全 文 ：混合培养中巨大芽孢杆菌对氧化葡萄糖
酸杆菌的作用*
冯 树* * 张 舟 张成刚 张忠泽 (中国科学院沈阳应用生态研究所, 沈阳 110015)
摘要 为查明维生素 C 二步发酵混合培养中巨大芽孢杆菌与氧化葡萄糖酸杆菌间的关系, 通过生长曲线测
定、静息细胞实验及摇瓶发酵实验研究了巨大芽孢杆菌对氧化葡萄糖酸杆菌生长和产生 2酮基L古龙酸作用
的影响; 采用超滤分离、凝胶层析及聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对巨大芽孢杆菌胞外液中具有促进氧化葡萄糖酸
杆菌产酸作用的活性物质进行了分离和纯化. 结果表明, 大菌胞内液和胞外液均可促进小菌生长, 大菌胞外液
中具有该作用的组分分子量在 100KDa 以上;大菌胞外液具有促进小菌转化 L山梨糖生成 2酮基L古龙酸的
作用, 其胞内液无该作用;大菌胞外液中具有该活性作用的组分为 30~ 50KDa和大于 100KDa 两个部分. 其中
30~ 50KDa范围的大菌胞外液中的活性组分为一种蛋白质, 其表观分子量约为 35KDa, 由一种亚基构成, 且该
蛋白含金属铁和锌元素.
关键词 混菌培养 氧化葡萄糖酸杆菌 巨大芽孢杆菌 生长 2- 酮基- L- 古龙酸
Effect of Bacillus megaterium on Gluconobacter oxydans in mixed culture. FENG Shu, ZHANG Zhou, ZHANG
Chenggang and ZHANG Zhongze ( I nstitute of App lied Ecology , Chinese A cademy of Sciences, Shenyang 110015) .
Chin. J . A pp l . Ecol . , 2000, 11( 1) : 119~ 122.
To reveal the relationship between Bacillus megater ium and Gluconobacter ox ydans in the mixed culture of vitamin C
twostep fermentation, the effect o f B . megater ium on the grow th of G . oxydans and its synthesizing ability of 2keto
Lgulonic acid( 2KGA) was studied. The bioactive metabolites w hich could enhance t he synt hesis of 2KGA w ere isolat
ed and pur ified by ultrafiltration, gel chromatography and SDSpolyacrylamide gel electrophoresis. Both the culture su
pernatant and the cy tosol of B . megater ium could promote the proliferation of G . oxydans , and the activ e component
in the culture supernatant w as above 100 KDa. The culture suernatant could enhance the conversion of Lsorbose to
2KGA, while the cytosol could not. T he active components in B. megater ium culture supernatant had molecular weight
of 30~ 50 KDa and above 100 KDa, and the fo rmer w as a kind of protein w ith an apparent molecular weight of about
35 KDa, which consisted of one sort of subunit and contained Fe and Zn elements.
Keywords Mixed culture, Gluconobacter oxydans , Bacillus megater ium , Proliferation, 2ketoLgulonic acid.
* 中国科学院! 百人计划∀资助项目.
* * 通讯联系人.
1999- 04- 26收稿, 1999- 06- 22接受.
1 引 言
微生物是一类重要的生物资源. 人类对微生物资
源的利用曾经历过天然混合培养至纯种培养两个阶
段,微生物分离纯培养是微生物学发展的一个巨大进
步,现代微生物发酵多为纯种发酵.随着纯种培养技术
的深入发展和微生物间互生现象的研究, 一种实用的
混合培养或混合发酵渐被认识和利用, 并被称之为!生
态工程∀. 我国维生素 C( Vitamin C, Vc)二步发酵即为
混合培养. 其采用氧化葡萄糖酸杆菌( G . oxydans, G.
o, 小菌)和巨大芽孢杆菌( B . megaterium , B. m, 大菌)
混合培养,使 L山梨糖转化为维生素 C的前体 # # # 2
酮基L古龙酸( 2ketoLgulonic acid, 2KGA) . 多年来
该混合培养中大菌和小菌间的关系一直困扰着人们,
影响了维生素 C 二步发酵法理论和生产的进一步发
展.本文研究了维生素 C 二步发酵混合培养中大菌对
小菌生长和产生 2KGA 作用的影响, 并采用超滤、层
析及电泳技术等对大菌分泌的促进小菌产酸的活性物
质进行了分离、纯化.
2 材料与方法
2. 1 供试材料
2. 1. 1 菌种 氧化葡萄糖酸杆菌(小菌 ) , 巨大芽孢杆菌 (大
菌) , 菌种编号为 83325, 东北制药厂提供.
2. 1. 2 培养基 分离培养基和发酵培养基见文献 [ 2] . 大菌培
养基( % ) :葡萄糖 0. 2,玉米浆 0. 5,尿素 0. 1.
2. 1. 3 主要试剂 三羟甲基氨基甲基( T ris) : Merck 进口分装,
Sephadex G100: Pharmacia(瑞典) , 标准分子量蛋白: 中国科学
院上海生物化学研究所,十二烷基硫酸钠( SDS) (电泳纯) :日本
进口分装.
2. 1. 4 主要仪器 H ITACHI85P72 型高速冷冻离心机 (日本 ) ,
PharmaciaLKB型紫外监测仪 (瑞典) , 超滤器 (日本) , 751 紫外
应 用 生 态 学 报 2000 年 2 月 第 11 卷 第 1 期
CHINESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY, Feb. 2000, 11( 1)∃119~ 122
分光光度计(上海) . PE 公司 Optima3000 型全谱电感耦合等离
子光谱仪(美国) .
2. 2 研究方法
2. 2. 1 2KGA浓度的测定 见文献[ 2] .
2. 2. 2 大菌胞外液和胞内液的制备 取培养不同时间的大菌
液, 4000rpm 离心15min,上清液以0. 22m 滤膜过滤, 滤液即为
大菌胞外液;沉淀的大菌以无菌水洗两次后, 悬于 0. 1M tr is 缓
冲液( pH8. 0)中冰浴下超声破碎, 10000rpm 离心15min, 收集上
清,经 0. 22m 滤膜过滤, 所得滤液即为大菌胞内液.
2. 2. 3 细胞酶活力的测定 参照文献[ 4]进行. 在含 2%山梨糖
的NaH2PO4- NaOH 缓冲液 ( pH7. 0)中加入一定量的游离小
菌,制成小菌休止细胞反应液. 分别取反应液 8ml于 18mm %
20mm 的试管中,分别加入大菌胞外液和胞内液样品 2ml,对照
组加大菌种液 2ml. 试管 45&角倾斜, 28∋ 、180rpm 振荡培养
2h,立即终止反应并测定 2KGA 生成量, 计算反应速率 .细胞酶
活力以单位重量(湿重)的细胞单位时间内转化 L山梨糖生成
2KGA 的量表示( 2KGA(mg- 1cell(h- 1) .
2. 2. 4 超滤分离大菌胞外液 用截留分子量分别为 10、30、50、
100KDa 的超滤膜, Ar 加压超滤大菌胞外液, 收集滤出液和滤
留液.
2. 2. 5 Sephadex G100凝胶过滤 取适量超滤分离并浓缩的大
菌胞外液组分, 经 Sephadex G100 柱层析分离[ 5] . 层析柱( 2. 0
cm % 60cm)用 0. 025mol( L- 1 T risHCl( NaCl 0. 1mol(L - 1 pH
7. 2)缓冲液平衡, 洗脱液与平衡液相同, 流速为 0. 5ml(min- 1.
层析时以 pharmacia LKB 紫外监测仪监测, 收集 280nm 吸收
峰.层析得到的蛋白样品加入透析袋中 (截留分子量为
8000Da)内,用 PEG 20000 浓缩.
2. 2. 6 蛋白含量测定 Follin酚法[ 3] .
2. 2. 7 聚丙烯酰胺凝胶电泳 蛋白纯度鉴定参照文献[ 1]方法
进行聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳( PAGE) . 蛋白亚基鉴定参
照文献[ 1]方法进行不连续 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( SDS
PAGE) .
2. 2. 8 分子量测定 Sephadex G100 凝胶过滤法.
2. 2. 9 金属元素测定 吸取样品 5ml,加入 3ml硝酸: 高氯酸( 3
1)消煮后,用蒸馏水洗至 5ml, 用全谱电感耦合等离子体光谱
测定蛋白样品金属元素含量.
3 结果与讨论
3. 1 大菌对小菌生长和产酸的影响
3. 1. 1大菌胞外液和胞内液对小菌生长的影响 取新
鲜小菌菌落制备菌悬液.分别取 4ml菌悬液置于内有
20ml种子培养基的 250ml摇瓶中,然后分别加入培养
不同时间的大菌胞外液和培养 22h 的大菌胞内液各
5ml,纯小菌对照组加 5ml 大菌种子培养基. 28 ∋ 、
180rpm 振荡培养,每隔 3h 取样,测波长 650nm 下 OD
值,以 OD值代表菌浓度. 以时间- OD值作生长曲,结
果见图 1.可见培养 9~ 40h的大菌胞外液和培养 22h
的大菌胞内液均具促进小菌生长的作用, 主要表现为
缩短小菌生长的延迟期, 加快小菌进入指数生长期的
速度,总菌量亦增多.
图 1 大菌胞外液、胞内液对小菌生长的作用
Fig. 1 Ef fect of B . megaterium culture supernatant and cytosal on the pro
lif erat ion of G . oxydans.
) . G . oxydans, ∗ . + 9h B. m cult , + . + 18h B. m cult , ,. + 40h B. m
cult , − . + B. m cytosol.
3. 1. 2不同分子量范围大菌胞外液组分对小菌生长的
影响 培养 36h 的大菌胞外液经超滤分离为 <
10KDa、10 ~ 30KDa、30 ~ 50KDa、50 ~ 100KDa、>
100KDa 5个部分, 按 2. 1. 2法测定 5部分大菌胞外液
对小菌生长曲线的影响(图2) .可见, 未经分离的培养
36h的巨大芽孢杆菌胞外液和膜分离的大于 100KD
的大菌胞外液组分均对小菌生长有显著的促进作用,
表现为延迟期缩短, 且细菌总量增加. 100KDa以下的
大菌胞外液对小菌生长无显著促进作用. 可以认为大
于100KDa的大菌胞外液组分为小菌生长的刺激因子.
图 2 不同分子量范围大菌胞外液成分对小菌生长的作用
Fig. 2 Ef fect of B . megaterium culture supernatant w ith dif ferent molecular
w eight on G . oxyd ans proliferation.
) . G . o, ∗ . + 10KDa B. m cult , + . + 10~ 30KDa B. m cult , ,. + 30~
50KDa B. m cult, − . + 50~ 100KDa B. m cult, . . + > 100KDa B. m
cult , / . G . o+ B. m cult .
3. 2 大菌对小菌产酸能力的影响
3. 2. 1大菌及其胞外液和胞内液对小菌产酸能力的影
响 以休止细胞实验测定大菌胞外液和胞内液对小菌
120 应 用 生 态 学 报 11卷
产酸细胞酶活力的影响(表 1) .休止细胞实验结果表
明,小菌细胞单独存在时可以转化 L山梨糖为 2KGA,
表明小菌体内含有合成 2KGA的全部酶系, 但作用极
弱;大菌胞内液无促进小菌产酸作用,其胞外液具该作
用,且作用随大菌培养时间的延长而增强,表明大菌通
过释放某些物质促进小菌产酸.
表 1 大菌组分对小菌产酸细胞酶活力的影响
Table 1 Effect of B. megaterium culture supernatant and cytosol on the
enzymic activity of G. oxydans converting Lsorbose to 2KGA
组别
Groups
例数
n
细胞酶活力
Enzyme activity( x 0 s)
1 小菌
G. o 4 0. 208 0 0. 021
2 小菌+ 18h大菌胞外液
G. o+ 18h B. m cult 4 0. 367 0 0. 043*
3 小菌+ 24h大菌胞外液
G. o+ 24h B. m cult 4 0. 551 0 0. 025*
4 小菌+ 40h大菌胞外液
G. o+ 40h B. m cult 4 0. 753 0 0. 030*
5 小菌+ 60h大菌胞外液
G. o+ 60h B. m cult 4 0. 805 0 0. 037*
6 小菌+ 18h大菌胞内液
G. o+ 18h B. m cytosol 4 0. 208 0 0. 021
* p< 0. 01, vs. G . oxyd ans.
3. 2. 2不同分子量范围大菌胞外液对小菌产酸的影响
摇瓶发酵实验分 7组, 每组 2只 250ml摇瓶,每只摇
瓶置 18ml发酵液, 5ml小菌悬液, 1组加大菌培养基
4ml, 2组加培养 40h 的大菌胞外液, 3、4、5、6、7组分
别加入以超滤分离获得的< 10KDa、10~ 30KDa、30~
50KDa、50 ~ 100KDa 及> 100KDa 的大菌胞外液,
28 ∋ 、180rpm 培养 68h,测定 2KGA生成量(表 2) . 由
表 2可见, 分子量在 30~ 50KDa 和大于 100KDa的大
菌胞外液组分具有明显促进小菌产酸的作用.
表 2 不同分子量大菌胞外液对小菌产酸的影响
Table 2 Effect of B. megaterium culture supernatant with di fferent molec
ular weight on the abili ty of G. oxydans converting Lsorbose to 2KGA
组别
Groups
例数
n
2酮基 L古龙酸
2KGA( mg(ml- 1, x 0 s)
1 小菌
G. o 2 5. 00 0 0. 054
2 小菌+ 大菌胞外液
G. o+ < B. m cult 2 37. 69 0 1. 09*
3 大菌+ < 10KDa大菌胞外液
G. o+ < 10KDa B. m cult 2 8. 46 0 1. 08
4 小菌+ 10~ 30KDa大菌胞外液
G. o+ 10~ 30KDa B. m cult 2 8. 84 0 1. 62
5 小菌+ 30~ 50KDa大菌胞外液
G. o+ 30~ 50KDa B. m cult 2 30. 7 0 5. 54*
6 小菌+ 50~ 100KDa大菌胞外液
G. o+ 50~ 100KDa B. m cult 2 9. 61 0 1. 63
7 小菌+ > 100KDa大菌胞外液
G. o+ > 100KDa B. m cult 2 31. 53 0 2. 18*
* p< 0. 05, vs. G . oxyd ans.
3. 3 促小菌产酸大菌胞外液活性物质的分离、纯化
3. 3. 1 分离、纯化 经超滤浓缩获得的分子量为 30~
50KDa的大菌胞外液经 Sephadex G100柱层析分离、
纯化, 测定各收集管在 280nm 的紫外吸收值, 同时测
定其蛋白质含量. 洗脱曲线见图 1. 在 280nm 处只出
现一个吸收峰. 摇瓶发酵实验证实该峰组分促进小菌
产酸,且其作用大小变化与洗脱曲线峰型重叠一致,说
明该促进小菌产酸的物质为蛋白质.
图 3 大菌胞外蛋白在 SephadexG100凝胶柱上的洗脱曲线
Fig. 3 Gel filtration of B. megaterium secreted protein on Sephadex G100.
3. 3. 2纯度鉴定 将纯化的大菌胞外蛋白进行聚丙烯
酰胺凝胶电泳( PAGE) , 结果见图 4A. 可见该蛋白经
PAGE 呈现一条电泳带,达到电泳纯.
图 4 大菌胞外蛋白的 PAGE和 SDSPAGE
Fig. 4 PAGE( A) and SDSPAGE( B) of purified B . megaterium secreted
protein.
a:巨大芽孢杆菌培养上清 B . megater ium culture supernatant , b:纯化的
大菌胞外蛋白 Purified B . megaterium secreted protein.
3. 4 活性蛋白性质鉴定
3. 4. 1 分子量测定 用已知分子量蛋白作 Sephadex
G100洗脱标准曲线.对应该标准曲线,查出所分离的
大菌胞外活性蛋白表观分子量为 35KDa(图 5) .
3. 4. 2 蛋白亚基鉴定 将纯化的大菌胞外蛋白进行
SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDSPAGE) , 结果见图
4B.可见该蛋白经 SDSPAGE 呈现一条电泳带, 且该
带与PAGE电泳带的位置相对应, 表明该蛋白由一种
亚基构成.
3. 4. 3金属元素测定 所分离的大菌胞外活性蛋白含
铁和锌元素.
1211 期 冯 树等:混合培养中巨大芽孢杆菌对氧化葡萄糖酸杆菌的作用
图 5 S ephadex G100凝胶过滤测定大菌胞外蛋白分子量
Fig. 5 Determinat ion of B . megater ium secreted protein molecular w eight
by Sephadex G100 gel filt ration.
柱体积 Colume: 1. 2% 78cm,缓冲液 Buf fer: 0. 025mol(L- 1, Tris( 0. 1mol(
L- 1 NaCL, pH7. 2) ,洗脱速度 Speed: 0. 5ml(ml- 1.
) .细胞色素 C Cytochrome C, ∗ . 脱氧核糖核酸 Deoxyribonucle ase
lease, + .大菌胞外蛋白 Bm. secreted protein, ,. 过氧化物酶 Superoxi
dase, − . 过氧化氢酶 Hydrogen peroxidase, . . 牛血清白蛋白 Bovine
serum albumin.
4 结 论
4. 1 大菌胞内液和胞外液均可促进小菌生长,缩短小
菌增殖的延迟期.大菌胞外液中具有该作用的组分分
子量在 100KDa以上.
4. 2 大菌胞外液促进小菌转化 L山梨糖生成 2酮基
L古龙酸, 其胞内液无该作用; 具有该活性作用的大
菌胞外液组分为 30~ 50KDa和大于 100KDa两部分
组分; 其中 30~ 50KDa范围的大菌胞外液活性组分为
一种蛋白质, 其表观分子量约为 35KDa, 由一种亚基
构成,且该蛋白含金属铁和锌元素.
致谢 杨俊森副研究员和曾青实验师在蛋白分离和纯化工作
中给予帮助和指导,特此感谢!
参考文献
1 Hames BD and Rickw ood D. 1981. Gel Elect rophoresis of Proteins, A
Pract ical Approach. IRL Press L imited. 18~ 29, 64~ 70
2 Jiang YY(蒋宇扬) , Guo ZY(郭振勇) , Zhang CG(张成刚) . 1997.
Study on the purification of 2ketolgulonate reduetase and it s physi
cal, chemical an d enzymic propert ies. Chin J Biotechnol ( 生物工程学
报) , 13( 4) : 400~ 405( in Ch inese)
3 Low ry DH, Rosebrough HJ, Farr AL et al . 1951. Protein measurement
w ith Folin phenol reagent . J Biol Chem ,193: 262~ 275
4 Wei D- Z(魏东芝) , Yuan W- K(袁渭康) , Yin G- L(尹光琳) et
al . 1992. S tudies on kinet ic model of Vitam in C tw ostep fermentat ion
process. Chin J Biot ech nol (生物工程学报) , 8 ( 3) : 277~ 282( in Chi
nese)
5 Zhang L- X(张龙翔 ) , Zhang T - F (张庭芳 ) , Li L - Y(李令媛 ) .
1981. Biochemical Experimental Methods and T echniques. Beijing:
People Educat ion Press. 112~ 119( in Chinese)
作者简介 冯 树, 女, 34 岁, 博士, 研究员. 1996 年 7 月于中
国医科大学获细胞生物学专业医学博士学位, 1998 年 6 月于中
国科学院沈阳应用生态研究所微生物学博士后流动站完成一
期博士后工作.现主持中国科学院∀百人计划∀研究项目, 从事
微生物资源研究. 已发表学术论文 30 篇. Email: Fengs @ iae,
syb. ac. cn
122 应 用 生 态 学 报 11卷