全 文 ：Vc 二步发酵中的微生物生态调控 3
周　彬1 3 3 　李　义1 　刘耀平1 　张忠泽1 　朱可莉2 　廖德明2 　高永涛2
(1 中国科学院沈阳应用生态研究所 ,沈阳 110016 ;2 东北制药总厂 ,沈阳 110026)
【摘要】　研究了 Vc 二步混合菌发酵中氧化葡萄糖酸杆菌与巨大芽孢杆菌的生长和相互作用. 结果表明 ,
2 株混合菌在发酵中可形成一种协同共生 ,促进 22酮基2L2古龙酸产生 ;二菌协同共生的过程及条件不同 ,
促进产酸能力亦不同. 环境因子影响二菌协同共生. 优化环境因子可显著改善二菌协同共生效率 ,并提高
醇酸发酵转化率.
关键词 　混菌培养 　氧化葡萄糖酸杆菌 　巨大芽孢杆菌 　协同共生
文章编号 　1001 - 9332 (2002) 11 - 1452 - 03 　中图分类号 　Q939 　文献标识码 　A
Microbiological eco2regulation in Vc two2step fermentation. ZHOU Bin1 , L I Yi1 , L IU Yaoping1 , ZHAN G
Zhongze1 ,ZHU Keli2 ,L IAO Deming2 , GAO Yongtao2 (1 Institute of A pplied Ecology , Chinese Academy of Sci2
ences , S henyang 110016 ;2 Northeast Pharm aceutical Factory , S henyang 110026 ) . 2Chin. J . A ppl . Ecol . ,
2002 ,13 (11) :1452～1454.
The growth and interaction of Gluconobacter oxydans and B acillus megaterium in Vc two step fermentation
have been studied. The results showed that there is a kind of coordinate symbiosis between G. oxydans and B .
megaterium during the fermentation ,which could promoted 22Keto2L2gulonic acid (2 KGA) symthesis. The ef2
ficiency on the synbiosis would vary as the conditions of fermentation were different and were improved by the
environmental factors.
Key words 　Mixed culture , Gluconobacter oxydans , B acillus megaterium , Coordinate symbiosis.
3 3 沈阳市重大科技攻关资助项目 (20021001200) .3 通讯联系人.
2001 - 07 - 17 收稿 ,2002 - 01 - 07 接受.
1 　引 　　言
在维生素 C 二步混合菌发酵过程中 ,氧化葡萄
糖酸杆菌 ( Gl uconobacter oxydans) 和巨大芽孢杆菌
( B acill us megateri um ) 之间既有共生作用 ,又有拮
抗作用 ,有多种因子影响二菌间的相互作用. 种液的
混菌组成及状态对发酵效果有显著影响[4 ] ,发酵前
期菌群状态影响整个发酵过程[1 ] . 巨大芽孢杆菌的
胞内液和胞外液可以促进氧化葡萄糖酸杆菌的生长
和产酸代谢[2 ] . 发酵环境因子的改变会影响二混合
菌的协同共生 ,进而改变发酵特性和效率[6 ] . 但对
二菌间的相互作用机理以及环境因子的影响规律还
未作过全面探讨. 为揭示环境因子对发酵的影响机
理 ,本文系统地监测了发酵过程中的微生物随环境
的变化而变化的过程 ,在细胞和酶学水平上对环境
因子的作用进行了研究 ,并在此基础上进行了生产
调控.
2 　材料与方法
211 　供试材料
21111 菌株 　供试用菌株为氧化葡萄糖酸杆菌 (小菌) 和巨
大芽孢杆菌 (大菌) ,菌种编号为 833225 ,由东北制药厂提供.
21112 培养基 　L2山梨糖发酵培养基见文献 [7 ] . 大菌培养基
( %) :葡萄糖 0. 2 ,玉米浆 0. 5 ,尿素 0. 1.
21113 主要试剂 　2 ,62二氯酚靛酚.
212 　测定方法
21211 2 KGA 浓度测定 　见文献 [8 ] .
21212 巨大芽孢杆菌生长曲线的测定 　将经纯化的巨大芽
孢杆菌接于大菌培养基中 ,29 ℃、180r·min - 1振荡培养 ,每
3h 取两份样 ,一份于 650nm 处测 OD 值 ,另一份置于 100 ℃
水浴中 3min ,稀释涂平皿 ,29 ℃培养 2～3d 后计数 ,以时间
为横坐标、OD 值和菌数为纵坐标绘图 ,得到生长曲线和芽
孢曲线.
21213 氧化葡萄糖酸杆菌生长曲线的测定 　将氧化葡萄糖
酸杆菌接种于发酵培养基中 , 29 ℃、180r·min - 1 振荡培养
51h ,每 3h 取样在 650nm 处测 OD 值 ,并测定 51h 时 22酮基2
L2古龙酸的含量. 以时间为横坐标 ,以 OD 值为纵坐标绘图 ,
得生长曲线.
21214 酶活性的测定 　LDH 酶活性参照 Sugisawa 等[5 ] 方
法 ; KGR 酶活性参照蒋宇扬等 [3 ]方法.
3 　结果与分析
311 　Vc 二步混合菌的培养
应 用 生 态 学 报 　2002 年 9 月 　第 13 卷 　第 11 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,Nov. 2002 ,13 (11)∶1452～1454
图 1 　巨大芽孢杆菌芽孢的形成及菌体的生长
Fig. 1 Growth of spore and cell of B . megaterium .
图 2 　氧化葡萄糖酸杆菌单独培养时的生长
Fig. 2 Growth of G. oxydans during single strain culture.
图 3 　氧化葡萄糖酸杆菌和巨大芽孢杆菌混合生长时菌量和山梨
糖、古龙酸的变化
Fig. 3 Growth of B . megaterium and G. oxydans and concentration of
L2sorbose and KGA.
Ⅰ.山梨糖浓度 L2Sorbose , Ⅱ. 古龙酸浓度 KGA , Ⅲ. 巨大芽孢杆菌
B . megaterium , Ⅳ. 氧化葡萄糖酸杆菌 G. oxydans .
31111 巨大芽孢杆菌 (伴生菌)培养 　巨大芽孢杆菌
培养 9h 进入指数生长期 ,18h 增殖达高峰 ,延至 27h
(图 1) . 在指数生长期开始有芽孢形成 ,进入衰亡期
后 ,芽孢大量形成. 同时观察到 ,随着菌体的增殖 ,培
养基 p H 值升高 ,呈碱性.
31112 氧化葡萄糖酸杆菌 (产酸菌)的培养 　葡萄糖
酸杆菌液体培养时增殖能力极弱 (图 2) . 培养近 30h
才见较低水平的增殖 ,22酮基2L2古龙酸的积累能力
很低 ,约为 2. 7mg·ml - 1 .
31113 二菌混合培养 　混合培养初期 , 伴生菌生长
加快 ,提前 6h 达到生长高峰 (图 3) . 产酸菌受伴生
菌的刺激 ,增殖能力明显加快 , 22酮基2L2古龙酸的
图 4 　氢离子对混合菌发酵体系种群生长和产酸的影响
Fig. 4 Effect of [ H + ] on growth and KGA2yielding of B . megaterium
and G. oxydans during two2step mixed fermentation.
Ⅰ. 巨大芽孢杆菌对照 B . megaterium CK , Ⅱ. 巨大芽孢杆菌调控
B . megaterium regulated , Ⅲ. 氧化葡萄糖酸杆菌对照 G. oxydans
CK , Ⅳ. 氧化葡萄糖酸杆菌调控 G. oxydans regulated , Ⅴ. 古龙酸对
照 KGA CK , Ⅵ. 古龙酸调控 KGA regulated . 下同 The same below.
图 5 　通气量对混合培养中各种菌群生长及产酸的影响
Fig. 5 Effect of [ O2 ] on growth and KGA2yielding of B . megaterium
and G. oxydans during two2step mixed fermentation.
积累显著增加. 随发酵时间延长 ,介质中古龙酸积累
增多 ,伴生菌的生长受到抑制 ,数量减少 ,只有纯培
养的 2/ 3 ,营养体维持时间缩短 3h. 发酵后期 ,产酸
菌的生长和产酸速度明显减缓.
312 　Vc 二步混菌发酵中环境因子的影响
31211 氢离子效应 　适时增加氢离子浓度 ,可影响
氧化葡萄糖酸杆菌增殖 (图 4) ,延缓产酸代谢 ,减少
介质中 22酮基2L2古龙酸的积累 ,从而刺激巨大芽孢
杆菌生长 ,为产酸菌代谢提供丰富的营养 ,产酸明显
加快 ;而 p H 升高促进产酸菌生长.
31212 通气效应 　适当增大通气量 ,可显著地促进巨
大芽孢杆菌的生长 ,从而促进了氧化葡萄糖酸杆菌的
生长和产酸 ,保障混合菌发酵的正常进行(图 5) .
31213 温度效应 　山梨糖脱氢酶的最适温度为
45 ℃(图 6a) ,在 33 ℃以下时稳定性较好 (图 6b) . 22
酮基2L2古龙酸还原酶的最适温度为 29 ℃(图 7) .
31214 金属离子效应 　Fe3 + 离子显著增加山梨糖脱
氢酶活性 , Co2 + 、Cu2 + 对其有强烈抑制作用 , 而
Mn2 + 、Zn2 + 和 Sn2 + 影响不大 (图 8) . 因而适当增加
354111 期 　　　　　　　　　　　　　　　周 　彬等 :Vc 二步发酵中的微生物生态调控 　　　　
图 6 　温度对 SDH 酶活性及稳定性的影响
Fig. 6 Effect of temperature on activity and stability of SDH.
图 7 　温度对 KGR 酶活性的影响
Fig. 7 Effect of temperature on activity of SDH.
图 8 　金属离子对山梨糖脱氢酶酶活性的影响
Fig. 8 Effect of ion on activity of SDH.
1. Fe3 + , 2. Mn2 + ,3. CK ,4. Zn2 + ,5. Sn2 + ,6. Co2 + ,7. Cu2 + .
Fe3 +浓度 ,可加快氧化葡萄糖酸杆菌的产酸 ,增加
古龙酸积累.
313 　Vc 二步发酵最佳调节效果
　　在发酵过程中 ,按 3. 2 所述的最佳条件控制环
境因子 ,优化伴生菌和产酸菌的协同共生 ,生产中可
提高醇酸转化率 2. 33 % ,缩短发酵周期 2. 8h(表 1) .
表 1 　调控罐发酵收率及周期
Table 1 Conversion rate and cycle of regulated tank
批次
Tank
转化率
Conversion
rate ( %)
周期
Cycle (h)
161023283 86. 09 52
1610211289 90. 72 45
16102129 90. 49 64
161023213 90. 82 41
平均 Average 89. 53 50. 5
CK 87. 20 53. 3
4 　结 　　论
411 　二株混合菌在发酵中可形成一种协同共生 ,促
进 22酮基2L2古龙酸产生.
412 　二菌协同共生的过程及条件不同 ,促进产酸能
力亦不同. 环境因子影响二菌协同共生.
413 　优化环境因子 ,可显著改善二菌协同共生效
率 ,并提高醇酸发酵转化率.
参考文献
1 　Feng S (冯 　树) , et al . 1998. Effect of Bacill us megaterium on
growth and acid2yielding of Gluconobacter oxydans during the two2
step fermentation of Vc. J Microbiol (微生物学杂志) ,18 (1) :6～
9 (in Chinese)
2 　Li G2C(李国才) . 1997. Fermentation characters of 22KL G2yield2
ing bacteria and optimal model of mixed culture. J Microbiol (微生
物学杂志) ,17 (2) :1～4 (in Chinese)
3 　Jiang Y2Y(蒋宇扬) , Guo Z2Y(郭振勇) , Zhang C2G(张成刚) .
1997. Study on the purification of 22keto2L2gulonate reductase and
its physical , chemical and enzymic properties. Chin J Biotechnol ,
13 (4) :400～405 (in Chinese)
4 　Sun C2B(孙传宝) , et al . 1998. Control on seeding of the two2step
mixed fermentation of Vc. J Microbiol (微生物学杂志) ,18 (2) :13
～15 (in Chinese)
5 　Sugisawa T , Hoshino T , Fujiwara A. 1991. Purifacation and prop2
erties of NADPH2linked L2sorbose reductase from Gluconobacter
melanogenus 4421. A gric Biol Chem ,55 :20453～20459
6 Sugisawa T , et al . 1991. Isolation and characterization of membrane2
bound L2sorbose dehydrogenase from Gluconobacter melanogenus UV2
10. A gric Biol Chem ,55 :363～370
7 　Wei D2Z(魏东芝) , Yuan W2K(袁渭康) , Yin G2L (尹光琳) , et
al . 1992. Studies on kinetic model of Vitamin C two2step fermenta2
tion process. Chin J Biotechnol (生物工程学报) ,8 (3) :277～282
(in Chinese)
8 　Zhang L2X (张龙翔) , Zhang T2F (张庭芳) ,Li L2Y (李令媛) .
1981. Biochemical Experimental Methods and Techniques. Beijing :
People’s Education Press. 112～119
作者简介 　周 　彬 ,男 ,1973 年生 ,博士研究生 ,主要从事微
生物资源研究. 已发表学术论文 1 篇. E2mail :zhoubin @iae.
ac. cn
4541 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　13 卷