全 文 ：书　［收稿日期］　２０１６－０６－１６；２０１６－０９－２０修回
　［基金项目］　国家自然科学基金项目“干热河谷区木棉－丛枝菌根真菌共生系统的水分关系研究”（３１２６０１７５），“地生兰－菌根真菌－松三联共
生关系研究”（３１３６０１９８），“云南热区木棉不同基因型的抗旱性比较”（３１５６０２０７）；云南省高校干热河谷植被恢复创新团队项目
“干热河谷木棉定向培育和产业化技术开发研究”（２０１６ＣＹＨ１４）；云南省重点学科森林保护学项目（ＸＫＺ２００９０５）；云南省林学
一流学科建设项目（ＹＮ２０１６）；云南省高等学校森林病虫害综合治理教学团队项目（ＹＮ２０１２）
　［作者简介］　葛立傲（１９９１－），男，在读硕士，研究方向：园林植物保护学。Ｅ－ｍａｉｌ：ｇｅｌｉａｏｇａｏ＠１６３．ｃｏｍ
　＊通讯作者：伍建榕（１９６３－），女，教授，从事森林病理学与资源微生物利用研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｕｊｉａｎｒｏｎｇ６３＠ａｌｉｙｕｎ．ｃｏｍ
［文章编号］１００１－３６０１（２０１６）１０－０４２６－００６６－０４
栌菊木共生丛枝菌根真菌的分离鉴定
葛立傲１，王国娟１，马焕成２，高秀琴 １，陈梦帆１，伍建榕１＊
（１．西南林业大学 林学院，云南省高校森林灾害预警控制重点实验室，云南 昆明６５０２２４；２．国家林业局
西南地区生物多样性保育重点实验室，云南 昆明６５０２２４）
　　［摘　要］为了解栌菊木（Ｎｏｕｅｌｉａ　ｉｎｓｉｇｎｉｓ　Ｆｒａｎｃｈ）共生丛枝菌根真菌（Ａｒｂｕｓｃｕｌａｒ　ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ　ｆｕｎｇｉ，
ＡＭＦ）的物种多样性，探明其形成乔木与丛枝菌根真菌多样性的关系，野外采集栌菊木根系及根际土壤，利
用土壤湿晒法和根系透明染色镜检法，研究丛枝菌根真菌在土壤中的孢子密度及丛枝菌根真菌的侵染率，并
采用形态学和分子生物学方法对分离的ＡＭＦ孢子优势菌株进行鉴定。结果表明：传统形态学方法初步鉴
定出栌菊木土壤中存在摩西球囊霉（Ｇｌｏｍｕｓ　ｍｏｓｓｅａｅ）和幼套球囊霉（Ｃｌａｒｏｉｄｅｏｇｌｏｍｕｓ　ｅｔｕｎｉｃａｔｕｍ）２种ＡＭ
真菌；应用ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ技术扩增１８ＳｒＲＮＡ中的ＮＳ３１－ＡＭ１区，通过序列比对构建系统发育树Ａ－１真菌与
Ｇｌｏｍｕｓ　ｍｏｓｓｅａｅ（ＤＱ２７３７９３）亲缘性为９７％，Ａ－２真菌与Ｃｌａｒｏｉｄｅｏｇｌｏｍｕｓ　ｅｔｕｎｉｃａｔｕｍ（ＡＪ５１０２３１）亲缘性为
９９％。根据形态学与分子生物学的双重鉴定，确定侵染栌菊木根系的 ＡＭ 真菌是摩西球囊霉和幼套球囊
霉。
［关键词］栌菊木；ＡＭ真菌；ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ；侵染率
［中图分类号］Ｑ９３９．５ ［文献标识码］Ａ
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｙｍｂｉｏｓｉｓ　Ａｒｂｕｓｃｕｌａｒ　Ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ
Ｆｕｎｇｉ（ＡＭＦ）ｉｎ　Ｎｏｕｅｌｉａ　ｉｎｓｉｇｎｉｓ　Ｓｏｉｌ
ＧＥ　Ｌｉ’Ａｏ１，ＷＡＮＧ　Ｇｕｏｊｕａｎ１，ＭＡ　Ｈｕａｎｃｈｅｎｇ２，
ＧＡＯ　Ｘｉｕｑｉｎｇ１，ＣＨＥＮ　ＭｅｎｇＦａｎ１，ＷＵ　Ｊｉａｎｒｏｎｇ１＊
（１．Ｙｕｎｎａｎ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｆｏｒｅｓｔ　Ｄｉｓａｓｔｅｒ　Ｗａｒｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋｕｎｍｉｎｇ，Ｙｕｎｎａｎ６５０２２４；２．Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ，Ｓｔａｔｅ　Ｆｏｒ－
ｅｓｔｒｙ　Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｋｕｎｍｉｎｇ，Ｙｕｎｎａｎ　６５０２２４，Ｃｈｉｎａ）
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｓｐｏｒｅ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ａｎｄ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ＡＭＦ　ｉｎ　ｒｏｏｔ　ｓｙｓｔｅｍ　ａｎｄ　ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ　ｓｏｉｌ　ｏｆ
Ｎ．ｉｎｓｉｇｎｉｓ　ｗｅｒｅ　ｓｔｕｄｉｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｓｏｉｌ　ｄｒｙｉｎｇ　ｉｎ　ｓｈａｄｅ　ａｎｄ　ｒｏｏｔ　ｓｙｓｔｅｍ　ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｃｙ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ
ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｗｉｔｈ　ｓｐｏｒｅ　ｓｕｐｅｒｉｏｒｉｔｙ　ｏｆ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ＡＭＦ　ｗｅｒｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ａｎｄ
ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｔｏ　ｄｉｓｃｕｓｓ　ＡＭＦ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ａｒｂｕｓｃｕｌａｒ　ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ　ｆｕｎｇｉ　ｉｎ　Ｎ．ｉｎｓｉｇｎｉｓ　ｓｏｉｌ　ａｎｄ
ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｒｅｅ　ａｎｄ　ＡＭＦ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅｒｅ　ａｒｅ　ｔｗｏ　ＡＭＦ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｏｆ　Ｇｌｏｍｕｓ
ｍｏｓｓｅａｅ　ａｎｄ　Ｃｌａｒｏｉｄｅｏｇｌｏｍｕｓ　ｅｔｕｎｉｃａｔｕｍｉｎ　Ｎ．ｉｎｓｉｇｎｉｓ　ｓｏｉｌ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｆｒｏｍ　ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ　ＮＳ３１－ＡＭ１ａｒｅａ
ｉｎ　１８ＳｒＲＮＡ　ｂｙ　ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ　ｓｈｏｗ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｂｅｔｗｅｅｎ　Ａ－１ｆｕｎｇｕｓ　ａｎｄ　Ｇｌｏｍｕｓ　ｍｏｓｓｅａｅ
（ＤＱ２７３７９３）ｉｎ　ＧｅｎＢａｎｋ　ｒｅａｃｈｅｓ　９７％ ａｎｄ　ｔｈｅ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｂｅｔｗｅｅｎ　Ａ－２ｆｕｎｇｕｓ　ａｎｄ　Ｃｌａｒｏｉｄｅｏｇｌｏｍｕｓ
ｅｔｕｎｉｃａｔｕｍ （ＡＪ５１０２３１）ｉｓ　ｕｐ　ｔｏ　９９％．Ｔｈｅ　ＡＭＦ　ｔｏ　ｉｎｆｅｃｔ　ｔｈｅ　ｒｏｏｔ　ｓｙｓｔｅｍ　ｏｆ　Ｎ．ｉｎｓｉｇｎｉｓ　ａｒｅ　Ｇｌｏｍｕｓ
ｍｏｓｓｅａｅ　ａｎｄ　Ｃｌａｒｏｉｄｅｏｇｌｏｍｕｓ　ｅｔｕｎｉｃａｔｕｍ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｄｏｕｂｌｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ａｎｄ
ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｎｏｕｅｌｉａ　ｉｎｓｉｇｎｉｓ；Ａｒｂｕｓｃｕｌａｒ　ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ　ｆｕｎｇｉ（ＡＭＦ）；ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ；ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ
　　丛枝菌根真菌（Ａｒｂｕｓｃｕｌａｒ　ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ　ｆｕｎ－
ｇｉ，ＡＭＦ）分布广泛，能够侵染９０％以上陆生植物根
系形成菌根［１］。丛枝真菌能够提高植物的抗病性、
抗旱性和抗逆性等抗性［２］。近年来，丛枝菌根真菌
逐渐受到研究者的关注，以至于在很多真菌学、植物
学上的研究都要考虑丛枝菌根的影响。胡文武等［３］
研究广州菊科植物丛枝菌根侵染和根际土壤孢子密
度发现，根际土壤孢子密度与土壤有机质含量呈显
著负相关。郭世荣等［４］研究发现，ＡＭＦ处理显著提
高辣椒植株叶片的净光合速率、显著降低蒸腾速率。
菊科植物多为草本和灌木植物，只有栌菊木（Ｎｏｕｅ－
ｌｉａ　ｉｎｓｉｇｎｉｓ　Ｆｒａｎｃｈ）单种属长成乔木。栌菊木是干
热河谷攀枝花地区我国特有的单种属菊科中稀有的
木本残遗种，具有很强的抗干热性。其能在干热河
谷如此恶劣的环境下生存，除与植物本身生理特性
有关外，还与植物根际土壤中的丛枝菌根有着不可
磨灭的关系［６］。栌菊木作为在干热河谷地区生长的
唯一乔木菊科树种，但对栌菊木方面的研究报道极
少，尤其是应用分子生物学方法研究栌菊木丛枝菌
根真菌的报道［５］。
　贵州农业科学　２０１６，４４（１０）：６６～６９
　Ｇｕｉｚｈｏｕ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
近年来，基础ＰＣＲ的各种分子技术已经广泛应
用于丛枝菌根真菌的研究，而核糖体基因分析为
ＡＭ真菌属或种设计特异性引物提供了可能［７］。运
用普通ＰＣＲ和巢式ＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ）相结合，实
现ＡＭ真菌在根内和土壤中的特异性检测，为栌菊
木ＡＭ真菌的准确检测提供技术支撑［８］。为了解
栌菊木共生的丛枝菌根真菌的物种多样性，探明其
形成乔木与丛枝菌根真菌多样性的关系，为栌菊木
的保护及开发利用提供参考，笔者利用形态学鉴定
法和分子生物学方法相结合，对栌菊木ＡＭ 真菌进
行了分离鉴定。
１ 材料与方法
１．１ 样品采集
２０１５年４月至２０１６年３月，分别６次在攀枝
花干热河谷地区采集栌菊木成株根际１０～３０ｃｍ土
层土样约２　０００ｇ放入自封袋中，同时采集栌菊木
成株主根系、侧根及须根，并将部分根系立即放入
ＦＡＡ（７０％酒精９０ｍＬ、福尔马林５ｍＬ、冰醋酸
５ｍＬ）中保存固定，土样带回实验室后放入阴凉处
风干，根样放入４℃条件下保存备用。
１．２ 根系侵染
取出根系，加入１５％ ＫＯＨ 进行解离，在９０℃
水浴中解离２ｈ，自然冷却，清洗４～５次。加入２％
乳酸进行酸化２０ｍｉｎ，清洗４～５次。加入０．０５％
苯胺蓝（乳酸３３３ｍＬ、甘油３３３ｍＬ、蒸馏水３３３ｍＬ、
苯胺蓝０．５ｇ）于水浴锅中染色１ｈ。染色后用乳酸
脱色，最后取出镜检［９］。然后计算 ＡＭ 侵染率，即
被侵染的根段长（包括有菌丝、丛枝、泡囊及根内孢
子的根段）占总根段的比率。
１．３ ＡＭ真菌孢子的鉴定
１．３．１ 形态学鉴定 采用湿晒沉淀法将孢子从栌
菊木根际（围）土壤中分离出来，在双管解剖镜下观
察孢子大小、颜色、孢壁的厚度和层数，进行初步分
离，待用［１０］。
１．３．２ 分子学鉴定
１）单孢ＤＮＡ的提取。用解剖针挑取单个ＡＭ
真菌孢子，用无菌水漂洗４～５次，放入高温灭菌的
１．５ｍＬ离心管中，加入ＳＴＬ缓冲液２００μＬ，在
６０℃水浴中加热１５ｍｉｎ，每２ｍｉｎ涡旋混匀，简单离
心（３　８００ｒ／ｓ、２０ｓ）；加入蛋白酶Ｋ溶液２μＬ，６０℃
水浴中预热４５ｍｉｎ，简单离心，去除离心管盖子上
的水珠，加入Ｂｕｆｆｅｒ　ＢＬ溶液２２５μＬ，简单离心；加
入无水乙醇２２５μＬ，简单离心，将小收集柱放入
２ｍＬ收集管中，转移整个样（包括沉淀）到收集管
中，离心（３　８００ｒ／ｓ）１ｍｉｎ，丢弃下液，用Ｂｕｆｆｅｒ　ＨＢ
漂洗５００μＬ，离心（３　８００ｒ／ｓ）１ｍｉｎ弃下层液，将收
集柱放入新的２ｍＬ收集管中，用 Ｗａｓｈ　Ｂｕｆｆｅｒ（需用
无水乙醇稀释）７００μＬ漂洗２次，离心（３　８００ｒ／ｓ）
１ｍｉｎ。将收集柱放入１．５ｍＬ收集管中，用Ｅｌｕｔｉｏｎ
Ｂｕｆｆｅｒ　２５μＬ洗脱２次，将收集液于－２０℃条件下
保存、备用。
２）目标ＤＮＡ片段的ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ扩增。分别
将上述提取的ＡＭ真菌单孢ＤＮＡ进行第１次普通
ＰＣＲ，将扩增产物稀释５０倍作为第２次ＰＣＲ模板，
进行ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ。第１次ＰＣＲ引物为 Ｇｅｏｌ１：５′
ＡＣＣ　ＴＴＧ　ＴＴＡ　ＣＧＡ　ＣＴＴ　ＴＴＡ　ＣＴＴ　ＣＣ　３′，
ＧｅｏＡ２：５′ＣＣＡ　ＧＴＡ　ＧＴＣ　ＡＴＡ　ＴＧＣ　ＴＴＧ　ＴＣＴ
３′，第２次ＰＣＲ引物为 ＮＳ３１：５′ＴＴＧ　ＧＡＧ　ＧＧＣ
ＡＡＧ　ＴＣＴ　ＧＧＴ　ＧＣＣ　３′，ＡＭ１：５’ＧＴＴ　ＴＣＣ　ＣＧＴ
ＡＡＧ　ＧＣＧ　ＣＣＧ　ＡＡ　３′。
第１次ＰＣＲ扩增，反应体系为５０μＬ，其中，
ＭＩＸ　１６．２μＬ，Ｇｅｏｌ１　２．５μＬ，ＧｅｏＡ２　２．５μＬ，ＤＮＡ
４μＬ，ｄｄＨ２Ｏ　２４．８μＬ。反应条件：盖子温度１０５℃；
９４℃４ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５８℃１ｍｉｎ，７２℃１ｍｉｎ，３０
个循环；７２℃１０ｍｉｎ；４℃保存。第２次ＰＣＲ扩增，
反应体系为 ５０μＬ，其中，ＭＩＸ　２０．２μＬ，ＮＳ３１
２．５μＬ，ＡＭ１　２．５μＬ，ｄｄＨ２Ｏ　２３．８μＬ，ＤＮＡ　１μＬ
（第１次ＰＣＲ产物），反应条件与第１次ＰＣＲ相同。
然后进行琼脂糖凝胶电泳检测。
３）目标ＤＮＡ片段的测序及系统发育树构建。
将ＰＣＲ产物纯化回收由上海生工生物工程技术有
限公司进行测序。测序结果与西弗吉利亚大学网站
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖａｍ．ｗｖｕ．ｅｄｕ）上以及ＮＣＢＩ上查
询的序列进行比对，采用 ＭＥＧＡ　６中的极大似然法
对所有序列进行系统进化分析。
２ 结果与分析
２．１ 栌菊木ＡＭ真菌孢子的形态特征
经镜检，栌菊木根内具有丛枝菌根结构，表明栌
菊木根能形成丛枝菌根。丛枝菌根真菌侵染率越高
的树木生长越好，枝叶越茂盛。栌菊木土壤中存在
大量ＡＭ真菌孢子，其中主要优势菌种经形态学鉴
定，分别属于摩西球囊霉（Ｇｌｏｍｕｓ　ｍｏｓｓｅａｅ）和幼套
球囊霉（Ｃｌａｒｏｉｄｅｏｇｌｏｍｕｓ　ｅｔｕｎｉｃａｔｕｍ）。
１）摩西球囊霉。孢子圆形或近圆形，淡黄色至
黄褐色，直径２５０～３２５μｍ；有３层孢壁，外层孢壁
无色透明，成熟后一般脱落，第２层孢壁淡黄或浅黄
棕色，第３层孢壁黄棕色至浅橘黄棕色，连点呈漏斗
状，连点直径为１６～３２μｍ（图１）。
　　２）幼套球囊霉。孢子圆形或近圆形，淡黄色或
黄色，直径９０～１５５μｍ；有２层孢壁，外层孢壁无色
透明，内层孢壁黄色或黄棕色；未成熟后垣孢子的外
壁有完整的连孢菌丝，成熟后脱落（图２）。
50μm 50μm
图１ 栌菊木土壤中摩西球囊霉（Ｇｌｏｍｕｓ　ｍｏｓｓｅａｅ）的形态
Ｆｉｇ．１　Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｇｌｏｍｕｓ　ｍｏｓｓｅａｅ　ｉｎ　Ｎ．ｉｎｓｉｇｎｉｓ　ｓｏｉｌ
·７６·
　葛立傲 等　栌菊木共生丛枝菌根真菌的分离鉴定
　ＧＥ　Ｌｉ’Ａｏ　ｅｔ　ａｌ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｙｍｂｉｏｓｉｓ　Ａｒｂｕｓｃｕｌａｒ　Ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ　Ｆｕｎｇｉ（ＡＭＦ）ｉｎ　Ｎｏｕｅｌｉａ　ｉｎｓｉｇｎｉｓ　Ｓｏｉｌ
50μm 50μm
　图２ 栌菊木土壤中幼套球囊霉（Ｃｌａｒｏｉｄｅｏｇｌｏｍｕｓ
ｅｔｕｎｉｃａｔｕｍ）的形态
　　Ｆｉｇ．２　Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｃｌａｒｏｉｄｅｏｇｌｏｍｕｓ　ｅｔｕｎｉｃａｔｕｍ
ｉｎ　Ｎ．ｉｎｓｉｇｎｉｓ　ｓｏｉｌ
２．２ 栌菊木丛枝菌根的发育及侵染情况
对栌菊木根系透明染色发现有大量丛枝结构
（图３），表明栌菊木根系可以形成丛枝菌根。挑选
５０段根系进行观察，其根系基本均被侵染，其中有
泡囊－丛枝结构的４７根，栌菊木丛枝菌根的菌丝侵
染率高达９４％。
２．３ ＡＭ真菌单孢ＤＮＡ　ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ
经普通ＰＣＲ发现，由于ＡＭ真菌ＤＮＡ含量较
少，在琼脂凝胶中没有观察到ＤＮＡ条带。故使用
引物ＡＭ１、ＮＳ３１进行ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ扩增，ＡＭ 真菌
相应的特异性ＤＮＡ序列被扩增出来，片段大小为
５００～７５０ｂｐ（图４）。
２．４ ＡＭ真菌的系统发育树
将栌菊木２种ＡＭ真菌扩增的ＤＮＡ序列编号
50μm 50μm
图３ 栌菊木根系的丛枝结构（４０×）
Ｆｉｇ．３　Ａｒｂｕｓｃｕｌａｒ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｎ．ｉｎｓｉｇｎｉｓ　ｒｏｏｔ　ｓｙｓｔｅｍ（４０×）
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
250 bp
100 bp
500 bp
A-1 A-2
图４ 栌菊木ＡＭ真菌单孢ＤＮＡ　ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ扩增电泳图谱
Ｆｉｇ．４　Ｓｉｎｇｌｅ－ｓｐｏｒｅ　ＤＮＡ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ　ｏｆ　Ｎ．ｉｎｓｉｇｎｉｓ
ＡＭＦ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ
图５ 栌菊木２株ＡＭ真菌与其他近缘种的系统发育树
　　Ｆｉｇ．５　Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　ｏｆ　ｔｗｏ　Ｎ．ｉｎｓｉｇｎｉｓ　ＡＭＦ
ｔｒａｉｎｓ　ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　ｃｌｏｓｅｌｙ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｓｐｅｃｉｅｓ
为Ａ－１和Ａ－２，以２个孢子ＮＳ３１－ＡＭ１区域的ＤＮＡ
序列在ＧｅｎＢａｎｋ上进行ｂｌａｓｔ比对，与相关菌种构
建系统发育树（图５），Ａ－１和Ａ－２聚成一支，具有较
高 的 支 持 率。其 中，Ａ－１ 与 Ｇｌｏｕｍｓ　ｍｏｓｓｅａｅ
（ＤＱ２７３７９３）同源性最高，为９７％，初步鉴定Ａ－１为
摩西球囊霉（Ｇｌｏｕｍｓ　ｍｏｓｓｅａｅ）。Ａ－２与Ｃｌａｒｏｉｄｅｏ－
ｇｌｏｍｕｓ　ｅｔｕｎｉｃａｔｕｍ （ＡＪ５１０２３１）同 源 性 最 高，为
９９％，初步鉴定 Ａ－２为幼套球囊霉（Ｃｌａｒｏｉｄｅｏｇｌｏ－
ｍｕｓ　ｅｔｕｎｉｃａｔｕｍ）。
３ 结论与讨论
随着现代分子生物学技术的不断发展，各种生
物分子学技术被应用到生物物种的鉴定方面。但是
丛枝菌根真菌的分子鉴定工作，在国内还比较少见。
本研究是国内首次对栌菊木丛枝菌根真菌进行形态
学和分子学双重鉴定，为今后栌菊木菌落的进一步
研究奠定了基础。根据ＡＭ 真菌的形态学观察，侵
染栌菊木的 ＡＭ 真菌初步鉴定为摩西球囊霉和幼
套球囊霉。后期的分子学鉴定也为形态学鉴定提供
了证明。
ＡＭ真菌的分离鉴定是保护以及利用微生物资
源最基本也是最重要的工作，ＡＭ 真菌几乎可以存
在于土壤中任何地方，且具有丰富的物种多样
性［１１］。但是，ＡＭ 真菌与宿主植物严格共生，不能
独立完成一个生活周期，目前还不能对ＡＭ 真菌进
行纯培养。因此，对其鉴定工作有一定困难。近年
来，随着分子生物学的发展，国内外大批学者开始尝
试从基因水平上认识和鉴定新的物种［１２］。采用
ＮＳ３１－ＡＭ１区域是真核生物１８ＳｒＲＮＡ的一部分，
其片段较小（约５５０ｂｐ），又是丛枝菌根真菌菌种的
种间可变区域，可以作为丛枝菌根菌种的鉴定依
据［１３］。目前，ＡＭ真菌分子鉴定的困难之处在于其
基因信息数据库不完整，许多菌种和菌株没有录入
·８６·
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　贵 州 农 业 科 学
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｇｕｉｚｈｏｕ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
基因信息库，本研究也通过在Ｇｅｎｂａｎｋ以及西弗吉
利亚大学网站内找到相对完整的基因库来进行分子
学鉴定。而且，并非所有的ＡＭ 真菌都能侵染土壤
中的植物根系，同时不同植物品种的ＡＭ 真菌侵染
方式不同。因此，宿主植物与ＡＭ 真菌共生的关系
具有一定选择性，通过鉴定，收集，保护各种ＡＭ 真
菌具有重要的意义。
综合形态学特征及ＤＮＡ序列比对结果，侵染
栌菊木的２种ＡＭ真菌分别是摩西球囊霉（Ｇｌｏｕｍｓ
ｍｏｓｓｅａｅ）和幼套球囊霉（Ｃｌａｒｏｉｄｅｏｇｌｏｍｕｓ　ｅｔｕｎｉｃａ－
ｔｕｍ）。２个ＡＭ真菌为栌菊木中的优势菌种，在其
他抗干旱植物上也发现有共生的现象，说明２个菌
种对植物的抗干旱性有促进作用，今后可在其他植
物上接种，放在相同抗旱条件下对比，测定植物的生
物量，为干热地区植被的恢复提供参考。
［参 考 文 献］
［１］ 刘润进，李晓林．丛枝菌根及其应用［Ｍ］．北京：科学
出版社，２０００．
［２］ ＫＯＩＤＥ　Ｒ　Ｔ，ＭＯＳＳＥ　Ｂ．Ａ　ｈｉｓｔｏｒｙ　ｏｆ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｎ　ａｒ－
ｂｕｓｃｕｌａｒ　ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａ ［Ｊ］．Ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａ，２００４，１４：
１４５－１６３．
［３］ 胡文武，辛国荣，郭健桦，等．广州地区七种菊科入侵
植物丛枝菌根侵染和根际土壤孢子密度的生境差异
性分析［Ｊ］．热带亚热带植物学报，２０１５，２３（２）：
１８３－１９０．
［４］ 郑舜怡，郭世荣，张 钰，等．丛枝菌根真菌对辣椒光
合特性及根际微生物多样性和酶活性的影响［Ｊ］．西
北植物学报，２０１４，３４（４）：０８００－０８０９．
［５］ 高宝莼，方文培，孔宪需，等．四川植物志［Ｍ］．成都：
四川人民出版社，１９８０．
［６］ 马焕成，曾小红．干旱和干旱河谷及其植被恢复［Ｊ］．
西南林学院学报，２００５，２５（４）：５２－５５．
［７］ 蔡柏岩，阎秀峰，葛菁萍，等．黄檗根围丛枝菌根真菌
的分离与分子鉴定［Ｊ］．菌物学报，２００８，２７（６）：
８８４－８９３．
［８］ 郑世学，董秀丽，喻子牛，等．四种 ＡＭ 真菌接种剂的
田间效应及其分子检测研究［Ｊ］．土壤学报，２００４，
４１（５）：７４２－７４９．
［９］ ＢＥＲＣＨ　Ｓ　Ｍ，ＫＥＮＤＲＩＣＫ　Ｂ．Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ－ａｒｂｕｓｃｕｌａｒ
ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｅ　ｏｆ　Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｏｎｔａｒｉｏ　ｆｅｒｎｓ　ａｎｄ　ｆｅｒｎ－ａｌｉ－
ｉｅｓ［Ｊ］．Ｍｙｃｏｌｏｇｉａ，１９８２，７４（５）：７６９－７７６．
［１０］ 刘润进，陈应龙．菌物学［Ｍ］．北京：科学出版社，
２００７．
［１１］ ＯＢＡ　Ｈ，ＴＡＷＡＲＡＹＡ　Ｋ．Ｓｅｍｉ－ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ
ｏｆ　ａｒｂｕｓｃｕｌａｒ　ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｏｎｉｏｎ　ｒｏｏｔｓ　ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ
ｗｉｔｈ　ｓｉｎｇｌｅ　ｏｒ　ｍｉｘｅｄ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｂａｓｅｄ　ｕｐｏｎ　ＰＣＲ－ＲＦＬＰ
［Ｊ］．Ｓｏｉｌ　ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２，４８（１）：５１－５６．
［１２］ ＹＯＫＯＹＡＭＡ　Ｋ，ＴＡＴＥＩＳＨＩ　Ｔ．Ａ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｒｋｅｒ
ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　ｏｆ　ａ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｉｓｏｌａｔｅ　ｏｆ　ａｎ　ａｒｂｕｓｃｕｌａｒ　ｍｙｃｏｒ－
ｒｈｉｚａｌ　ｆｕｎｇｕｓ，Ｇｉｇａｓｐｏｒａ　ｍａｒｇａｒｉｔａ［Ｊ］．Ｆｅｒｍｓ　ｍｉｃｒｏｂｉ－
ｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００２，１２（２）：１７１－１７５．
［１３］ 龙良鲲，姚 青，羊宋贞，等．一株丛枝菌根真菌的形
态与分子鉴定［Ｊ］．华南农业大学学报，２００６，２７（４）：
４０－４２．
（责任编辑：冯　卫）
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　葛立傲 等　栌菊木共生丛枝菌根真菌的分离鉴定
　ＧＥ　Ｌｉ’Ａｏ　ｅｔ　ａｌ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｙｍｂｉｏｓｉｓ　Ａｒｂｕｓｃｕｌａｒ　Ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ　Ｆｕｎｇｉ（ＡＭＦ）ｉｎ　Ｎｏｕｅｌｉａ　ｉｎｓｉｇｎｉｓ　Ｓｏｉｌ