全 文 ：植物冻害和氧化胁迫 ———甘蓝叶冻2融
循环中超氧的产生 3
靳月华 3 3 　陶大立　杜英君　(中国科学院沈阳应用生态研究所 ,陆地生态过程重点实验室 ,沈阳 110016)
【摘要】　为检验植物冻害的发生和氧化胁迫这一假说 ,在冰冻前把氮蓝四唑 (NB T) 真空渗入到甘蓝叶圆
片中. 在叶圆片冻2融循环中 NB T 被还原为甲 　. 把其中的单甲 　用乙醇提取出来 ,在分光光度计上比色 ,
可作为冻2融循环中产生的氧化胁迫的定量指标. NB T 本身作为氧化剂 ,使冻害稍有增加. 作为冰冻保护
剂的二甲基亚砜真空渗入叶圆片使其抗冻性显著增加 ,而 NB T 还原则显著减少 ,表明二甲基亚砜在保护
叶组织免受冻害上的作用和它减缓植物组织氧化胁迫的作用有关. 实验结果支持植物冻害的发生和氧化
胁迫有关这一假说. 实验还表明还原 NB T 的还原剂很可能是超氧阴离子自由基.
关键词 　氧化胁迫 　冻害 　NB T 还原 　甘蓝
文章编号 　1001 - 9332 (2002) 12 - 1555 - 04 　中图分类号 　Q945. 78 　文献标识码 　A
Freezing injury of plant and oxidative stress - Superoxide generation in freeze2tha w cycles of Cabbage leaf tis2
sues. J IN Yuehua , TAO Dali ,DU Yingjun ( Key L aboratory of Terrest rial Ecological Process , Institute of A p2
plied Ecology , Chinese Academy of Sciences , S henyang 110016) . 2Chin. J . A ppl . Ecol . ,2002 ,13 (12) :1555～
1558.
To test the hypothesis that oxidative stress is involved in inducing freezing injury of plants ,nitroblue tetrazolium
(NB T) was infiltrated into cabbage leaf tissues before they were frozen. NB T was reduced to formazans in
freeze2thaw cycles. The ethanol2extractable mono2formazan was measured by a spectrophotometer ,and used as a
quantitative indicator of oxidative stress that developed during a freeze2thaw cycle. NB T per se as an oxidant in2
creased the freezing injury slightly. When Me2 SO as a cryoprotectant was infiltrated into leaf tissue ,it apparently
enhanced the freezing tolerance ,and this is correlated to its ability in ameliorating oxidative stress ,as indicated by
the partial inhibition of NB T reduction. The results supported the hypothesis that freezing injury of plants is re2
lated to oxidative stress. The experiments indicated that it was possible that the reductant of NB T in the freeze2
thaw cycle was superoxide anion free radical.
Key words 　Oxidative stress ,Freezing injury , NB T reduction , Cabbage.3 国家自然科学基金资助项目 (39270073) .3 3 通讯联系人.
2002 - 07 - 26 收稿 ,2002 - 10 - 31 接受.
1 　引 　　言
我们曾观察到 : 1) 红松针叶中超氧物歧化酶
(SOD)活性在秋季上升[14 ] ;2) 沈阳的 5 种针叶树耐
冻性和仲冬时针叶的 SOD 活性相关良好[7 ] ;3) 在欧
洲赤松苗抗寒锻炼过程中 ,与 H2O2 的清除有关的
几种酶活性都呈上升趋势[17 ] ;4)松针中代表有机自
由基的电子自旋共振信号强度随冰冻温度的下降而
增加[16 ] . 这些观察导致我们认为植物冻害的发生可
能和活性氧和自由基的产生有关. 作者在文献调查
的基础上 ,总结出关于植物冻害机制已有的三个假
说 :Levitt 的巯基反应导致蛋白质变性、凝集假说 ,
Palta 等的细胞膜离子泵失活假说和 Steponkus 等的
质膜相变假说 ,并曾论证过这三个假说可以在自由
基生物学理论基础上统一起来[12 ,13 ] . 要验证这一统
一假说 ,最重要的是能在致死性冰冻过程中检测到
毒性氧自由基的产生. 但是超氧阴离子自由基
(O2 -1)和羟自由基 ( HO·)都不可能直接测定. 作者曾
用一年多的时间用 Babbs 等[2 ]介绍的二甲基亚砜
(Dimethyl2sufuloxide ,Me2 SO) 捕捉法间接测定甘蓝
叶等植物材料冻、融循环中毒性最强的 HO1 基的产
生量 ,由于过大的假象干扰而失败. 但是发现了捕捉
剂 Me2 SO 对叶组织有很强的防止冻害作用和对
NB T 还原的抑制作用. 这一发现促使我们转而采取
了用氮蓝四唑 (NB T) 还原指示“氧化爆发“(Oxida2
tive burst)的方法并取得一定成效.
已知 NB T 易被植物吸收且对植物无害[1 ] ,近
来曾被用于植物遭病菌入侵时氧化爆发的检
测[6 ,8 ] .作者自 20 世纪 80 年代起一直以对 NB T 光
还原的抑制来检测和表示植物的 SOD 活性11 ,15 ] . 为
此 ,以甘蓝叶圆片为材料 ,以氮蓝四唑盐 (Nit roblue
应 用 生 态 学 报 　2002 年 12 月 　第 13 卷 　第 12 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,Dec. 2002 ,13 (12)∶1555～1558
tet razolium ,NB T) 还原量为指标 ,研究了在冰冻过
程中叶组织所经历的氧化胁迫. Me2 SO 被用做细胞
培养物在液氮中储藏的保护剂已有很长的历史. 也
有人提出过它的冰冻保护作用和它清除 HO·的作
用有关的想法[9 ] ,但并未经过实验验证. 我们的研
究结果在一定程度上支持了这种想法.
2 　材料与方法
211 　植物材料
　　甘蓝叶球购自市场 . 外层 4～5 个叶片弃去不用 ,旨在排
除叶绿素和光合作用中与光胁迫有关的干扰 ,集中研究冰冻
胁迫. 用打孔器从内层叶片上打取直径 1. 2cm 的圆片待用.
不同批次的叶球耐冻性会有差别. 但在每个独立实验中所用
的均为来自同一批次、耐冻性相同的材料.
212 　冰冻试验
　　叶圆片置于指形管中 ,在一个液体循环制冷器中 ,在
0 ℃停留 0. 5h 后 ,开始以 2～3 ℃·h - 1的速度降温. 在达到
- 1. 5 ℃时向叶圆片表面接种冰粒 ,以保证组织结冰. 达到预
定温度后取出 ,在 0 ℃黑暗中过夜融化. 次日往指形管中加
入 7ml 蒸馏水 ,震荡 2h 后第一次测定电导 ,在 - 40 ℃将叶片
杀死后 ,回温到室温后再次测定电导 ,以此为 100 % ,计算杀
死前/ 后样品电导的比率即离子渗出率 ,作为冻害程度的指
标.预备实验表明 ,当离子渗出率低于 50 %时 ,在保湿条件
下的叶圆片可在两天内保持正常的色泽和膨胀状态. 而离子
渗出率超过 50 %的叶片则萎蔫变色. 因而将达到 50 %离子
渗出率的温度作为半致死温度. 据作者经验 ,其它许多种植
物叶片和针叶也适用这一原则.
213 　氧化胁迫测定
　　冰冻实验前将含有 0. 05 %NB T ,10μmol·L - 1 EDTA ,p H
7. 8 的磷酸缓冲液真空渗入到叶圆片中. 在冻2融循环过程中
NB T 被叶组织还原. 还原产生的单甲　用乙醇 (每个叶圆片
3ml) 在 37 ℃水浴中过夜淬取 ,温度降到室温后在波长
525nm[1 ]处进行比色. 为了解零上温度对 NB T 还原的影响 ,
在冻融实验的同时设置了室温 (约 25 ℃)对照.
214 　叶组织耐冻性和冻融循环中氧化胁迫测定
　　把 5 % (0. 7mol·L - 1)的二甲基亚砜 (Me2 SO)或 10μmol·
L - 1的 NADPH 于冰冻前真空渗入到叶组织中 ,以检验其对
抗冻性的影响. 在需要同时测定氧化胁迫时 ,则将 Me2 SO 或
NADPH 直接加入到 NB T 溶液中一起进行真空渗入.
215 　干扰实验
　　为估计叶组织中的还原剂可能对实验产生的干扰 ,在试
管中进行了 NADPH 和抗坏血酸还原 NB T 可能性的实验.
所有实验均重复 3～4 次.
3 　结果与分析
311 　NB T 还原和冻害的相关性
　　NB T 还原虽在无伤害的 0 ℃对照样品中已存
在 ,存放在室温的对照样品中为 57 ±17μmol·g - 1
FW ,约为保持在 0 ℃的样品的 1/ 2. NB T 还原随冰
冻温度的下降以及叶圆片离子渗出率的增加而增加
(图 1) . NB T 还原和离子渗出率间的相关系数达到
0. 97. NB T 本身作为一种氧化剂 ,在渗入叶片后 ,与
渗入不含 NB T 的缓冲液的样品相比 ,半致死温度从
- 3. 3 ℃上升到 - 2. 7 ℃.
图 1 　甘兰叶组织离子渗出率和 NBT还原量与冰冻处理温度的关系
Fig. 1 Ion leakage and NBT reduction of cabbage leaf tissue in relation to
freezing temperatures.
Ⅰ. 离子渗漏 Ion leakage ; Ⅱ. NBT 还原 NBT reduction.
312 　Me2SO 在防止冻害和抑制 NBT还原上的作用
　　真空渗入到叶组织中的 Me2SO 在防止和减轻
冻害上效果明显 ,且在一定程度内显示出正的剂量2
效应关系 (图 2) . 0. 6mol·L - 1的 Me2 SO 使甘蓝的半
致死温度从 - 5. 9 ℃下降到 - 11. 8 ℃. 在用其它植物
材料进行的类似实验中 ,Me2 SO 使小麦苗叶的半致
死温度从 - 10 ℃降至 - 19 ℃,菠菜从 - 9. 3 ℃降至
- 20. 1 ℃,油松针叶从 - 14 降到 - 26 ℃. 和 NB T 一
起真空渗入到甘蓝叶圆片中的 Me2 SO 使冻2融循环
中发生的 NB T 还原显著减少 (图 3) .
图 2 　Me2SO 浓度对甘蓝叶组织离子渗出率的影响
Fig. 2 Effect of Me2SO concentration on ion leakage of cabbage leaf tis2
sue.
Ⅰ. 0 mol·L - 1 ; Ⅱ. 0. 2mol·L - 1 ; Ⅲ. 0. 5mol·L - 1 ; Ⅳ. 0. 8mol·L - 1.
313 　NADPH 对冻害和 NB T 还原的影响
　　实验结果表明 ,真空渗入 NB T 的叶圆片的半致
死温度为 - 3. 0 ℃,同时渗入 NADPH 的样品半致死
温度上升为 - 2. 2 ℃,叶圆片的 NB T 还原也相应增
加 (表 1) .
6551 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　13 卷
图 3 　Me2SO 对甘兰叶组织还原 NBT 量的影响
Fig. 3 Effect of Me2SO on NBT reduction by cabbage leaf tissue in a
freeze2thaw cycle.
Ⅰ. 对照 Control ; Ⅱ. 渗 Me2SO Me2SO infiltrated.
表 1 　NADPH对甘蓝叶组织冻2融循环中 NBT还原的促进作用
Table 1 Effect of NADPH on NBT reduction in freeze2tha w cycles of
cabbage leaf tissues( %)
温度
Temperature ( ℃)
NBT alone
　
NBT + 10μM
NADPH
0 100 133 ±6
- 3 100 126 ±6
- 6 100 125 ±12
314 　抗坏血酸还原 NB T 的可能性
　　当 0. 1mmol·L - 1的抗坏血酸 (钠盐) 加入到 p H
7. 8 的 0. 05 %NB T 溶液时 ,室温下放置 4 天无 NB T
还原发生. 当加入的抗坏血酸浓度增加到 1mmol·
L - 1 ,溶液 p H 降到 6. 0 时 ,1h 后可看到指示 NB T
还原的蓝色沉淀 ;在 p H 7. 0 时 ,0. 5h 即可看到 ;在
p H 7. 0 或更高而且抗坏血酸浓度增加到 10mmol·
L - 1时 ,溶液在几分钟以内即迅速变蓝. 但值得注意
的是蓝色的 NB T 还原产物迅速沉淀 ,几小时后溶液
又归于澄清 ,且此沉淀不溶于乙醇. 在沉淀发生前经
用分光光度计扫描显示其吸收峰在 650nm 处 ,证明
此产物为双甲 　[1 ] .
4 　讨 　　论
411 　NB T 还原可作为植物冻2融循环中氧化胁迫
的定量指标
　　甘蓝叶圆片冻2融循环中 NB T 的还原表明叶组
织的某些成分被氧化. 这种氧化作用随冰冻温度的
下降和冻害程度的增加而增加 ,表明氧化胁迫随冰
冻胁迫的增加而增加. 而 NB T 的这种表现和另一种
用于测定植物组织生活力的四唑盐 TTC (2 ,3 ,52
t riphenyltet razolium chloride)的表现恰好相反. TTC
还原指示和呼吸活性有关的线粒体脱氢酶活性[11 ] .
它随冰冻温度的下降和伤害程度的增加而减少直到
完全消失. 二者有本质的不同. 这种相反的趋势使我
们断定还原 NB T 的电子主要不是来自正常的呼吸
基质而是来自其它细胞成分. 甚至在零上温度中 ,
NB T 还原也显示在 0 ℃高于室温. 这也和正常的呼
吸表现相反. 因为呼吸总是随温度上升而增加.
　　在试管实验中 ,植物组织中一种主要的抗氧化
剂2抗坏血酸要么不和 NB T 发生反应 ,要么在高浓
度和高 p H 情况下反应产生不溶于乙醇的二甲　.
在冻2融循环中的这种产物不能被乙醇提取出来而
留在了组织中. 由此可以有根据地假定被乙醇提取
的这一部分 NB T 还原产物2单甲　主要指示着呼吸
基质和内源抗氧化剂以外的细胞结构成分 ,例如膜
脂和膜蛋白等的氧化以及直接从超氧阴离子自由基
(O2 -1) 接受电子. 因此可以先不考虑 NB T 的还原剂
来源 ,而在找到更好、更直接的方法以前 ,把 NB T 还
原作为植物冻2融循环中氧化胁迫存在的证据和胁
迫强度的定量指标来使用.
412 　NB T 还原指示着 O2 -1的产生
　　在 SOD 活性测定中 ,可以用 SOD 对 NB T 还原
的抑制程度来指示 SOD 活性. 在该系统中是由细胞
色素 C + 黄素氧化酶或核黄素 + 甲硫氨酸在光照下
反应产生的 (O2 -1) [3 ]来还原 NB T 的 ,SOD 由于能特
异性地清除 ( O2 -1 ) 因而抑制 NB T 还原. 这表明
(O2 -1) 可以成为还原 NB T 的一个电子来源. 在植物
病理研究中 ,早遮 1983 年就有人用 NB T 还原来指
示 (O2 -1) 的产生[4 ] . 直到 1996 年类似方法仍在采
用[6 ,8 ] . Doke[5 ]和 Qiu 等[10 ]用不同方法证实了细胞
质膜上介导 O2 -1产生的 NADPH 氧化酶系统的存
在. 作为一种还原剂的 NADPH 竟和氧化剂 NB T 有
类似的使甘蓝的抗冻性下降的效应 ,看似相互矛盾 ,
但 NADPH 恰好为 NADPH 氧化酶提供更多用以产
生超氧的基质. 总之 ,O2 -1既有其可能来源 ,又有其
还原 NB T 的能力 ,可见在甘兰叶冻融过程中 ,NB T
的还原至少在一定程度上指示着超氧的产生.
413 　Me2SO 的冻害防御作用和防止 O2 -1产生有关
　　Me2 SO 早就用作在液氮温度 ( - 196 ℃) 下保存
培养细胞和原生质体的冰冻保护剂. 本实验证明 ,它
也可通过真空渗入的方法有效地保护叶片或针叶等
较大的植物器官免受通常见于自然界的那种冻害.
表明 Me2SO 可能有着比在实验室内更大的应用潜
力. Me2 SO 只能清除羟自由基 ( HO. ) 而对超氧阴离
子自由基 (O2 -1)并无清除作用[2 ] . Me2 SO 对 NB T 还
原的抑制 (图 3 )应是由于它以某种方式直接减少了
超氧的产生而不是在超氧产生后将其清除.
414 　NB T 还原法的局限性
　　前面已指出 ,NB T 还原产物有一部分提取不出
来 ,因此对这一部分无法定量. 此外 , NB T 还原在
755112 期 　　　　　　　　　　靳月华等 :植物冻害和氧化胁迫2甘蓝叶冻2融循环中超氧的产生 　　　　　　　　
0 ℃,甚至在室温也有发生. 这一部分反应显然和冻
害无关 ,对其发生机制也有待于进一步研究.
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作者简介 　靳月华 ,女 ,1938 年生 ,研究员 ,长期从事植物抗
逆 ,尤其是植物抗冻性和自由基生物学研究 ,发表论文数十
篇.
8551 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　13 卷