全 文 ：三色堇花粉生活力最佳测定方法的筛选
王孝鹏 ,孙晓梅＊ (1.沈阳农业大学林学院 ,辽宁沈阳 110161)
摘要 采用 4种不同染色方法及离体培养法对三色堇花粉生活力进行测定。结果显示 , I-KI染色法、醋酸洋红染色法和 TTC染色法的
测定值偏低 ,不适用于三色堇花粉生活力的测定;而过氧化物酶沉淀法的测定值与离体培养法的测定结果相近且差异不显著 ,是一种测
定三色堇花粉生活力较快捷、方便、精确的方法。
关键词 三色堇;花粉;生活力;最佳测定方法
中图分类号 S 681.9 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2008)07-02756-01
Screening of the OptimumMethod for Determining the Pollen Viability of Viola tricolor Linn
WANG Xiao-peng et al (College of Forestry , Shenyang Agricultural University , Shenyang , Liaoning 110161)
Abstract The pollen viability of Viola tricolor Linn.was determined by using 4 kinds of different staining methods and in vitro culturemethod.The re-
sults showed that the determined values by I-KI staining method , carmine acetate staining method , TTC stainingmethodwere relatively low and theywere
not suitable to determine the pollen viability of V.tricolor.The determined value by peroxidase precipitation method was close to the determination results
by in vitro culture method , without significant difference.So the peroxidase precipitation method was a kind of direct , simple and exact method for deter-
mining the pollen viability of V.tricolor.
Key words Viola tricolor Linn.;Pollen;Viability;Optimum determination method
基金项目 2004年沈阳农业大学中青年硕士生导师课题资助。
作者简介 王孝鹏(1978-),男 ,吉林通化人 ,硕士研究生, 研究方向:
园林植物遗传育种。 ＊通讯作者。
收稿日期 2007-01-11
三色堇 ,堇菜科 ,堇菜属多年生草本植物 ,常作 2年生栽
培 ,在北方做 1年生栽培[ 1] 。在其杂交制种和不育系繁殖过
程中 ,父本花粉的产量及其质量是确定群体种植比例的主要
依据之一[ 2] 。有关花粉生活力测定方法 ,在许多植物上分别
有采用一种或几种方法的报道[ 3] 。目前国内测定的方法主
要有室内形态测定法 、染色法(包括 I-KI 染色 、醋酸洋红染
色 、TTC染色和过氧化物酶沉淀法等)、离体萌发测定和田间
授粉测定。但是其中室内形态测定法测出的有活力花粉的
比率要比实际值偏高。而田间授粉测定虽结果直观 ,但表现
历期长 ,费工费时不利于生产[ 4-6] 。笔者采用 I-KI染色法 、
醋酸洋红染色法 、TTC染色法 、过氧化物酶沉淀法 、培养基离
体萌发法对三色堇花粉生活力进行测定 ,以期筛选出最佳测
定方法 ,为三色堇大规模制种和贮藏花粉的生活力鉴定提供
可靠依据[ 7-10] 。
1 材料与方法
1.1 试验材料 从山西和北京园艺公司购买的 17个优良三
色堇品种及其自交后代中选择 LRR(丽人红)、STR(神童红)
和LRX(丽人猩红)3个品种 ,于上午 8:00左右采摘已开花尚
未散粉的三色堇花供测定用。
1.2 试验方法
1.2.1 I-KI染色法。取现采的花药 ,置于载玻片上 ,滴 1小
滴 I-KI(0.1%)溶液;轻轻挤压花药 ,涂于载玻片上 ,盖上盖玻
片;迅速在显微镜下观察 ,有活力的花粉被染成蓝色。
1.2.2 醋酸洋红染色法。取现采的花药 ,置于载玻片上 ,滴
1滴醋酸洋红溶液;轻轻挤压花药 ,置于载玻片上;盖上盖玻
片 ,片刻后在显微镜下观察。有活力的花粉被染成红色。
1.2.3 TTC染色法 。取现采的花药适量放在一个小玻璃皿
内 ,加入适量TTC溶液 ,轻轻挤压花药 ,使花粉粒散在 TTC溶
液中 ,放在 25 ℃恒温箱中 15 min ,然后在显微镜下观察。有
活力的花粉被染成红色。
1.2.4 过氧化物酶沉淀法。首先将以下试剂配好:①0.5%
联苯胺 ②0.5%α-萘酚③0.25%碳酸钠④0.3%过氧化氢 。试
验前再将溶液①、②、③各 10ml混合成试剂 I ,溶液④为试剂
Ⅱ。在干洁载玻片上放少量现采的花粉 ,然后加试剂 I 、Ⅱ各 1
小滴 ,搅匀后盖上盖玻片。30 ℃条件下 10min后在低倍显微
镜下观察。有活力的花粉被染成为红色。
1.2.5 离体萌发测定法 。利用 35%蔗糖 ,200 mg/L硼酸的
液体培养基培养花粉 ,把新鲜的花粉点涂在培养液中;放在
黑暗 、恒温 25 ℃条件下保湿培养4 h;然后在光学显微镜下观
测萌发情况 ,以花粉管长度超过 1/2花粉直径的为有活力的
萌发花粉[ 11] 。
1.2.6 综合比较试验。将新鲜花粉分别按照 5种方法测定
花粉生活力 ,每处理 3个重复 ,每重复观察 10个视野 ,取平均
值计算。
2 结果与分析
试验结果表明 ,离体萌发法应用于 LRR 、LRX的测定值
较高 ,而 STR的测定值较低 ,表明花粉的离体萌发除受培养
基和培养条件(温度)的影响外 ,品种间也有差异(表 1)。综
合 4种染色方法和离体萌发法在 3种三色堇品种上的应用
效果 ,挑选了LRX作为目标分析材料作进一步的统
表1 三色堇花粉生活力测定结果
Table 1 Determination results of pollen viabil ity of V.tricolor
测定方法
Determination method
有活力花粉比率
Ratio of viable pollen
LRR STR LRX
醋酸洋红染色法 4.63 aA 4.78 aA 5.03 aA
Acetic carmine method
TTC染色法TTC method 2.36 aA 2.56 aA 2.68 aA
I-KI染色法 I-KI method 5.12 aA 5.89 aA 5.93 aA
过氧化特酶沉淀法 78.96 bB 66.46 bB 79.65 bB
POD deposit method
离体萌发法 77.02 bB 56.88 bB 76.10 bB
In vitro germination method
注:不同小写字母表示在 0.05水平上存在差异 ,不同大写字母表示在
0.01水平上存在差异。
Note:Different lowercase letters and capital letters denote signif icant ly diff erent
at 0.05 and 0.01 level , respectively.
(下转第 2769页)
安徽农业科学 , Journal of Anhui Agri.Sci.2008, 36(7):2756, 2769 责任编辑 庆 责任校对 马君叶
DOI :10.13989/j.cnki.0517-6611.2008.07.098
输精管尾端 ,先排出管内的空气 ,再在精瓶底部扎一小孔 ,将
拇指放在孔上以控制输精速度 ,时间 3 ～ 10 min。精液不下
时 ,可按摩母猪阴户或大腿内侧 。输精结束后 ,将输精管尾
段打折插入输精瓶内 ,以防精液倒流。
1.5 统计方法
情期受胎率=母猪受胎数(35 d)母猪情期配种总数 (1)
受胎猪分娩率=分娩母猪数/受胎母猪数 (2)
窝产活仔数为实际窝产活仔数的平均数[ 6] 。
2 结果与分析
采用人工授精方法 ,共配种母猪 323头次 ,情期受胎率
84.2%,受胎母猪分娩率 90.8%,平均窝产活仔数 10.3头;对
照组本交共配种母猪 156头次 ,情期受胎率 82.7%,受胎母
猪分娩率 91.0%,平均窝产活仔数 10.2头。由此可知 ,人工
授精与母猪本交生产效果间差异不明显 ,表明采用人工授精
技术完全可以达到本交的生产水平。
3 小结与讨论
3.1 影响人工授精效果的原因
3.1.1 公猪因素。公猪精液品质是影响母猪情期受胎率和
产仔数的直接原因。当精液中死精率超过 20%或活率低于
0.7时 ,母猪受胎率和产仔数就会受到影响[ 7] 。无论精液是
否保存过 ,在使用前均要做品质检查。另外 ,输精时精液的
保管也很重要 ,尤其在炎热的夏季或寒冷的冬天 。若精液瓶
在外界裸露时间过长 ,则会受热冷应激的影响而使得精液品
质下降。所以 ,若精液数量较大 ,则最好用泡沫箱盛放 ,夏天
放冰 ,冬天注意保暖。
3.1.2 母猪因素。
3.1.2.1 母猪体况。母猪断奶后过肥或过瘦会导致发情不
明显 ,即使发情后输了精也容易返情;母猪日粮中部分营养
物质缺乏 ,易造成胚胎早期死亡 ,最终导致返情或产仔数少。
因此 ,配种前应注意母猪的体况调节。
3.1.2.2 母猪疾病。若母猪患有乙型脑炎 、巴氏杆菌等疾
病 ,则输精后易返情 ,即使受胎也易造成胚胎早期死亡;若母
猪患有隐性子宫内膜炎 ,则无论怎样输精都不会受胎。因
此 ,患病母猪应先治疗 ,痊愈后方可输精 。
3.1.3 人为因素 。①观察发情不准确 ,难以做到适时配种;
②器械的清洗和消毒不严格;③输精时间过短 ,导致精液倒
流 ,致使母猪配后返情较多 ,产仔数少;④输精后母猪若马上
卧下 ,则精液容易倒流 ,影响人工授精效果 ,因此输精完毕
后 ,应拍打一下母猪臀部 ,使其保持站立 。
3.1.4 其他因素。除了上述因素外 ,天气 、温度[ 8] 、饱暖情
况 、输精管的使用[ 9] 、种猪品种等在一定程度上也影响人工
授精的效果。
3.2 当前人工授精技术在猪场中的应用 人工授精技术在
现代化猪场已得到广泛使用 ,并且在提高受精率和产仔数 、
降低饲料成本等方面获得了显著的经济效益。而该技术在
中小规模猪场却尚未普及 ,其主要难点在于精液的保管以及
配种时间的确定[ 10] 。为此 ,应将生产管理与人工授精结合
起来。在引进人工授精技术的初期 ,可从一次本交和 1 ～ 2
次人工授精的配种方式逐步过渡到全部采用人工授精技术 ,
以防止产仔数的下降。
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(上接第 2756页)
计分析 。统计分析结果表明 ,与离体萌发法相比 , I-KI染色
法 、醋酸洋红染色法 、TTC 法的测定值明显偏低 ,差异达极
显著 ,均不适合三色堇花粉生命力的测定。而过氧化物酶
沉淀法的测定值与离体萌发法的测定结果十分相近 ,两者
差异不显著 。表明过氧化物酶沉淀法更为准确 ,是三色堇
花粉生活力测定中最理想的测定方法。
3 讨论
(1)I-KI染色法 、醋酸洋红染色法和 TTC 染色法的测定
结果偏低 ,不适用于三色堇花粉生活力的测定 ,这主要是由
于三色堇的花粉壁较厚 ,染色物质不容易进入造成 。
(2)过氧化物酶沉淀法与离体萌发法相比 ,表现出对三
色堇花粉快速 、准确地染色效果 ,故可认为其是测定三色堇
花粉生活力的最佳染色方法 。
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