全 文 ：第 28卷 第 2期
2009年 6月
成都大学学报(自然科学版)
JournalofChengduUniversity(NaturalScienceEdition)
Vol.28No.2
Jun.2009
文章编号:1004-5422(2009)02-0094-04
两株银杉根际土壤真菌的分离与分子鉴定
赵颖茹1 , 苟小军 2 , 颜　军2
(1.北京林业大学 生物科学与技术学院 , 北京　100083;2.成都大学 中药化学实验室 , 四川成都　610106)
摘　要:对银杉根际土壤中的真菌进行培养分离 , 得到了形态上很相似的两株真菌 F-1和 F-2.在基于形态
特征鉴定困难的情况之下 , 对真菌 F-1和 F-2的 rDNAITS区进行 PCR扩增和测序.真菌 F-1和 F-2的
ITS序列与来自于 10个属 30个种的不同真菌的 ITS序列进行序列比较和系统发育分析 , 结果表明:真菌 F-1
属于木霉属(Trichoderma),真菌 F-2属于被孢霉属(Mortierella).结果表明 , 基于分子水平的鉴定方法具有快
速 、准确 、简便 、高效等特点 ,在真菌鉴定分类研究中起着重要作用.
关键词:真菌;ITS;系统发育;分子鉴定
中图分类号:Q939.5　　　　　　　　　　文献标识码:A
0　引　言
真菌是一大类有细胞核无叶绿素且与人类关系
密切的微生物 ,据估计在自然界之中其种类约有 150
万种 , 但目前被描述和熟识的种类仅占 5% ～
10%[ 1-3] ,因而 ,对真菌的鉴定分类工作仍是一项庞
大工程.真菌传统的鉴定分类主要是依据其菌株营
养体和子实体的形态 、颜色 、气味等特征.由于容易
受到环境影响 ,这些形态特征往往容易混淆 ,因而传
统的形态学鉴定方法已难以适应真菌研究的需要.
随着分子生物学的飞速发展 ,分子生物学的研
究手段和技术方法已越来越多地被运用到了真菌鉴
定分类之中 ,例如 DNA碱基组成具有遗传稳定性 ,
不会轻易因外界环境的改变而改变 ,且生物在任何
生长阶段均可获得 DNA,因此 DNA序列分析已成为
当前真菌研究和鉴定的分子手段.目前 ,国外对真菌
的鉴定已普遍采用分子生物学方法 ,而应用于真菌
分类研究的分子生物学技术主要有 ,限制性片段长
度多态性(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,
RFLP)、DNA扩增片段长度多态性(AmplifiedFrag-
mentLengthPolymorphism, AFLP)、核糖 rDNA内部转
录间隔区(InternalTranscribedSpacer, ITS)序列分析
技术和扩增多态性 DNA(RandomAmplifiedPolymor-
phicDNA, RAPD)等 [ 4] ,其中 ,利用 PCR扩增真菌核
糖体 ITS基因区段进行真菌鉴定 、检测的方法因其快
速 、准确 、简便等特点而应用最为广泛 [ 5] .由于 5.8
rDNA两侧的转录区 ITS的序列差异大 ,进化速率快 ,
在真菌的属间和种间会存在巨大变异 ,因而 ITS序列
分析适用于属级或者种级水平的分类研究 [ 6 -8] .近年
来 ,对于利用 ITS区对真菌进行成功鉴定分类的研究
已经有许多报道[ 9-11] .
本研究以银杉土壤中分离的两株真菌菌株为研
究对象 ,在采用形态学方法对其鉴定困难的基础上 ,
对它们的 rDNAITS序列进行了序列测定和系统发育
分析 ,成功地对这两株真菌鉴定到属水平 ,展示了分
子生物学方法在真菌鉴定和分类研究中有着重要作
用.
1　材料与方法
1.1　真菌的分离和培养
本研究所用土壤样品于 2007年 9月采自于广西
壮族自治区花坪自然保护区的银杉根际区 ,土壤样
品置于无菌自封袋中带回实验室 ,并保存于 4 ℃冰箱
中.
土壤真菌采用稀释平板法分离培养:称取 5g土
壤样品 , 30mL无菌水稀释 ,手摇混匀后涡旋振荡混
匀 , 得土壤原液.将 1 mL原液与 9 mL无菌水均匀
混合 , 得 10-1(10-1)土壤样品液.同理 , 依次制得
10-2(10-2)、10-3(10-3)、10-4(10-4)各稀释度
的土壤溶液.各稀释度土壤样品分别取 100 μL放于
收稿日期:2009-03-25.
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30800873).
作者简介:赵颖茹(1984 — ), 女 , 硕士研究生 , 从事菌根真菌生物学研究 .
PDA培养基平板中央 ,并使用无菌玻璃棒均匀涂布 ,
然后置于室温培养.
1.2　真菌 DNA的提取与 ITS区基因扩增及测序
在无菌条件下 ,将培养基块上生长的菌丝体小
心地剥离 ,放入研钵里用液氮研磨 ,然后使用 TIAN-
GEN公司的 DNA提取试剂盒提取菌株的基因组
DNA.所得基因组 DNA使用 1.5%的琼脂糖进行凝
胶电泳 ,并用 EB染色 ,在紫外灯下定性检测 ,再用
AmershamPharmaciaBiotech公司的 GeneQuant紫外
分光光度计定量检测.
PCR扩增 ITS片段选用通用引物 ITS1与
ITS4[ 12] (由 Invitrogen公司合成), 引物序列如下:
ITS1, 5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3;ITS4, 5-TC-
CTCCGCTTATTGATATGC-3.PCR反应体系:25 μL,
10×PCRbufer2.5μL、2.5 mmol的 dNTP2μL、 10
pm的引物 ITS1与 ITS4各 1 μL、2.5 U的 TaqDNA
polymerase(TIANGEN公司)0.25 μL、DNA模板 3
μL、双蒸水 15.25 μL.PCR反应程序:94 ℃预变性 3
min;然后 94℃变性 30s, 55℃退火 45s, 72℃延伸 1
min(35个循环);72 ℃最后延伸 3min.取 2 μLPCR
产物 ,进行 1.5%琼脂凝胶电泳 , EB染色 ,紫外灯下
检测.
最后 , 将扩增产物直接使用鼎国生物公司的
DNA回收纯化试剂盒进行纯化 ,然后使用 ABI3730
测序仪进行测序.
1.3　ITS区基因序列分析与鉴定
将测得的 ITS序列在 GenBank中进行同源序列
搜索 ,并使用 ClustalX(Version1.81)[ 13]软件中的 A-
lignment程序对所得到的 ITS序列进行多重对位排
列(Multiplealignments),并手动将比对结果中 5和 3
端的非对位区 (Unalignableregion)删除.用 MEGA
(Version3.1)[ 14]软件包软件进行系统发育分析和进
化树的构建.用 p-distance模式计算遗传距离 ,所有
对位排列结果中的空位或缺失数据做完全删除处
理 ,进化距离分析采用邻位相连法 (Neighbor-Join-
ing),系统树的每个分支的统计学显著性分析以自展
法进行检验 ,重复次数为 1 000次.
2　结果与讨论
2.1　菌株形态学特征
通过稀释平板法获得两真菌菌株 ,编号为 F-1
和 F-2.两菌株有相似的形态特征(见图 1):菌落正
面呈白色 ,半透明 ,紧贴培养基生长 ,新生区生长均
匀;菌丝辐射状整齐排列 ,细且长 ,末端有很多分枝 ,
纹理稀疏可见 ,反面无明显变化;从菌落的生长速度
来看 ,两者均能在培养基上迅速生长 ,一周内即可铺
满整个平板.
(A, B分别为F-1菌株的正面和反面;C, D分别为 F-2菌株的正面和反面)
图 1　F-1和 F-2菌株的菌落形态
2.2　ITS扩增与序列测定
由于形态学上两菌株具有相似之处 ,无法判定
两菌株是否为同一属 ,因此采用分子生物学方法对
其进行鉴定:首先提取 DNA,然后进行 PCR扩增 ,两
菌株的 ITSPCR扩增结果见图 2.从 2个菌株的基因
组 DNA中 ,引物 ITS1 /ITS4成功地扩增出了单一条
带 ,即位于 F-1与 F-2的 rDNAITS区(ITS1-5.8S-
ITS2)的一段 ITS序列 ,序列长度在 550 ～ 750 bp之
间.
(M:DNAmarker;1:λDNA;2:F-1;3:F-2)
图 2　F-1和 F-2菌株 ITS序列的 PCR扩增
对两 PCR产物进行测序得:F-1菌株 ITS序列
总长度为 524 bp, GC含量为 55.5%;F-2菌株 ITS
序列总长度为 540 bp, GC含量为 39.8%.将两序列
递交 GenBank, 获得的序列号为:FJ410908与 -
FJ410909.
2.3　系统发育分析
对两菌株的 ITS序列 ,连同从 NCBI数据库中下
载的 10个属共 30种真菌的 ITS区序列(见表 1)一
起进行系统发育分析.在用 ClustalX软件做多重序
列比对后 ,去除所有序列 5和 3端的非对位排列区 ,
基于 MAGA软件建了 NJ系统进化树(见图 3).F-1
·95·第 2期　　　　　　　　　赵颖茹 ,等:两株银杉根际土壤真菌的分离与分子鉴定
与木霉属(Trichoderma)的序列聚成一支 ,支持率为
100,因此可以确定 F-1是木霉属的一种真菌;F-2
和被孢霉属(Mortierela)的序列聚在一起 , 支持
表 1　F-1和 F-2菌株及其他真菌ITS序列的 GenBank号
率为 100,因此可以确定 F-2是属于被孢霉属的一
种真菌.
图 3　基于 rDNAITS序列构建的 NJ系统发育树
2.4　ITS序列的属内同源性比较
图 4A为 F-1菌株和 Trichoderma属 3个不同种
真菌的 ITS区序列比较 , 除了高度保守的 5.8 S区
外 , F-1菌株 ITS区的 ITS1区和 ITS2区也比较保守 ,
(A:F-1菌株与 3个 Trichoderma属真菌的 ITS序列比对;B:F-2菌株与 3个 Mortierela属真菌的 ITS序列比对)
图 4　ITS的多序列比对
·96· 　　　　　　　　　　　　　　成都大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　第 28卷
F-1菌株的 ITS1区碱基位点为 1 ～ 175,在这个区域
中 ,它与 T.aureoviride序列差异相对较大 ,与其他两
条序列碱基差异很小 , F-1菌株的 5.8S区碱基位点
是 176 ～ 334,该区域里 F-1菌株序列与其他 3种菌
的序列没有一个位点存在变异.ITS2区是从碱基位
点 335 ～ 524, 该区 域 里 F-1 菌 株序 列与
T.aureoviride序列差异相对较大 ,与其他两条序列在
位点 379、386、402有变异.
图 4B为 F-2和 Mortierela属 3个不同种的真
菌的 ITS区序列比 , ITS1区是碱基位点 1 ～ 149,在这
个区域中 F-2序列与其他 3个序列在位点 28 ～ 111
之间有较大差异 ,另在位点 118、121、134、135 ～ 138
有少量变异.5.8S区碱基位点是 150 ～ 308,该区域里
F-2序列与其他 3条序列有少量变异位点 , ITS2区
是从碱基位点 309到 583,该区域里 F-2序列与其
他序列存在大量广泛分布的变异位点.
3　结　论
在本研究中 ,通过稀释平板法获得的两真菌菌
株有相似的形态特征 ,仅用形态学方法无法将两者
区分鉴定开来 ,而采用基于 ITS序列的特征和构建系
统发育树等分子手段使我们成功地对这两株真菌鉴
定到属水平.
分子生物学的方法和手段弥补了传统形态学方
法上的不足 ,能快速 、准确地鉴定真菌 ,该技术的发
展和广泛应用将会大大推动真菌的鉴定和分类研究
工作.
由于两株供试菌株来源于濒危植物银杉根际土
壤 ,这对于进一步研究银杉的根际土壤多样性与银
杉的濒危机制是否存在关联 ,提供了一种良好的可
操作的研究手段.
参考文献:
[ 1] HawksworthDL.Thefungaldimensionbiodiversity:magni-
tude, significance, andconservasion[ J] .MycologicalRe-
search, 1991(95):641-655.
[ 2] HawksworthDL, RossmanAY.Wherearealltheundescribed
fungi[ J] .Phytopathology, 1997(87):888-891.
[ 3] HawksworthDL.Themagnitudeoffungaldiversity:The1.5
milionspeciesestimaterevisited[ J] .MycologicalResearch,
2001(105):1422-1432.
[ 4]赵瑞琳.RAPD在真菌分类鉴定上的应用 [ J] .热带农业科
技 , 2004, 27(3):23-26.
[ 5]陈剑山 ,郑服丛.ITS序列分析在真菌分类鉴定中的应用
[ J] .安徽农业科学 , 2007, 35(13):3785-3786, 3792.
[ 6] AndersenB, ThraneU.DiferentiationofAlternariainfectoria
andAlternariaalternatebasedonmorphology, metabolitepro-
files, andculturalcharacteristics[ J] .CanJMicrobiol, 1996
(42):685-689.
[ 7] BrowerAV, DesaleR, VoglerA.Genetree, speciestrees, and
systemtics:ACladisticPerspective[ J] .AnnRevEcolSyst,
1996(27):423-450.
[ 8] BrunsTD, WhiteTJ, TaylorJW.Fungalmolecularsystemat-
ics[ J] .AnnuRevEcolSyst, 1991(22):525-564.
[ 9] RoyseDJ, NicholsonMS, BunyardBA.RibosomalDNAfor
molecularsystematicsandgeneticanalysisofpopulationsofed-
iblefungi[ G] //LuoXC, ZangM.TheBiologyandTechnolo-
gyofLentinulaMushroom.北京:中国农业科技出版社 ,
1995.
[ 10] BunyardBA, ChaichuchoteS, NicholsonMS, etal.Riboso-
malDNAanalysisforresolutionofgenotypicclassesofPleu-
rotus[ J] .MycolRes, 1996, 100(2):143-150.
[ 11]林晓民 , 李振岐 , 王少先.真菌 rDNA的特点及在外生菌
根菌鉴定中的应用 [ J] .西北农业学报 , 2005, 14(2):120
-125.
[ 12] WhiteTJ, LeeSB, TaylorJW.Amplificationanddirectse-
qencingoffungalribosomalRNAgenesforphylogenetics
[ M] //InnsMA, GelfandDH, sninskyJJ, etal.PCRpro-
tocol, aguidetomethodsandapplication.SanDiego:APS
Press, 1990:315-322.
[ 13] ThompsonJD, GibsonTJ, PlewniakF, etal.TheclustalX
windowsinterface:flexiblestrategiesformultiplesequencea-
lignmentaidedbyqualityanalysistools[ J] .NuclAcids
Res, 1997, 25(24):4876-4882.
[ 14] KumarS, TamuraK, JakobsenIB, etal.MEGA2:molecular
evolutionarygeneticsanalysissoftware[ J] .Bioinformatics,
2000(17):1244-1245.
(下转第 103页)
·97·第 2期　　　　　　　　　赵颖茹 ,等:两株银杉根际土壤真菌的分离与分子鉴定
AnalgesicandAnti-inflammatoryEffectsofExtracts
fromTartaryBuckwheatSprouts
HUYibing, ZHAOGang, PENGLianxin, YANGJingdong, ZOULiang
(SchoolofBioindustry, ChengduUniversity, Chengdu610106, China)
Abstract:Toobserveanalgesicandanti-inflammatoryefectsofextractsfrom tartarybuckwheat
sprouts, mousehot-platetestwastakentoobserveanalgesicefectsofextractsfromtartarybuckwheat
sproutsandmodelsofinflammatoryreactionsofdimethylbenzene-inducedmouseearedemawereper-
formedtoobserveitsinflammatoryreactionsonmice.Theresearchresultsshowthatthelatencyof
lickingofthehindpawsisprolongedbytheextracts.Itcanreducetheextentofearswelinginduced
bydimethylbenzeneinmice(P<0.01, P<0.05).Thefindingsshowthatextractsfromtartarybuck-
wheatsproutshaveefectsonanalgesiaandanti-inflammation.
Keywords:extractsfromtartarybuckwheatsprouts;analgesia;anti-inflammation
(上接第 93页)
DeterminationofHydroxylRadicalGeneratingfrom
FentonReactionbySpectrophotometry
YANJun, GOUXiaojun, ZOUQuanfu, JIXiaoming, CUIXiuying, LANHairong, LIXue
(ChemistryLaboratoryofTraditionalChineseMedicine, ChengduUniversity, Chengdu610106, China)
Abstract:Toproduce2, 3-dihydroxybenzoicand2, 5-dihydroxybenzoic, salicylicacidwasusedto
catchhydroxylradical(·OH)byspectrophotometerdetermininghydroxylradicalproducedbyFen-
tonreaction.Thereactantshaveanabsorptionmaximumat510nm.Reactionsystemwasoptimizedto
screenoutthebestreactantmatchandoptimalexperimentalconditionsanditsstabilitywastested.
Basedontheabove, clearancerateofantioxidantonhydroxylradicalwasmeasured.Thefindings
showthatthissystemhassensitivereaction, highstabilityandcanbeusedtofilterantioxidant.
Keywords:Fentonreaction;hydroxylradical;spectrophotometry;salicylicacid
(上接第 97页)
IsolationandMolecularCharacterizationofTwoFungi
ofCathayaArgyrophylaRhizosphere
ZHAOYingru1 , GOUXiaojun2 , YANJun2
(1.ColegeofBiologicalSciencesandBiotechnology, BeijingForestryUniversity, Beijing100083, China;
2.ChemistryLaboratoryofTraditionalChineseMedicine, ChengduUniversity, Chengdu610106, China)
Abstract:TwofungalstrainsF-1 andF-2 whichisolatedfromtherhizosphereofCathayaargyro-
phylaweredificulttodistinguishbasedontheirmorphologicalcharacteristics.Thus, molecularmeth-
odwasusedtoidentifythetwofungalstrains.TherDNAITSregionsofthetwofungiwereamplified
andsequenced.ITSsequencesanalysisofthetwofungiandother30 fungalstrainsfrom10 diferent
genusshowedthatF-1 strainbelongstotheTrichodermaspp.andF-2 strainbelongstotheMor-
tierelaspp..Thisstudyrevealsthatthemolecularmethodwhichisfast, accurate, simpleandhighef-
ficientplaysanimportantroleinresearchofFunguscharacterizationandclassification.
Keywords:Fungi;ITS;phylogeny;molecularcharacterization
·103·第 2期　　　　　　　　　　　胡一冰 ,等:苦荞芽提取物的镇痛抗炎作用