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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第9期
收稿日期 ： 2014-02-08
基金项目 ： 国家重点基础研究发展计划（“973”计划）（2011CBA00804），国家高技术研究发展计划（“863”计划）（2012AA022101），江
苏高校优势学科建设工程资助项目
作者简介 ：李翎，女，硕士研究生，研究方向 ：基因工程与工业生物催化 ；E-mail ：421247797@qq.com
通讯作者 ：严明，男，副教授，研究方向 ：工业蛋白质科学与生物催化工程 ；E-mail ：yanming@njtech.edu.cn
5-葡萄糖酸脱氢酶（Gluconate 5-dehydrogenase，
Ga5DH、GNO，EC1.1.1.69）是一种辅酶依赖性的还
原酶，属于短链脱氢酶 SDR 家族，可以催化 D-葡萄
糖酸与 5-酮基 -D-葡萄糖酸（5-KGA）之间的可逆氧
化还原转化［1］，从而调节生物体内的碳源和还原力
转化，以维持机体内的代谢平衡，在葡萄糖代谢中
具有重要作用［2，3］。这种 D-葡萄糖酸的氧化反应大
多数依赖于 NADP+，极少能以 NAD+ 作为辅酶。对
该反应过程的动力学研究表明，该酶对 D-葡萄糖酸
氧化的速度低于 5-酮基 -D-葡萄糖酸还原的速度，因
氧化葡萄糖酸杆菌中 5-葡萄糖酸脱氢酶基因的克隆、表
达及酶学性质分析
李翎  许琳  魏淼  李艳  严明
（南京工业大学生物与制药工程学院，南京 211816）
摘 要： 根据 NCBI 上的报道的基因序列设计引物，以氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans）H24 的基因组为模板，获得 5-
葡萄糖酸脱氢酶（Ga5DH）基因，将其与表达载体 pET-28a 连接，构建重组质粒 pET-28a-Ga5DH，并转化大肠杆菌 Rosetta 进行表达。
SDS-PAGE 检测结果显示，表达蛋白的分子大小为 26.5 kD，纯化后酶活达 7.83 U/mg。酶学性质分析表明，该酶的最适反应温度为
40℃，最适 pH 为 11。在 pH 9-11 的缓冲中保温 8 h，酶活力仍有 80% 以上的残余。该酶对多种有机溶剂具有良好的耐受性。
关键词 ： 5-葡萄糖酸脱氢酶 氧化葡萄糖酸杆菌 表达 酶学性质
Cloning，Expression and Characterization of Gluconate
5-dehydrogenase from Gluconobacter oxydans
Li Ling Xu Lin Wei Miao Li Yan Yan Ming
（College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing Tech University，Nanjing 211816）
Abstract: Guconate 5-dehydrogenase gene from Gluconobacter oxydans H24 was amplified with primes designed based on NCBI database
published sequence information. Ga5DH was cloned and expressed in Escherichia coli Rosetta strain. Results showed that the molecular mass
of the enzyme was 26.5 kD by SDS-PAGE gel analysis. After purification, the enzyme activity could reach 7.83 U/mg. It was suggested that the
recombinant protein had a maximum activity at 40℃, pH 11. The characterization of purified enzyme indicated that Ga5DH was highly resistant
to organic solvents.
Key words: Gluconate 5-dehydrogenase Gluconobacter oxydans Expression Enzymatic properties
而其生成的 NADPH 在各种生物合成过程中可作为
氢供体［4］，在辅酶再生系统中具有一定的应用潜力。
同时，该酶催化生成的 5-KGA 是生物法制备 L（+）-
酒石酸的重要前体，且直接制约糖质发酵生产 L（+）-
酒石酸的产率［5，6］。L（+）-酒石酸用途广泛，主要
可用于制造食品添加剂、医疗拆分剂，还可用于纳
米材料的制备。随着 L（+）-酒石酸生物制造研究
的日趋深入［7］，5-葡萄糖酸脱氢酶的研究与应用也
越来越受到关注。
目前对于 5-葡萄糖酸脱氢酶的研究报道主要集
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第9期158
中在 Gluconobacter oxydans［1，8］、Gluconobacter liquef-
aciens［9］和 Acetobacter suboxydans［10］等几个来源的
微生物。Klasen 等［4］为了提高 5-KGA 的产量，在
G.oxydans DSM3503 中过表达了依赖于 NADP+ 的 5-
葡萄糖酸脱氢酶，使得该酶的酶活有了 85 倍的增
加，可以在细胞质中催化葡萄糖酸转化积累 5-KGA。
已 有 报 道 对 来 源 于 Streptococcus suis serotype 2 和
Gluconobacter suboxydans IFO12528 的 5-葡 萄 糖 酸 脱
氢酶进行了 X 射线衍射，解析了其三维结构和催
化机制［11，12］，发现该酶有两个最保守的区域，为
SDR 酶所特有，且不同来源的葡萄糖酸脱氢酶同源
性不高。
本研究首次将来源于氧化葡萄糖酸杆菌（G.
oxydans）H24［13］的 5-葡萄糖酸脱氢酶基因克隆并
转化大肠杆菌（Escherichia coli）表达系统，纯化并
分析其酶学性质，并为了拓展其用于医药手性中间
体生物合成中价格昂贵的 NADPH 的再生，首次考
察其有机溶剂耐受性旨在为进一步研究和利用 5-葡
萄糖酸脱氢酶，解析其结构与功能关系奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株及质粒 G. oxydans H24 购买于中国普通
微生物菌种保藏管理中心，E. coli DH5α、Rosetta 及
质粒 pET-28a 为本实验室保藏。
1.1.2 酶与试剂 DNA 限制性内切酶、T4 DNA 连
接酶、Prime STAR HS DNA 聚合酶均购买自宝生物
工程（大连）有限公司（TaKaRa）；细菌基因组提
取试剂盒及胶回收试剂盒购买于 Biomiga 公司 ；质
粒提取试剂盒购自上海申能博彩生物科技有限公司；
引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成 ；蛋白质
分子量标准购自 Fermentas 公司 ；抗生素及其余试剂
购买自生工生物工程（上海）股份有限公司。
1.1.3 培养基及培养条件 G. oxydans H24 的培养基
含 8% 山梨醇，2% 酵母提取物，0.5% 硫酸铵，0.2%
磷酸氢二钠，0.025% 硫酸镁和 0.01% 谷氨酰胺，于
30℃培养［14］。E. coli DH5α 和 Rosetta 的种子培养基
为 LB 培养基，37℃培养 8 h。发酵培养基为 TB 培
养基，含 1.5% 蛋白胨，2.5% 酵母粉，1%NaCl，0.2%
葡萄糖和 0.3% 乳糖，于 37℃培养 3 h 后转 30℃培
养 12 h。
1.2 方法
1.2.1 DNA 操作技术 PCR 产物纯化、酶切、连接、
转化等均参考分子克隆实验指南［15］。基因组提取用
细菌基因组提取试剂盒进行，质粒提取用质粒提取
试剂盒进行。
1.2.2 G. oxydans 5-葡萄糖酸脱氢酶基因的克隆 根
据 NCBI 数据库上登载的 G. oxydans H24 全基因组
序列，进行序列分析，获得 5-葡萄糖酸脱氢酶基因
序列信息（NCBI 基因号 14001272，全长 756 bp），
根据序列设计一对引物如下 ：上游引物 Ga5DH-F ：
CATGCCATGGATGAGTACCTCTCTTTTTG，下划线为
Nco Ⅰ酶切位点 ；下游引物 Ga5DH-R ：CGCGGATC-
CTCAAAGAGAGACCGTAATC， 下 划 线 为 BamH Ⅰ
酶 切 位 点。 以 G. oxydans H24 的 基 因 组 DNA 为 模
板， 扩 增 目 的 基 因。PCR 扩 增 程 序 为 ：98℃ 预 变
性 5 min，98℃变性 10 s，58℃退火 15 s，72℃延伸
1 min，进行 30 个循环 ；72℃延伸 7 min ；4℃保存。
扩增产物用胶回收试剂盒回收。
1.2.3 重组质粒的构建 将纯化后的 5-葡萄糖酸脱
氢酶基因用 Nco Ⅰ和 BamH Ⅰ酶切，同时酶切载体
pET-28a，用胶回收试剂盒回收，用 T4 DNA 连接酶
将酶切后的 Ga5DH 基因与 pET-28a 质粒置于 16℃过
夜连接，得到重组质粒 pET-28a-Ga5DH ；将连接产
物转化 E. coli DH5α 感受态细胞，在含有 30 μg/mL
卡那霉素的抗性平板上筛选阳性克隆，提取质粒经
酶切验证后，将重组质粒送与南京金斯瑞生物科技
有限公司测序。
1.2.4 G. oxydans 5-葡 萄 糖 酸 脱 氢 酶 基 因 在 E. coli
中的表达 将测序正确的质粒转化 E. coli 表达宿
主 Rosetta，接种于含卡那霉素（30 μg/mL）和氯霉
素（34 μg/mL）的液体 LB 培养基中，于 37℃培养 8
h ；8 h 后将菌液按 2% 接种量转接于 50 mL（500 mL
三角烧瓶）含卡那霉素（30 μg/mL）和氯霉素（34
μg/mL）的 TB 培养基中，37℃，220 r/min 振荡培养
3 h 后转 30℃，220 r/min 振荡培养 12 h 后，8 000 r/min
离心 20 min 集菌。菌体用同体积 pH7 磷酸钠缓冲悬
浮后超声破碎，8 000 r/min 离心 20 min，收集上清，
即为粗酶液。
2014年第9期 159李翎等 ：氧化葡萄糖酸杆菌中 5-萄糖酸脱氢酶基因的克隆、表达及酶学性质分析
1.2.5 SDS-PAGE 和蛋白含量测定 SDS-PAGE 按照
分子克隆实验指南［15］配置，分离胶浓度 12%，浓
缩胶 5%。粗酶液加入 2×loading Buffer，95℃煮 5
min 后，上样 10 μL，进行电泳，分析重组蛋白的表
达情况。蛋白质定量采用常规的 Bradford 法［16］。
1.2.6 酶 活 力 测 定 酶 反 应 体 系 包 括 1 mmol/L
NADP+，5 mmol/L 葡萄糖酸钠，在 100 mmol/L 磷酸
钠缓冲液（pH7.0）中进行测定。于 30℃，波长 340
nm 处检测吸光值变化。定义每分钟催化还原 1 μmol
NADP+ 所需的酶量为一个活力单位（U）。
1.2.7 蛋白纯化 取粗酶液，用 30%-60% 的硫酸
铵溶液进行沉淀，沉淀用 1 mol/L 硫酸铵溶液复溶，
用 0.22 μm 的 PVDF 水 膜 过 滤 后， 流 经 Hi TrapTM
Phenyl FF 预装纯化柱（GE healthcare 公司），先用
含 1 mol/L 硫酸铵的 0.1 mol/L 磷酸钠 pH7 缓冲液进
行预平衡，用 0.1 mol/L 磷酸钠 pH7 缓冲液缓冲液梯
度洗脱，平均流速 0.5 mL/min，收集洗脱下来的色
谱峰，脱盐处理后，用聚乙二醇浓缩，再用 0.22 μm
的 PVDF 水膜过滤后，流经 Hi TrapTM DEAE FF 纯化
柱（GE healthcare 公司），先用缓冲液 A（0.05 mol/L
磷酸钠缓冲液，pH7）洗去未特异结合于柱上的杂
蛋白，再用缓冲液 B（0.05 mol/L 磷酸钠缓冲液，pH
7，含 0.5 mol/L NaCl）洗脱，收集洗脱下来的色谱峰，
得到纯化后样品。12％ SDS-PAGE 分析纯化后样品
条带，蛋白质定量采用常规的 Bradford 法［16］。测定
酶活，计算其纯化倍数。
1.2.8 5-葡萄糖酸脱氢酶最适 pH 的研究 将酶液置
于 pH2-12 范围的磷酸钠缓冲液中反应，测定其酶
活力。
1.2.9 5-葡萄糖酸脱氢酶最适温度的研究 将纯化
后酶液置于 20-70℃范围内，测定其最适反应温度。
1.2.10 5-葡萄糖酸脱氢酶稳定性的研究
1.2.10.1 pH 稳定性的研究 将酶液置于 pH6-11 的
磷酸钠缓冲液中保温 8 h，在最适条件下测定其残余
酶活，以酶活最高为 100%，其余酶活与之相比，计
算其相对酶活。
1.2.10.2 温度稳定性的研究 将酶液置于 20-70℃
条件下保温 60 min，每隔 5 min 测定其残余酶活，
确定该酶的热稳定性。以酶活最高为 100%，其余酶
活与之相比，计算其相对酶活。
1.2.10.3 5-葡萄糖酸脱氢酶有机溶剂耐受性的测定
在最适 pH 和最适温度下，在酶活测定体系中分
别添加 10% 的有机溶剂，以未添加有机溶剂的酶活
为 100%，其余酶活与之相比，计算其相对酶活。
1.2.11 5-葡萄糖酸脱氢酶酶动力学性质的测定 在
最适 pH 和最适温度下，分别测定酶液在葡萄糖酸
钠底物浓度（S）分别为 1、1.5、2、3、4、5 mmol/L
时的酶活力，绘图计算酶的 Km 值 ；在最适 pH 和
最适温度下，分别测定酶液对辅酶 NADP+ 和辅酶
NAD+ 的依赖性，计算酶对辅酶的 Km 值。
2 结果
2.1 目的基因的获得
以 G. oxydans H24 的基因组 DNA 为模板，根据
NCBI 登载基因序列设计引物，扩增获得目的基因，
如图 1 所示，在 750-1 000 bp 间有一条特异性条带，
其大小与数据库登载基因大小一致。
2000
bp
1000
750
500
250
100
M 1
M ：DL2000 Marker ；1 ：PCR 产物
图 1 PCR 扩增结果
2.2 重组质粒的构建及酶切验证
将扩增获得的 5-葡萄糖酸脱氢酶基因片段纯化
后， 用 Nco Ⅰ 和 BamH Ⅰ 双 酶 切， 并 与 载 体 pET-
28a 连接，转化 DH5α，在含有 30 μg/mL 的卡那霉
素抗性平板上筛选转化子，提取质粒酶切验证。结
果如图 2 所示，用 Hind Ⅲ和 Xba Ⅰ双酶切后，3 号
质粒在 3 000 bp 与 750 bp 处有正确位置的条带，与
预测结果相符。测序结果与基因库登载序列相一致，
证明重组质粒构建成功。
2.3 SDS检测目的蛋白
将测序正确的质粒转化 E. coli Rosetta，发酵获
得菌液，破碎获得酶液，处理后进行蛋白电泳分析。
根据数据库基因序列，预测 5-葡萄糖酸脱氢酶基因
编码蛋白分子大小约为 26.5 kD，如图 3 所示，重组
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第9期160
附近有一特异性条带。酶活测定结果如表 1，纯化后，
Ga5DH 比酶活可达到 7.83 U/mg。纯化后的目的蛋白
M 1 2 3 4
bp
3000
2500
2000
1000
750
500
250
100
M ：DL3000 Marker ；1-4 ：pET-28a、 重 组 质 粒 1、2、3 号
Hind Ⅲ和 Xba Ⅰ酶切
图 2 酶切验证结果
1 2 M
kD
116.0
66.2
45.0
35.0
25.0
1 ：重组菌粗酶液 ；2 ：对照空菌粗酶液 ；
M ：蛋白 Marker
图 3 SDS-PAGE 电泳图
菌株在25 kD附近有一特异性条带，与预期结果一致。
2.4 5-葡萄糖酸脱氢酶的酶活测定
以不同的标准 NADPH 浓度为横坐标，所测定
的吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。回归方程为 ：
y=3.01x+0.0822，R2=0.999。根据上述方法测定酶活，
测得重组菌 5-葡萄糖酸脱氢酶酶活为 2.07 U/mL。
2.5 5-葡萄糖酸脱氢酶的纯化
对重组菌Rosetta-Ga5DH 进行诱导表达，收集酶
液，先使用硫酸铵沉淀除去部分杂蛋白，再经疏水
苯基柱和阴离子柱进一步纯化后，进行 SDS-PAGE
分析和酶活测定。如图 4 所示，纯化后酶液在 25 kD
M 1 2 3 4
116.0
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
kD
M ：蛋白 Marker ；1 ：重组菌粗酶液 ；2 ：60% 硫铵沉淀酶液 ；3 ：Phenyl FF
柱纯化酶液 ；4 ：DEAE 柱纯化酶液
图 4 蛋白纯化 SDS-PAGE 电泳图
表 1 5-葡萄糖酸脱氢酶的纯化总表
Purification step Total protein（mg） Total activity（U） Specifice activity（U/mg） Purification fold Yield（%）
粗酶液 71 72 1.08 1 100
60% 硫铵沉淀 15.5 25.3 1.63 1.5 35
Phenyl FF 柱 4.62 14.16 3.08 2.85 20
DEAE 柱 0.62 4.84 7.83 7.25 7
可以用于进一步的酶学性质研究。
2.6 重组酶最适pH
在不同 pH 缓冲反应条件下检测纯化后酶液的
活性，结果如图 5，表明该酶在 pH7-11 范围内酶活
不断上升，pH 值高于 11 时酶活迅速降低，其最适
pH 值为 10-11。
2.7 重组酶最适温度
在 20-70℃，pH11 条件下，测定 5-葡萄糖酸脱
氢酶的活性，如图 6 所示，表明该酶的最适温度为
40℃。
2 4 6 8 10 12
0
5
10
15
20
25
30
35
A
ct
iv
ity
U/mg
pH
图 5 5-葡萄糖酸脱氢酶的最适 pH 曲线
2014年第9期 161李翎等 ：氧化葡萄糖酸杆菌中 5-萄糖酸脱氢酶基因的克隆、表达及酶学性质分析
2.8 重组酶稳定性
2.8.1 重组酶的 pH 稳定性 将纯化后的 5-葡萄糖
酸脱氢酶酶液在 pH6-11 范围的缓冲液中室温放置
8 h，40℃，pH11 条件下检测剩余酶活力，结果如
图 7 所示。发现该酶在 pH 为 9-11 的体系中，酶活
相对稳定，保存 8 h 后，酶活有 75% 以上的残余。
如图 9 所示，该 5-葡萄糖酸脱氢酶对多种有机溶剂
具有良好的耐受性。酶液在 10% 的乙醇、乙酸乙酯、
甲醇、乙酸丁酯中放置，酶活仍保持在 80% 以上。
图 6 5-葡萄糖酸脱氢酶的最适温度曲线
20 30 40 50 60 70
0
10
20
30
40
50
A
ct
iv
ity
U/mg
Temperatureć
0 2 4 6 8
40
50
60
70
80
90
100
R
el
at
iv
e
ac
tiv
ity
% ᰦ䰤h pH6 pH7 pH8 pH9 pH10 pH11
图 7 5-葡萄糖酸脱氢酶的 pH 耐受性曲线
2.8.2 重组酶的温度稳定性 将重组酶在不同温度
下分别保温，每 5-10 min 取酶液，在 40℃，pH 11
条件下检测剩余酶活力。结果如图 8，5-葡萄糖酸
脱氢酶在 30-50℃时，保温 40 min 后，酶活力仍在
80% 以上。当温度高于 50℃时，酶的催化活性迅速
下降。
2.8.3 重组酶的有机溶剂耐受性 在 40℃，pH 11
条件下，在酶活测定体系中分别添加 10% 的乙醇、
乙酸乙酯、异丙醇、甲醇、乙酸丁酯、甲醛、戊二
醛和乙酰丙酮，测定 5-葡萄糖酸脱氢酶的残余活力，
0 10 20 30 40 50
0
20
40
60
80
100
R
el
at
iv
e
ac
tiv
ity
% ᰦ䰤min 30ć 40ć 50ć 60ć 70ć
图 8 5-葡萄糖酸脱氢酶的温度耐受性曲线
҉䞷҉䞨б䞟 ᔲщ䞷 ⭢䞷 ҉䞨҉䞟 ⭢䟋 ᠺҼ䟋 ҉䞠щ䞞020406080100120140Relative activity% ᴹᵪⓦࡲ
图 9 5-葡萄糖酸脱氢酶的有机溶剂耐受性图
2.9 重组酶酶动力学性质的测定
在 pH11 和 40℃下，分别测定酶液在葡萄糖酸
钠底物浓度［S］分别为 1、1.5、2、3、4、5 mmol/L
时的酶活力，以产生速率（V）倒数对底物浓度倒
数作 Lineweaver-Burk 图，如图 10 所示，通过线性
拟合，求出该葡萄糖酸脱氢酶的米氏常数 Km 为
12.31 mmol/L，最大反应速率 Vmax 为 10.42 mmol·
min-1·L-1。
对 5-葡萄糖酸脱氢酶的辅酶特异性进行研究，
并在 pH11 和 40℃下，分别测定酶液在辅酶底物浓
度［S］分别为 1、1.5、2、3、4、5 mmol/L 时的酶活力，
以产生速率（V）倒数对底物浓度倒数作 Lineweaver-
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第9期162
Burk 图，计算其 Km 和 Vmax 值。测定结果表明，5-
葡萄糖酸脱氢酶对 NAD+ 没有活性而对 NADP+ 有活
性。如图 11 所示，通过线性拟合，求出该葡萄糖酸
脱氢酶对 NADP+ 的米氏常数 Km 为 1.34 mmol/L，最
大反应速率 Vmax 为 0.11 mmol·min-1·L-1。
最适温度性质则低于 G. suboxydans 的最适温度，这
些结果与已有报道类似。虽然 G. oxydans H24 来源
的 5-葡萄糖酸脱氢酶氨基酸序列与 G. oxydans DSM
3503 来源的 5-葡萄糖酸脱氢酶氨基酸序列的相似性
仅为 67%，但是本研究所表达的重组酶的最适 pH
和最适温度与该酶的性质相似［4］，这一方面为 5-葡
萄糖酸脱氢酶的分子结构研究提供了参考材料，另
一方面也为该酶在酶法制备 L（+）-酒石酸等 5-酮
基 -D-葡萄糖酸衍生物中的应用提供技术参考。
该来源于氧化葡萄糖酸杆菌 H24 的 5-葡萄糖酸
脱氢酶催化氧化 D-葡萄糖酸的反应伴随着还原性辅
酶 NADPH 的生成，更具有与葡萄糖脱氢酶等辅酶
再生酶串联应用的潜力，可适用于医药手性中间体
合成中价格昂贵的 NADPH 的再生。在手性化合物
合成中，许多底物都不易溶于水，需要加入助溶剂
以提高底物的溶解度。有机溶剂中的生物催化反应
拥有许多水相中无法比拟的优势，而酶的有机溶剂
耐受性是生物催化应用的主要瓶颈之一，有机溶剂
通过破坏蛋白质表面的水化层而使蛋白结构发生变
化，进而使蛋白失活。迄今为止，没有文献报道 5-
葡萄糖酸脱氢酶的有机溶剂耐受性。本研究首次考
察了有机溶剂对 5-葡萄糖酸脱氢酶酶活的影响，在
所选用的常见有机溶剂中，在乙酸丁酯和乙酸乙酯
中，该酶的相对酶活超过 100%，说明乙酸丁酯和乙
酸乙酯两种酯类对酶活力还有一定的激活作用，应
为酯类对该酶构象有一定影响 ；而该酶对甲醛和戊
二醛的耐受性差，酶活剩余不足 20%。乙酸丁酯和
乙酸乙酯等酯类的有机溶剂对该酶活的影响最小，
作为助溶剂较优 ；其次是醇类，而醛酮类最易使该
酶失活，该结果对后续该酶应用于催化反应具有指
导意义。
4 结论
本研究在 E. coli Rosetta 中表达了来自 G. oxydans
H24 的 5-葡萄糖酸脱氢酶基因，重组 5-葡萄糖酸脱
氢酶 Ga5DH 经纯化后，目的蛋白分子量约为 26.5
kD，酶活可达到 7.83 U/mg。该酶最适温度为 40℃，
最适 pH 为 11，在 pH9-11 的缓冲中保温 8 h，酶活
力仍有 80% 以上的残余。该酶对多种有机溶剂具有
良好的耐受性，酶液添加 10% 的乙醇、乙酸乙酯、
0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16 0.18 0.20 0.22
4
5
6
7
8
9
10
11
1/
[V
]min·L/mmol
1/[S] (L/mmol)
图 10 5-葡萄糖酸脱氢酶的酶促反应曲线图
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
10
12
14
16
18
20
22
1/[S]L/mmol1/[V]min·L/mmol
图 11 5-葡萄糖酸脱氢酶的酶促反应曲线图
3 讨论
1995 年，Klasen 等［4］在 E. coli 中表达了来源于
G. oxydans DSM 3503 的 GNO 基 因， 获 得 5-葡 萄 糖
酸脱氢酶酶活为 6.04 U/mg，对其酶学性质进行探究
后发现，其最适 pH 为 10。本研究首次将 G. oxydans
H24 中的 5-葡萄糖酸脱氢酶基因克隆至 E. coli 中，
使得 5-葡萄糖酸脱氢酶高效表达，纯化后酶活可达
到 7.83 U/mg，最适 pH 为 11，且 pH 稳定性较好，在
8-10 pH 下保存 8 h，酶活丧失也不超过 20%，其最
适 pH 性质与 G. suboxydans［1］的最适 pH 一致，而
2014年第9期 163李翎等 ：氧化葡萄糖酸杆菌中 5-萄糖酸脱氢酶基因的克隆、表达及酶学性质分析
甲醇、乙酸丁酯后，酶活仍保持在 80% 以上。
参 考 文 献
［1］ Adachi O, Shinagawa E, Matsushita K, et al. Crystallization and
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（责任编辑 李楠）