全 文 ：山西大学学报 (自然科学版 ) 2 4 ( 2 ) : 1 8 8一 1 9 5 , 1 9 9 1
J o u r n a l o f s五a n 工 1 U n i v e r s主t y ( N a t . 乏e i 。 E d 。 )
欧当归原生质体再生植株 ’
郭双生 李宝平 * * 郝建平
周 小梅 张江涛
(生物系)
摘要 从继代后 3一 5天的欧当归幼叶胚性细胞悬浮系游离的原生质体 ,分别以 K M S P 、 M S 、 改
良M S、 N T 、 D Z 、 D P D 及B S为基本培养基进行浅层液体培养 , 以改良M S 进行平板培养和固
液双层培养 . 在激素组合和浓度 (2 . 4一D O . Zm g l/ , K T O . 5也 g / 1, N A A I . om盯l) 及 渗 透
稳定刘 ( o . SM甘露醇 ) 相同的条件下 , 在K M SP中的植板率 (40 % ) 显著高于其它 培 养基
中的植板率 (0 一15 % ) . 在 K M S P中 (0 . 35 M葡萄糖作渗透稳定剂 ) , 不同激素组 合 及浓
度植板率不根同 , 土述激素组合中最高 (和% ) . 葡萄搪作渗透稳定剂时 .0 3 M优于。 . 4M , 同
时优于相同浓度的甘鲜醇和蔗糖 . 改良M s浅层培养和双层培养植板率几乎相 同 ( 1 5 % ) ,
而平板培养很低 ( 1% ) . 在 K M 8p 中 (激素同上 , o · 35 M葡萄糖 , C H Z , 0哪 Z玉, C M l o m l
1/ )
,
2 5天后原生质体形成肉眼可见的小愈伤组织 . 及时转移到固体愈伤组织增殖培养基上 ,
诱导出胚性和非胚性两种愈伤组织 , 分别转移到分化培养基上后 , 两者分别通过体细 胞胚胎
发生和器官发生途径获得了完整再生植株 .
关扭词 欧当归 , 原生质体培养 , 体细胞胚胎发生 , 植株再生
欧当归 ( L e 。 `s t`e o m o f f ` c `n a l。 K o e h ) , 又 口L}保当归 、 圆叶当归 , 为伞形科欧当归
属一种多年生草本植物 , 以根入药 , 有活血 、 通经 、 利尿等作用 , 在国外作芳香矫味 、
健胃药和香料 . 其根部所含挥发油主要成分与中国当归相似 , 均系莫本内醋 l( ig su it l -
i d e )
, 其含量分别约占35 %和 45 % , 药理作 用也有相似之处 . 原产于法国和南斯 拉 夫
等欧洲国家 , 我国华北地区有引种栽培 〔 1〕 .
张世瑜〔 6〕用欧当归茎切段和叶切块进行组织培养获得再生植株 , 贾 敬 芬 等〔7〕用从
茎切段愈伤组织游离的原生质体通过体细胞胚胎发生获得再生植株 . 木文报道从欧当归
幼叶胚性细胞悬浮系游离原生质体并通过体细胞胚胎发生和器官发生途径再生完整植株
的研究结果 . 试图通过原生质休培养筛选高药物含量的突变品系 , 并为利用遗传工程技
术对药 用欧当归进行品质改良以及利用体细胞杂交技术将其抗晚疫病特性转 移 到 马 铃
· 山西省自然科学基金资助
。 . 现在运城高级专科学校工作
收稿日期 : 1 9 9 0 . 1 0 . 1 2
2期 郭双生等 欧当归原生质体再生植株
薯 、 芹菜等蔬菜作物中奠定基础 .
1 材料与方法
1
.
1 植物材料 欧当归 ( L e v i s t i c u o o j f i e ` n a l o k o e h . ) 种子播于花盆中 , 在温室中谬i
发 、 生长 (光照 5 0 0 0~ 2 5 0 0 0 L x u , 每日照光 10 h , 温度 1 5~ 3 0 oC , 相对湿度 7 5 士 5% ) .
1
.
2 胚性细胞瓜浮系的渝立 从 30 ~ 40 d苗龄的欧当归植株上取幼叶用自来水冲 洗 , 再
用 O。 1%升汞灭菌 10 m i n 。 在无菌条件下将幼叶切成约 O。 sc m Z的小块接种到含有 2 . Om g
/ 12
.
4一 D , o
.
s m g / 1 K T
, 3
。
o%蔗糖 , 0 , 7 5%琼脂的 M S 固体培养基上 ( p H S 。 8 ) , 在
20 0 0 L u x
, 2 5士 2℃条件下培养 . 待愈伤组织直径达 s m m左右时 , 转移到含 1 . o m g l/ 2 , 4
一 D , 。 . 4m g l/ 6一 B A , 3 . 0%蔗糖 , 0 . 75 %琼脂的 M S培养基上继代培养 , 两 周 继 代一
次 , 培养条件同上 。 继代 3个月之后 , 诱导出大量胚性愈伤组织及胚状体 . 挑选乳黄色
的胚性愈伤组织于附加 2 . Om g l/ N A A , 0 . 4 m g l/ 6一 B A , 25 o m g l/ 水解乳蛋白 , 1 0 m g
l/ L
一精氨酸及 3 . 0%蔗糖的 M s液体培养基中悬浮振荡培养 . 散 射 光 , 2 5 士 1℃ , 每周
继代一次 , 10 个月后形成生长快 、 分散性好的胚性细胞悬浮系 .
1
.
3 原生质休的分离和纯化 取转代后 3~ d5 的悬浮培养物放入 10 倍于其体积的酶液中
游离原生质体 . 酶液成分为 : 2 . 。%纤维素酶 ( O n oz u k a R一 1 0) , 。 . 5%离析酶 (M a -
e e r o z y m e R一 1 0 ) 0 。 1%离析软化酶 ( P e e t o l y a s e Y一 2 3 ) , 0 . 5%葡聚糖硫酸钾 (含硫
量 15 % ) , 由 C P W一 l s M (含 15%甘露醇 ) 溶液〔 9〕配制而成 ( p H S . s ) . 酶液用 0 . 4 5
拜m的微孔滤膜抽滤灭菌 . 黑暗静置酶解 , 温度 25 士 1℃ , 酶解期间轻轻摇动 3~ 4次 .
酶解 10 h 后 , 轻轻晃动培养瓶几分钟 , 使原生质体尽量释放于酶解液中 . 在无菌条
件下 , 酶解混合物用3 0 目尼龙网过滤 , 通过离心沉淀法 ( 4 0 0~ 6 o o r / m , s m i n) 收集
原生质体 , 以 C PW一 13 M溶液洗两遍 , 原生质体培养液洗一遍 . 最后用原生质体 培 养
基稀释成 5 又 10 4个 /m l密度的原生质体悬浮液 .
1
.
4 原生质体培养 原生质体培养主要采用液体浅层培养法 , 同时也用平板培养法和固
液双层培培法 . 液体浅层培养即吸 l m l原生质体悬浮液置于玻璃培养皿中 (郝 . sc m ) ,
用 P a r af il m封口 , 置于 25 士 1℃ 、 暗中或散射光处 ( 5 0 L u x) 静置培养 , 用倒置显微镜
观察原生质体的生长发育过程 . 每周加渗透压减半的培养基 1 次 , 待大细胞团出现后则
加没有渗透稳定剂而附加 3 . 0%蔗糖的培养基 , 每次加液 0 . 1~ o . 3 m l , 平板培养时先将
原生质体以高于液休培养密度 1倍的 量 悬 浮 于 改 良 M S ( C a CI 。 ZH : 0 1。。。m g l/ ,
N H
`
N O
。
50 Om g I/
, 其它同 M )S 液体培养基 , 迅速加入等体积融化了的含 0 . 6% 低融
点琼脂糖的同样培养基 ( 3 0℃左右 ) , 将两者混匀 ( 最终含 0 . 3%低融点琼脂 搪 ) 倒 入
培养皿中 , 冷却固化后用 P ar af il m封口 , 置于同样条件下培养 ; 固液双层培养 即 在 培
养皿中先铺一层改良M S固体培养基 ( 0 . 6%琼脂糖 ) , 然后将 l m l改 良M S原生质体悬浮
液接种于上面 , 方法同液体浅层法 . 原生质体培养基为 M S 、 改良M S 、 D Z、 D P D 、 N T 、
B S
、
K M S P
、
(铁盐为M S铁盐 , 去掉V A和 V 3D ) 7 种培养基 。
定期镜检培养物并统计植板率 , 每个试验均重复 3 次以上 .
1
.
5 愈仿组织的增殖 待小愈伤组织发育到 工m m 大小时从液体和双层培养基中将大 部
山 西 大 学 举 报 ( 自然科学版 ) 1 4卷
分液体培养基用吸管吸出 , 剩余少部分液体培养基和愈伤组织一同转入 M S 固休培养基
( M S为基本培养基 , 附加物相同 : C H 25 Om g l/ , C M 50 m l/ l , 蔗糖 3% , 琼脂粉。 . 48 % ,
p H S
.
8 , 激素成分不同见表 4 中 C z~ C 4 ) , 光照 5 0 0~ l 0 0 0 L u x , 温度 2 5 士 2℃ , 继续
诱导生长 (固体培养未获得愈伤组织 ) .
1
.
6 胚状体及芽的韶导 待上述诱导的胚性和非胚性愈伤组织直径达 3一 sm m 时分别接
种到 4种分化培养基上 (M S为基本培养基 , 附加物相伺 : C H g3 l/ , 蔗 糖 3% , 琼脂
0
.
7 5%
, p H S
.
s , 激素成分不同参看表 5 中D l ~ D 4 ) , 在光照 2 5 0 0~ 2 0 0托适x , 温度
2 5 士 2℃条件下进行胚状体及芽的诱导 .
1
.
7 植株再生 将胚状体转入 M S O (无激素 ) 诱导小植株再生 . 待分化培养 基 中 的穿
长里 1一 cZ m高时从愈伤组织上剥离下来转入 M S培养基 ( N A A o . s m g l/ 、 BI A O. l m : / l)
诱导生根 (培养条件同上 ) 。
2 结果与讨论
2
.
1 原生质体的分离 从悬浮细胞或小细胞团刚分离的原生质体一般呈圆球形 , 大小之
间有差异 , 多数细胞质较浓 , 内含物丰富 (图 1 ) , 有的还可看到细胞核 , 镜检时可看
到明显的胞质环流现象 .
原生质体再生细胞能否分裂和发育与用于游离原生质体的材料来源及生理特性密切
相关 . 我们选用高比例胚性细胞团的悬浮培养物 , 它们是由紧密排列的近乎圆球形小细
胞组成 , 这些细胞团具有较强的分裂和发育能力 , 为获得较高频率的细胞分裂及进一步
发育打下了基础 。
用悬浮培养细胞或愈伤组织作材料时 , 要得到理想的结果 , 材料需要经常转移 。 我
们选用的材料每周继代一次 , 取转代后 3一 5d 的悬浮物进行游离 , 得到的原生质体数量
多 、 杂质少 、 内含物丰富 , 原生质体易裂且分裂频率高 ; 取继代培养 1d0 的材料进行游
离 , 所得原生质体数量少 、 杂质多 、 内含物稀少 、 细胞大小不均一 、 分裂较难 。 显然 ,
这是由于继代培养时间不同 , 细胞壁成分及原生质体的生理状态不同所致 . 李忠谊等〔5〕
和 B h oj w a in 〔“ 〕分别在石防风 、 棉花的原生质体游离中得到类似结果 .
2
.
2 再生细胞的分裂及幼小愈仿组织的形成 在合适的培养基中 (表 1 , M 4 , O . 35 M葡
萄糖作渗透稳定剂 ) , 培养 2 4 h后开始膨大伸长 , 再生新壁成椭圆形成卵 圆 形 , 48 h 后
再生细胞进行第 1次分裂 ( 图2) , d5 后出现 2裂 ( 图 3 ) 。 细胞分裂大致有 3 种情况 :
均等分裂 、 大致均等和不等分裂 . 少数原生质体有出芽现象 . 我们注意到体积小 、 细胞
质浓的原生质体容易进行细胞分裂 , 体积大 、 液泡化程度高的原生质体只发生膨大而不
分裂 , 有的呈哑铃状 , 有的伸长为管状 , 个别的可形成巨大细胞 . 培养 1周后部分原生
质体集聚在一起 , 并有褐化现象 . 培养 2 周后可形成约30 个细胞的细胞团 (图 4 ) , 此
时如不加液褐化严重 , 最终导致死亡 . 若每周加入合适的细胞培养液 1次 , 经过 25 d 培
养可形成肉眼可见的幼小愈伤组织 (图 5 ) .
1) 激素对原生质体分裂频率的影响
表 1 中M l一M 4均以 K M S P为基木培养基附加不同组合和浓度的激素 , 以葡萄糖作
2期 郭双生等 欧当匆原生质林再毕植株 ,
刹 擞 万对 康 生 成 体 分 级 粼 率 的 形 晌
培 养 基 序 号 M 1 M 2
一价臼班万寸一扮渗 , 稳定 , ( , 萄糖 ) …。 . 3 5 M }。 . 4 oM 、 1o . 3 5M …。 . 4 o M …。 . 3 5 M 1o . 4 o M } 0· 。 , 10 . ` 。 M下端器洲器决济箭; 爪侣擂仁
;黔粼诊淤攀
即不同渗透碑定荆对原生质休分裂频率的影响 ’ ; 一丁 、
以 K M S P为基本培养基附加相同的激素 住 , 4一 D o . Zm g l/ 、 K T o . 乒。 g l/ 、 N A 人
1
.
o m沙l) 而附加物 《CH 12 5 m g 1/ 、 c M 10 m l 1/ , p H S . 8 ) , 用甘露醇 、 _蔗搪、 葡萄搪
作渗透稳定剂 , 甘露醇有 3个浓度处理 , 其它均为 2个浓度处理 . 从表 2中可知0 .砧 M 葡
萄搪作渗透稳定剂效果最好 , 、赦雾醇浓魔较低时不利于再生细胞分裂 , 2 个浓度处理的
蔗糖作渗透稳定荆均不适合原生质体培养 。
表2 不同移扭推定鹅对旅生成体分狡撅率的形晌
葡 萄 精
渗透稳定剂 。 . ’ 3 5M
}
。 . 4 oM
2
。
0
分裂频率 ( % ) 50 。 0 } 37 。 5
一飞幻n甘,曰
蔗ǔ弘
:0M.0T八甘6jJ.占比J孟ōU
醇
||M
:5
露40335
n
甘
口以冉日nJó口目廿八“ù ùO曰。口
一óU一
一裂培养天数
一
3 )不同培养基对原生质体分裂频率的影响
表 s 中M S一M l i的激素 ( 2 , 4一D o . Zm g / l 、 K T o . s m g / 1、 N A A i 。 o m g / 1) , 附加
物 `(蔗糖29 l/ ) 和渗透稳定荆 (音露醇。 . SM ) 均相询 ( p H S . 8 ) . 从表亏可知 秘序培 养
基中分奥新率最低 , 改良M s中的分裂频率显著提高 . 说明适当提 高 c , 浓 度 , 降低
N H ;浓度对原生质体培养是有益的 . M 7.- M l 中培养情况均不相同 , 几 证的不伺堵养基
19 2 山 百 大 举 学 报 (自然料学依 ) 1 4卷
的无机和有机成分对辰类质体培养产李了影响 , K娜 P抉拱它简单培养基对原生质体分
裂频率有很好的效果 , 说胡丰富的有机成分对原生质体培养是有利的 .
裹 3 不同培养` 对耳生质体分琪狱率的形晌
培养基序号 M 7 1 M S M i o ” }
`
M l i
基本培养基
“ 裂培养天数
分裂频率 ( % )
M S 改良M S } D : D P D
…M g…二
{
7
. ’
1
1 0
·
B S } K M
4 )不同培养方法对原生质体分裂频率的影响禅改良sM为基本培养基进行浅层 、 平板 、 固液双层培养 , 结果证明浅层和双层 培
养区别不大卜分裂频率均在 15 %左右 , 而平板培养植板率很低 , l平均不超过 1· o% (3 种
方法中激素 、 附加物 、 植板密度均相同 ) . 这同水飞蓟 c2 〕、 筒篙“ 〕、 新疆甜 瓜〔3〕等原
生质体培养结果正好相反 . 可能是琼脂糖的毒害作用或通气不良所致. ’
2
.
3 再生愈仿组纵的增姐友分化 将幼小愈伤组织转移到愈伤组织增殖培养基土 , 在不
同培养基上诱导情况不同 (表 4 ) . 从表 4可以看出 2 , 4一 D浓度狡高 , 有利于 胚 性 愈
伤组织的诱导 , 反之 , 则诱导出非胚性愈份组织 . 贾敬芬等〔7〕在欧当归原生质体再生愈
伤组织培养中雨加 BI A 、 ’ 6一 B A诱导出胚性愈伤组织 . :这种对激素的不同姿求也许是取
材部位 、 来源背景不同所致 . 一 飞
衰4 再生愈伤组妞的 . 班及分化偏况
培养基序号
激素组合和浓度
(也 g / L )
2
,
4一 D
Z T
-
N A A
2
,
4一 D
K T
N A A
2
,
4一D
Z T
N A A
2
一 4一 D
6一 B A
N A A
…生长缓` , 紧密 ,分化情况 · 产褐色件育不 “ ,…非胚性愈伤组织
生长快 ,
色无定形
愈伤组织
生长较慢 , 紧密 ,
丫 J予巷粒扒 , 乳冀色 ,
有胚性愈伤组织
2
·
4 膝状体及芽的分化 将胚性和非胚性愈伤组织分别转移到分化培养基上 . (表 s ) ,
大约经过20 d后从D ,培养基中的胚性愈伤组织就可分化出大量胚状体并可看到胚状体发
育的客个阶段 (图 6一 9) 。 其它诱导情况见表 5 。
2期 郭双生等 欧当归原生质休再生植株
表 5胚状体和芽的诱导分化情况
3 1 9
培养基序号D 1D 2D3 D 4
激素组合和浓度
(也g/ L )
NA A
KT
0
。
2
2
。
0
NA A
6一B A
0
。
20
。
20
。
1
2
。
0
NA A
Z T 2
。
0
N人A
6一B A 0。 5
|钊
|
t 一
|胚状体分化情况
诱导率低 , 诱导
间约 3 0天
诱导率较低 , 诱导 {诱导率很高 诱
时间约3 0天 时间约2 0天
诱导率较高 , 诱导
时间约2 5天
…一|州|!|l
芽诱导情况 …不太正常 …正 常
} 诱导卿” { 矍些%
正 常
诱导率 81 %
玻 璃 苗
诱导率20 %
1) 从胚性愈伤组织诱导胚状体 从表 5 可以看出当N A A浓度一定 , Z T 较相同浓度
的 6 一 B A 、 K T诱导率高 , 诱导速度也较快 。 D 4中诱导效果也很好 。
2) 从非胚性愈伤组织诱导芽 从表 5可见在 D l一D 3 中芽和胚状体诱导效果具有平
行关系 , 但在 D 4 中不存在平行关系 , 而是恰好相反 . 这可能是细胞分裂素和生长素浓
度比例较低 , 不利于芽的分化。
2
.
5 植株再生 将分化出的胚状体和芽分别转移到生根培养基上 , 大约 15 天后则可诱导
出根 , 从而获得完整再生植株 (图 10 , 1 1) 。
通过体细胞胚胎发生和器官发生两种途径获得再生植株 , 大大缩短了再生周期 , 这
是同贾敬芬等〔7〕 工作的不同之处 . 再生植株与实生苗植株药用含量的测定与比较 及 品
质改良等方面的工作还有待进一步研究 .
参 考 文 献
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R o o t P r o t o p l a s t s
.
2 p f l a n z e n p五y s i o l , 1 0 5 1一 1 04 : 2 5 9~ 2 95
6453

忍期 郭双生等 欧当归原生质体再生植株 勺 招与
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肠。` S“ 叫 , 。 f f i c i a l` K o o h 。 a f t e r s “ b e u lt u r e o f 3与 d乓y s , T五e p r o tq p l a s t s
萝 e r e 仁u l势廿 r e d i乒 K M 8 p 、 ` m o d i f i ” d M S 、 N T 、 D Z 、 D p D a n d 一 B 5 1i , ” 五d _ m助
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。 r协 o n。 , ( c C p ) a’n d 、sQ nr o t王血 m s w e r合 , a m e ( 2 , 4一 D o . Zm g L一` , K T O . s m g L一 ` 、
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i n m o d i f i e d M S l iq u i d a n d 吐o u b l e l a y e r e u l t u r e s , b u t i t w a s v e r了 l o w i n
P l a t e e u l t该r e 一 I n K M S P ( C C P a s d e s e r i b l e d a b o v e , o . 3 5 M g l u e o 、 e , C H
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8 )
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.
t h e m i n i e a l l i p r o d u e e d e m b r y o g e n i e a n d n o n e m b r y o g e n i c e a l l i
.
A f t e r b e i n g t r a n s f e r e d t o d i f f e r e n t i a t i n g m e d i a
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r a t e d i
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Ke v w o r d s L e v “ 才` c “ ` o f了i。 。` “ l o K o e h . , p r o t o p l多 s t e o l t o r e , s o nr a t i e
e m b r y o g e n e s i s
, o r g a n o g e n e s i s
, p l a n t r e g e n e r a t i o n