全 文 ：孑遗植物水松不同年龄级种群遗传
多样性的 ISSR分析*
吴则焰
1
刘金福
2＊＊
洪 伟
2
潘东明
3
郑世群
2
何中声
2
(1福建农林大学生命科学学院，福州 350002;2福建农林大学林学院，福州 350002;3福建农林大学园艺学院，福州 350002)
摘 要 按胸径将福建省屏南水松(Glyptostrobus pensilis)种群划分为成树、小树、幼苗 3 个
年龄级，利用 ISSR分子标记对不同年龄级的水松遗传多样性及遗传结构进行分析，旨在揭
示其不同世代间遗传多样性的变化规律，为水松资源有效保护提供科学依据。用 10 条随
机引物共检测到 83 个扩增位点，其中多态位点 32 个，多态位点百分率(P)为 38． 55%。同
其他濒危裸子植物相比，水松具有较低的遗传多样性。不同年龄级的遗传多样性差别较
大，P、Nei基因多样度(He)、Shannon信息指数(I)均以成树最高，小树次之，幼苗最低，表明
水松种群遗传多样性世代间呈现衰退趋势。分子方差分析(AMOVA)表明，水松种群不同
年龄级内、年龄级间均存在遗传变异，但遗传变异主要存在于年龄级内。不同年龄级间的
遗传分化系数(Gst)为 0． 2872，基因流(Nm)仅 0． 6204，遗传相似度以幼苗和小树最高。基
于水松种群遗传学和生态学的研究结果，提出应加大对遗传多样性高的水松种群保护力
度，加强水松种群基因交流，以最大限度地保存水松资源的遗传多样性。
关键词 水松;年龄级;遗传多样性;遗传分化;ISSR
* 福建省自然科学基金项目(2009J01053)资助。
＊＊通讯作者 E-mail:fjljf@ 126． com
收稿日期:2012-02-10 接受日期:2012-05-12
中图分类号 Q16;Q347 文献标识码 A 文章编号 1000 － 4890(2012)8 － 1911 － 06
Genetic diversity of different life-stage population of Glyptostrobus pensilis，an endangered
plant in China:ISSR analysis． WU Ze-yan1，2，LIU Jin-fu2＊＊，HONG Wei2，PAN Dong-
ming3，ZHENG Shi-qun2，HE Zhong-sheny2 (1College of Life Science，Fujian Agriculture and
Forestry University，Fuzhou 350002，China; 2College of Forest，Fuzhou 350002，China;
3College of Horticulture，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002，China)．
Chinese Journal of Ecology，2012，31(8) :1911 － 1916．
Abstract:Glyptostrobus pensilis is a rare and endangered species in China，but few studies have
been made on the conservation genetics of this species． In this study，the G． pensilis population
in Pingnan of Fujian Province，East China was divided into 3 life stages，i． e．，adult，juvenile，
and seedling，according to the size class，and the genetic diversity and genetic differentiation of
different life stage G． pensilis were investigated by using inter-simple sequence repeat (ISSR)
markers． Ten ISSR primers were used to amplify 72 individuals in the population，and 83 dis-
cernible DNA fragments were produced，of which，32 were polymorphic loci (the percentage of
polymorphic loci (P) = 38． 55%) ，suggesting the low level genetic diversity of the population．
The difference of the genetic diversity among the life stages was evident． Adult had the highest
P，Nei’s gene index (He) ，and Shannon information index (I) ，followed by juvenile，and
seedling，suggesting that the genetic diversity among the life stages presented a declining trend．
The analysis of molecular variance (AMOVA)showed that the genetic diversity might exist within
and among the life stages，mainly within the life stages． Moreover，the genetic differential index
(Gst)among the life stages was 0． 2872，while the gene flow (Nm)was 0． 6203． The genetic
identity between seedlings and juveniles was the highest． Based on the analysis of population
genetic structure and the community investigation，it would be necessary to establish a conserva-
生态学杂志 Chinese Journal of Ecology 2012，31(8) :1911 － 1916
tion site in the optimal habitat of G． pensilis and to cross-transplant adult plants and seedlings
mutually to enhance the gene flow． By this means，the genetic diversity resources of the species
could be preserved to the greatest extent．
Key words:Glyptostrobus pensilis;life stage;genetic diversity;genetic differentiation;ISSR．
物种的遗传结构包括空间和时间两个方面。植
物遗传结构研究，目前主要以单一世代种群为研究
对象来探讨空间尺度上的遗传变异，往往忽略了时
间尺度上的种群世代更替，不能全面揭示植物遗传
多样性(李建辉等，2010)。植物种群亲代受到遗传
漂变、瓶颈效应和人为干扰等诸多因素影响，必将影
响其后代遗传结构，因此，通过种群不同世代遗传结
构比较研究才能准确反映种群整体遗传多样性
(Ying ＆ Ting，2009)。近年来，一些学者(陈小勇和
宋永昌，1999;黎中宝和林鹏，2001;金则新和李钧
敏，2004;张恒庆等，2004;王峥峰等，2005;高三红
等，2005a，2005b;邵丹等，2007;李建辉等，2010) ，采
用世代分析方法对不同树种开展遗传多样性研究取
得了突出成果。通过分析植物种群遗传变异的时间
动态，揭示种群不同阶段的遗传特征，对于预测种群
的发展趋势具有重要作用。
水松(Glyptostrobus pensilis) ，别名水帝松，水杉
松等，杉科水松属，是我国特有的单种属植物，国家
一级保护树种。水松作为古老的“活化石”植物，在
中生代时期曾广泛分布于北半球。第四纪冰期以
后，由于自然地理因素和人为活动的影响，欧洲、北
美、东亚及我国东北等地的水松种群均已灭绝，现仅
零星残存于我国南方的广东、广西、福建、江西等省
份，处于高度濒危状态，被世界保护监测中心列为稀
有种，中国植物红皮书列为濒危树种。水松在研究
杉科植物的系统发育、古植物学和第四纪冰川气候
等方面都有重要的科学价值，其濒危状况受到国内
外学者高度关注。前人研究主要集中在胚胎发育学
(Takaso ＆ Tomlinson，1990)、化学组成(兰兰和马忠
武，1992)、生物学特性(韩丽娟等，1997)、形态学
(Vickulin et al．，2003)、地理分布(李发根和夏念
和，2004)、无性繁殖技术(李博等，2006)等方面，其
保护遗传学研究基本没有开展，对其遗传多样性研
究仅局限于空间尺度上(Li ＆ Xia，2005;吴则焰等，
2011) ，尚缺乏对水松种群不同年龄级遗传多样性
的研究。
ISSR(inter simple sequence repeats)即简单重复
间隔序列标记方法，具有操作简单，快速、高效、可重
复性等优点，在珍稀濒危植物遗传多样性研究中被
广泛运用并获得了成功(Cao et al．，2006;Luo et
al．，2007;Wang ＆ Zhang，2008;Chen et al．，2009)。
笔者在开展水松生态学研究基础上(吴则焰等，
2008a，2008b，2009) ，利用 ISSR 分子标记技术分析
水松种群不同年龄级的遗传多样性，旨在揭示水松
不同世代间遗传多样性的变化规律，在分子水平上
探讨其濒危机制，从而更清楚地认识水松的生存潜
力和濒危程度，可为水松资源有效保护提供理论依
据，对水松种群的恢复与繁衍具有重要意义。
1 材料与方法
1. 1 供试材料
由于水松生命周期长，难以追踪种群世代过程
来研究其遗传结构的时间动态变化，可通过不同年
龄级个体之间的遗传差异来判断，因此采用“空间
代时间”的年龄级法进行研究(李建辉等，2010)。
研究地位于福建省屏南岭下乡上楼水松林，闽东第
一高峰东峰尖北麓的一片沼泽地中(26° 58 N，
118°57E) ，属中亚热带海洋性季风气候，海拔 1208
m，年均温 11 ～ 16 ℃，年降雨量 1842. 3 mm。成片
原生天然水松群落位于山坡的狭长地段，终年有泉
水流入，枝繁叶茂，树干挺拔虬劲，群落郁闭度高达
0. 7 左右，水松为主要优势树种。周边旱地上，马尾
松(Pinus massoniana)、柳杉(Cryptomeria fortunei)等
植被环绕生长。水松种群平均树高 15. 2 m，平均胸
径 40. 1 cm，最大一株高达 17 m，胸径 76 cm。林下
土壤类型主要是暗红壤，土层比较厚，水肥条件优
越，通风透气性良好。地面植被以铺地黍(Panicum
repens)和画眉草(Eragrostis pilosa)为主，伴生树种
以马尾松和柳杉为主。据专家考证是中国仅有、面
积最大原生天然水松林，被誉为“植物活化石群”。
按照传统野外调查方法，对研究地内所有水松
植株个体进行每木调查。根据王伯荪等(1995)提
出的年龄级划分方法，将水松个体按照胸径(DBH)
大小分组，胸径 ＞ 7. 5 cm为成树;胸径 2. 5 ～ 7. 5 cm
为小树;胸径 ＜ 2. 5 cm为幼苗。由于种群内水松个
体数量有限，3 个龄级共采集到 72 株个体，其中幼
2191 生态学杂志 第 31 卷 第 8 期
苗 12 株，小树 18 株，成树 42 株。采集当年生嫩叶
置于密封袋中，硅胶干燥保存后带回实验室 － 40℃
保存。
1. 2 研究方法
1. 2. 1 DNA提取及纯度检测 取水松嫩叶 0. 5 g，
用液氮冷冻、研碎后，采用改良 CTAB 法(Whittaker
et al．，1997)提取水松嫩叶总 DNA，保存于 4 ℃冰箱
中待用。用 0. 8%的琼脂糖凝胶电泳检测总 DNA
质量，用紫外分光光度计(UV-1600)检测其浓度。
1. 2. 2 ISSR扩增及扩增产物检测 用加拿大哥伦
比亚大学(UBC)提供序列，上海生工公司合成的
ISSR引物，在 20 μl 反应体系中进行扩增筛选。从
100 个引物中筛选出扩增条带较多、信号强、背景清
晰的 10 个引物(811、813、815、840、841、856、857、
872、873 和 880)用于 PCR扩增(表 1)。20 μl 反应
体系为:2 μl 10 × Buffer(10 mmol·L －1 Tris-HCl pH
9. 0，50 mmol·L －1 KCl) ，1. 5 mmol·L －1 MgCl2，0. 1
mmol·L －1 dNTPs，200 mmol·L －1 Primer，1. 5 U Taq
DNA聚合酶，20 ng μl － 1模板 DNA。扩增程序:最初
94 ℃预变性 5 min，然后进行 35 个循环，每循环包
括 94 ℃变性 30 s、48 ～ 53 ℃退火(退火温度随引物
而定)45 s、72 ℃复性 1. 5 min，最后 72 ℃延伸 10
min，将扩增产物置于 4 ℃冰箱内保存。PCR 反应
在德国 BIOMETRA T-Gradient 型热循环仪上进行，
PCR产物用 1. 5%琼脂糖凝胶电泳分离，后经溴化
乙锭染色，以 DL2000Marker 作为分子量标准，Gene
Genius公司的 Bio Imaging System成像分析。
1. 2. 3 数据处理 采用人工计带法，判读电泳图谱
中扩增产物的有无及其分子量大小。对于同一引物
的扩增产物，迁移率相同的条带记为一个位点，扩增
阳性赋值为“1”，阴性赋值为“0”，构成表型数据矩
阵。采用 POPGENE 3. 2(Yeh et al．，1997)软件对进
行遗传参数分析，分别计算多态性位点比率(P)、
Shannon信息指数(I)、Nei基因多样度(He)、遗传
表 1 用于水松种群 ISSR分析的引物序列
Table 1 Sequences of 10 primers used in ISSR analysis of
Glyptostrobus pensilis population
引物编号 序列
(5’－3’)
退火温度
(℃)
引物编号 序列
(5’－3)
退火温度
(℃)
UBC811 GA(8)C 56. 4 UBC856 AC(8)YA 54. 6
UBC813 CT(8)T 51. 0 UBC857 AC(8)YG 53. 4
UBC815 CT(8)G 53. 4 UBC872 GATA(4) 52. 6
UBC840 GA(8)YT 54. 9 UBC873 GACA(4) 53. 1
UBC841 GA(8)YC 55. 8 UBC880 GGAGA(3) 52. 6
分化指数(Gst)、年龄级间的遗传相似度(S)和遗传
距离(D) ，采用 AMOVA 1. 55 软件分析遗传变异在
年龄级内和年龄级间的分布(Excoffier et al．，1992;
Agostini et al．，2008)。
2 结果与分析
2. 1 水松种群不同年龄级的遗传多样性
对不同年龄级的水松样品进行 PCR扩增，均有
扩增产物且效果良好，其中引物 UBC813 对部分水
松植株 DNA样品的扩增结果见图 1。
10 个引物共扩增出 83 条重复性高、清晰的条
带，平均每个引物扩增出 8. 3 条带。其中多态性条
带 32 条，多态位点百分率(P)为 38. 55%。水松不
同年龄级遗传多样性分析表明(表 2) ，3 个年龄级
的多态位点百分率(P)介于 31. 39% ～ 36. 84%，平
均值为 33. 96%。可见，不同年龄级的多态位点百
分率明显低总多态位点百分率，且从成树、小树到幼
苗，多态位点百分率呈逐渐下降的趋势。Nei 基因
多样度(He)变化范围在 0. 1438 ～ 0. 1579，平均值为
0. 1507;Shannon信息指数(I)变化范围在 0. 2039 ～
0. 2486，平均值为 0. 2216。虽然 Nei 基因多样度
(He)低于 Shannon 信息指数(I) ，但二者反映的水
松种群不同年龄级遗传多样性高低顺序是一致的，
即成树 ＞小树 ＞幼苗。
2. 2 水松种群不同年龄级的遗传分化
从水松种群不同年龄级的遗传分化(表3)可
图 1 引物 UBC813 扩增水松种群 20 个植株基因组 DNA
的 ISSR电泳图
Fig． 1 ISSR profiles of 20 individuals of Glyptostrobus pen-
silis with primer UBC813
表 2 水松种群不同年龄级的遗传多样性
Table 2 Genetic diversity of different life stages of Glyp-
tostrobus pensilis based on ISSR marker
年龄级 个体数 多态位点
百分率(P，%)
Nei基因多
样度(He)
Shannon信息
指数(I)
幼苗 12 31. 39 0. 1438 0. 2039
小树 18 33. 65 0. 1504 0. 2124
成树 42 36. 84 0. 1579 0. 2486
平均 24 33. 96 0. 1507 0. 2216
合计 72 38. 55 0. 1631 0. 2477
3191吴则焰等:孑遗植物水松不同年龄级种群遗传多样性的 ISSR分析
表 3 水松种群不同年龄级的遗传分化
Table 3 Genetic differentiation of different life stages of
Glyptostrobus pensilis population
Shannon信息
指数(I)
遗传分化
系数(%)
Nei基因多样度
(He)
遗传分化
系数(%)
年龄级内遗传
多样性 Hpop
0. 2216 年龄级内基因多样性
Hs
0. 1507
年龄级总的遗传
多样性 Hsp
0. 2956 年龄级总的基因多样
性 H t
0. 2114
年龄级内遗传多样性
所占比值 Hpop /Hsp
0. 7496 年龄级内遗传多样性
所占比值 Hs /H t
0. 7128
年龄级间遗传多样性所
占比值(Hsp － Hpop)/Hsp
0. 2504 遗传分化系数 Gst 0. 2872
表 4 水松种群年龄级内和年龄级间遗传变异的 AMOVA
分析
Table 4 Analysis of molecular variance (AMOVA)within
and among life stages of Glyptostrobus pensilis population
变异来源 自由度
df
总方差
SSD
平均方差
MSD
变异百
分率 (%)
P
年龄级间 2 189. 7532 94. 8766 28. 16 ＜ 0. 001
年龄级内 69 496. 2154 7. 1915 71. 84 ＜ 0. 001
知，由 Shannon信息指数(I)估算的水松种群不同年
龄级总遗传变异中，25. 04%的遗传变异存在于年龄
级间，74. 96%存在于年龄级内，表明水松种群遗传
变异主要发生在年龄级内。Nei基因多样度(He)估
算的年龄级间基因分化系数 Gst为 0. 2872，由 Gst估
算的年龄级间的基因流 Nm为 0. 6204。AMOVA 分
析结果(表 4)表明，在总的遗传变异中，有 28. 16%
的变异发生在年龄级间，年龄级内遗传变异占总遗
传变异的 71. 84%，年龄级内和年龄级间变异均极
显著(P ＜ 0. 001)。不同年龄级遗传分化程度表明，
水松种群年龄级间存在一定程度的遗传分化，但年
龄级内变异在其遗传变异中占主导地位。
2. 3 水松种群不同年龄级间的遗传距离
为进一步分析水松不同年龄级间的遗传关系，
计算了 Nei遗传一致度(S)和遗传距离(D) (表 5)。
从表 5 可以看出，S 值的变化范围为 0. 9417 ～
0. 9628，表明水松不同年龄级间的相似程度较高，其
表 5 水松种群不同年龄级间的 Nei遗传一致度(S)和遗传
距离(D)
Table 5 Genetic identity (S)and genetic distance (D)
among different life stages of Glyptostrobus pensilis popula-
tion
年龄级 幼苗 小树 成树
幼苗 － 0. 9628 0. 9417
小树 0. 0372 － 0. 9501
成树 0. 0583 0. 0491 －
右上角数据为遗传一致度，左下角数据为遗传距离。
中幼苗与小树的遗传相似度最高，达到 0. 9628。D
值的变化范围为 0. 0372 ～ 0. 0583，平均遗传距离 D
为 0. 0482，表明水松不同年龄级间的遗传距离较
小，其中幼苗与小树的遗传距离最小，仅为 0. 0372。
利用 Mantel检验进行相关分析，结果显示相关系数
为 0. 9587，达到极显著水平(P ＜ 0. 01)。
3 讨 论
3. 1 水松种群不同年龄级的遗传多样性
利用 ISSR标记对水松种群不同年龄级遗传多
样性分析，结果表明 3 个年龄级的多态位点百分率
(P)介于 31. 39% ～ 36. 84%，平均值为 33. 96%。
与其他珍稀濒危裸子植物研究数据相比较，水松种
群 P值远低于资源冷杉(Abies ziyuanensis)77. 78%
(张玉荣等，2007)、银杏(Ginkgo biloba)70. 45%(Ge
et al．，2003)、南方红豆杉(Taxus mairei)51. 16%
(张宏意等，2003)、元宝山冷杉(Abies yuanbaos-
hanensis)50. 24% (王燕等，2004)和水杉(Metase-
quoia glyptostroboides)38. 62%(李晓东等，2003)、银
杉(Cathaya argyrophylla)32. 18% (Tian et al．，
2008)相近;He和 I 也明显低于资源冷杉(He =
0. 2344、I = 0. 3764)、银杏(He = 0. 2508、I =
0. 3599)。P、I和 He均显示，水松遗传多样性成树最
高，小树次之，幼苗最低。可见，水松种群不同年龄
级的遗传多样性均处于较低水平，且从成树到幼苗，
遗传多样性逐渐下降。这一现象与其他学者针对不
同树种研究结论相符:如高三红等(2005a，2005b)
发现鼎湖山厚壳桂(Cryptocary aconcinna)不同年龄
级遗传多样性呈现幼苗、小树、成树递增现象;李建
辉等(2010)发现长叶榧种群不同年龄级内、年龄级
间均存在遗传变异，其种群遗传变异呈衰退趋势。
究其原因，可能是生境片断化造成遗传多样性衰退。
本研究所选择的水松 3 个不同年龄级，在世代上虽
不是连续的，但可代表水松 3 个生活史阶段。水松
属于长寿树种，多数野生个体年龄在数百年以上，成
树遗传多样性受到生境片断化的影响较小。由于人
类活动的干扰，加剧了水松分布区的生境片断化，导
致水松繁殖后代的遗传多样性来源于个体生长繁殖
占优势的少数亲代，由此后代产生遗传瓶颈;同时，
由于生境片断化造成种群中水松个体数量减少，加
剧了遗传漂变和近交作用，导致后代遗传多样性持
续降低，从而造成不同年龄级的遗传多样性从成树
到幼苗逐渐降低。
4191 生态学杂志 第 31 卷 第 8 期
3. 2 水松种群不同年龄级的遗传结构
利用 I 和 He估算水松种群不同年龄级的遗传
分化，得到的结果虽然略有差异，但均表明年龄级内
的遗传变异大于年龄级间。从总体上看，水松种群
不同年龄级的基因分化系数 Gst为 0. 2872，远小于不
同种群间的遗传分化系数 Gst = 0. 3982(吴则焰等，
2011)。虽然水松种群时间遗传分化程度小于空间
遗传分化，但 AMOVA 分析表明水松种群不同年龄
级内、年龄级间均存在遗传变异且达到极显著水平，
该结论与美国皂荚(Gleditsia triacanthos) (Schnabel
＆ Hamrick，1990)、北美黄松(Ponderosa pine) (Lin-
hart et al．，1981)的研究结果相类似。陈小勇等
(1999)认为，以不同年龄级个体间遗传组成差异的
形式表现出的时间遗传分化，可能是不同年份交配
格局以及繁殖个体变化所致，或者是由于不同年龄
级个体之间存在的一些选择作用相异之故。对于水
松而言，其生物学特性和种群较低的基因流可能是
导致遗传分化的重要原因。水松生殖花期短，球果
包含种子数量少，花粉、种子的扩散和传播能力差，
繁殖系统中花粉与种子较低的迁移能力降低了基因
交流的可能性，种群年龄级间的 Nm仅为 0. 6204;且
水松种子野外不易萌发，幼苗成活率低，导致有效种
群规模不断减小，近交衰退加剧了不同年龄级的遗
传分化。水松不同年龄级间的遗传相似度结果显
示，幼苗与小树的遗传相似度最高、遗传距离最小，
这与金则新等(2004)对七子花(Heptecodium mico-
nioides)的研究结论相符。其原因除不同年龄级个
体出现了遗传衰退外，还可能与生境片断化和人为
干扰有关。生境片断化使得水松个体分布不连续，
片断化生境中只有少数几个母树，而小树和幼苗大
部分来源于少数几株母树，造成小树和幼苗遗传相
似度较高、遗传距离较小。
3. 3 水松资源保护思考
水松个体数量稀少，野外调查仅采集到 3 个年
龄级共 72 株个体，可能无法充分代表种群各世代遗
传多样性。尤其是幼苗和小树样本数量偏少，采样
量不足可能造成研究结果偏差。因此，在后续研究
中，十分有必要加大采样量，同时采用共显性遗传标
记等来进行深入研究。但水松野生资源匮乏，形成
规模的种群数量极少，给采样工作带来了较大困难。
面对生境人为破坏严重、遗传多样性较低、基因交流
受限的现状，保护珍贵的水松资源已势在必行。
珍稀濒危植物的遗传多样性研究是保护生物学
的核心问题之一。运用分子标记技术研究濒危物种
恢复种群的遗传多样性及遗传变异规律，对实现物
种的有效保护具有重要意义(Hutchison ＆ Temple-
ton，1999;Nybom ＆ Bartish，2000;Ying ＆ Ting，
2009)。因此，运用种群遗传学原理开展水松恢复
保护显得尤为必要。对水松自然种群以就地保护为
主，选择遗传多样性水平较高、适宜水松生长的集中
分布区建立自然保护区。对自然种群内的个体进行
相互移栽和采种育苗移栽，人为提高种群的基因交
流，最大限度地保护水松的遗传多样性。另一方面，
迁地保护作为增强种群间基因交流的重要手段，能
使其种群有效得以保存和恢复，应考虑水松生长适
宜的环境条件，尽可能从不同地方更广泛地收集、保
护各种水松种质资源，尤其加强来自某些特定优树
种源的人工种群保护，扩大种群的异质性，增加遗传
变异水平和促进基因交流，避免遗传多样性的丧失。
参考文献
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作者简介 吴则焰，男，1983 年生，博士，讲师。主要从事森
林生态学和植物分子生态学研究，发表论文 13 篇。E-mail:
wuzeyan0977@ 126． com
责任编辑 王 伟
6191 生态学杂志 第 31 卷 第 8 期