , 仍保持浅层培养状态 。 当形成肉」
眼可见的大细胞团后 ,将培养物转移到不含葡萄糖 , 而含 3 多 蔗糖 , 并加 0 . 4另琼脂粉的
培养基 I 上 , 作进一步培养 。
(三 ) 胚性愈伤组织的诱导及植株再生
将在上述培养基上发展起来的松软型愈伤组织转移到培养基 1 (表 1) 上 , 并置于每
天 12 小时 、 1 5 0 0] x 光照的植物生长箱中 , 白天温度为 2 5℃ 士 l℃ , 夜间为 巧℃ 土 1℃ 。 每
月转移一次 ,并挑选胚性愈伤组织 , 加以扩大培养 。
增殖后的胚性愈伤组织转移到培养基 川 (表 l) 上 , 在同样环境条 件下培养 , 并观察
呸状体的形成和小植株的分化 。
贾敬芬等 :欧当归原生质体培养中体细胞胚胎发生和细胞学变化
( 四 )细胞学观察
对供体愈伤组织和原生质体再生的小植株根尖进行了细胞学检查 。 材料用饱和对二
氯苯处理 4小时 , 用酒精一醋酸 ( 3 : l) 固定 , s m ol / l 盐酸水解 , 改良卡宝品红染色【9J 。 用压
片法制片 , 进行细胞核形态观察和染色体数 目检查 。
结 果 和 讨 论
(一 ) 原生质体分裂和愈伤组织的形成
继代培养两年多的欧当归愈伤组织已经十分松软 , 很容易分离出大量原生质体。 新
分离的原生质 沐 (图版 I , l) 大小有差异 ,镜检时可看到明显的胞质环流现象 。 培养 24 小
时后 , 体积已有所增大 。 48 小时后 , 已有相当一部分原生质体变成椭圆形 。 培养 3 天后 , .
开始出现第一次分裂 (图版 I , 2 ) , 然而大量进人第一次分裂的时间是在培养的第 5一 6夭 ,
10 天左右已形成小细胞团 (图版 I , 3 ) 。 在附加 1 . o m g / 1 2 , 斗一 D 和 .0 2 m g / ] 激动素 的
c 8 Iv 7)I 液体培养基 , 即培养基 I 中作浅层培养 , 分裂能持续进行。 在两周左右 , 即形成几
十个细胞组成的小细胞团 (图版 I , 4 ) 。 在最好的条件下 , 原生质体再生细胞的分裂频率
可达 50 界 以上 。 这主要取决于供体材料的生长状态 。 只有那些旺盛分裂的分生状态细胞
占优势的愈伤组织 , 才可得到较 高的原生质体产率 , 较多的 、液泡化程度小的小型原生质
体 , 并产生较高的分裂频率 。 培养半个月后 , 补加葡萄糖浓度减半 (即 0 . 19 m o l / l) 的新鲜
培养基 , 并将培养物分装 , 仍保持浅层培养状态 , 可以使细胞团的增殖持续下去 , 并可在两
周内发展到肉眼可见的大细胞团。 这时 , 若能适时地将其转移到含 7茄蔗糖 , 并用 0 . 4 %
琼脂粉固化的培养基 I 上 , 再继续培养 20 多天 , 它们就可以发展成直径 cI m 大小的白色
松软型愈伤组织 。
(二 ) 胚性愈伤组织的诱导
原生质体再生细胞分裂形成的 白色松软型愈伤组织主要是由排列松散的 , 形态 、 大小
不均一的细胞组成 , 外观也无一定形态 。 这种类型的愈伤组织很难诱导形态分化 。 我们
曾用 M S〔10J 和 N 6团 培养基 , 作了数十种激素组合处理 , 从未出现过器官分化 。 然而在多
次实验中发现 , 这种愈伤组织在培养基 H (表 l) 上转代培养了 2一 3 个月后 , 有相当数量
的愈伤组织表面 出现了浅黄色 、 颗粒状的愈伤组织 , 它们是由紧密排列的 、 近乎圆球形的
小细胞组成 。 在培养过程中 ,将这种类型的愈伤组织随时挑选出来 ,在同样类型的新培养
基上扩大培养 , 得到了大量 的均匀一致的胚性愈伤组织 (图版 I , 5 ) , 它们具有较强的体细
胞胚 胎发生能力 , 其内常出现早期胚状体结构 ,再分化成苗的潜力能长期保持 。
(三 ) 胚状体的分化和植株再生
上述胚性愈伤组织转移到培养基 1 (表 1) 上继续在同样生长条件下培养 , 大约 3 周
以后 , 就分化出了大量胚状体 , 并可看到胚状体发育的各个阶段 (图版 I , 6一 10 ) 。 继续转
移到新培养基上 , 再经半个月左右 , 便可长成小植株 (图版 I , 1 1 ) 。 胚状体发生和小植株
再生的条件和欧当归组织培养中出现的情况极为相似 `刀。 可见 , 只要条件适当 , 欧当归胚
性愈伤组织的体细胞胚胎发生能力能稳定地长期保持 。 分化成小植株的能力已保持了三
年之久 。
通过体细胞胚胎发生途径再生的欧当归小植株虽然枝 、 叶比较茂盛 , 但根系很不发
3 6 4植 色物 学 报 1 3云
达 , 移栽到土壤上仍有困难 。 将其移植到含 1一 s m g / 1赤霉素 的 M S 培养基上 , 可以使苗
长高到 3一 s c m (图版 I , 12 ) ,但根进一步发展的条件尚需作进一步研究 。
( 四 ) 细胞学研究
细胞核形态和染色体数检查表明 , 供体愈伤组织的细胞存在着明显的核学变异 。 观
察到具有双核 、 多核的细胞 (图版 1 , 1 , 2 , 3 ) 。 还可看到染色质穿壁 (图版 H , 斗) 、 无丝分
裂 (图版 H , 5 ) 、 落后染色体 (图版 H , 6) 、染色体桥 (图版 H , 7 )和多极分裂 (图版 H , s) 等
现象 。染色体数 目变化范围也很大 。 在所观察的 2 87 个中期分裂相细胞中 , 其染色休数 目
分布情况如表 2所示 , 二倍体 ( 2n ~ 2 2 ) 细胞 (图版 H , 9 ) 为 1 29 个 , 只占 4 4 . 95 并 , 而染
色体数 目异常的细胞却占 50 % 以上 (图版 1 , 10 一 1 2 ) 。 供体愈伤组织细胞出现这些 异
常染色体数的原因是显而易见的 , 因为该种组织已经继代了两年多 , 而且是在含 2 , 斗一 D
的培养基上维持的。 长期继代培养 , 以及外源激素 ,尤其是 2 , 4一 D 的作用 , 常常会引起染
色体倍数的增加以及非整倍体化 s[, n ,。
表 2 供体愈伤组织染色体数 目变化
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株再生小植株的根尖作了染色体倍性观察 , 发现大部分植株都存在一定程度的混倍现象。
如表 3 所示 , 在检查的 6 31 个中期分裂相细胞中 , 二倍体 ( 2n 一 2 ) 的细胞为 4 “ 个 , 占
73
.
85 多 , 染色体数 目改变的细胞 , 包括亚二倍体 、三倍体 、 多倍体和非整倍体等所占的比
例要比供体愈伤组织中的少得多 , 而且 它们对体细胞胚胎发生潜力的影响也很小 。 再生
植株中这种染色体数变化程度的降低可能说明了这样一个事实 , 即只有那些二倍体细胞
占优势的胚性愈伤组织才能分化成胚状体 , 并进一步发展成植株。 我们的实验结果也说
弓期 贾敬芬等 :欧当归原生质体塔养中体细胞胚胎发生和细胞学变化 36 5
明 , 在特定的培养条件下 , 培养基成分 ,尤其是合适的生长调节物质 , 可能对染色体倍数具
育选择效应 〔们。 欧当归原生质体产生的愈伤组织在恢复了胚胎发生能力后 , 也伴随着整
倍性 (尤其是二倍体 )增加的趋势 。 类似情况在其它植物中也曾有过报道 31[ 。
[ I ]
[ 2 ]
[ 3 〕
{: }
参 考 文 献
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乡 6` 植 物 学 报 乡t 卷
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L。夕i了t i c 、 。 Oj j i c i、 a l e K o e h ; P r ot o Pl a s r e u l t u r e ; S o m e t i e e m b r y o g o n e s is :
P l a n t l e t r e g e n e r a t i o n ; k a r y o l o g i e a l v a r i a t i o n
图 版 说 明
图 版 I
.l 从欧当归愈伤组织新分离的原生质体。 义 40 0 2 .原生质体再生细胞的第一 次分裂 。 又 4叻 了. 从 单个原生 质体起
源的小细胞团。 只 40 0 4 .从单个原生质体发展来的大细胞团 。 丫钧 。 5 .从原生质体再生愈 伤组织来的胚性 愈伤组
织 。 又 。 , 8 6一 DI . 从胚性愈伤组织分化的体细胞胚 。 .6 球形胚 。 火 1。 ; .7 心形胚 。 又 10 ; .8 鱼雷形胚 。 火 1。; .9 次
级胚状休 。 丫 , ; 10 .子叶形胚 。 义 5 1 1、 卫2 .从体细胞胚发展来的小植株。 丫 。 . 8
图 版 I I
l一 8 .原生质体供体愈伤组织中所看到的核形态变异 :
丝分裂 ; 6 .落后染色体 ; 7 . 染色体桥 ; 8 . 多极分裂 。
( Z
n “ 2 2〕。 1 0、 1 1 , 亚四倍体 (数目不同 ) 。 12 .多倍体 。
1
.双核 ; 2 . 多核 : 3 , 具多核的细胞团 ; 4 . 染色质穿壁 ; 弓. 无
9 、 1 0
. 供体愈 伤组织中看到的染色 体 数 目变 化 。 9 . 二倍体
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