全 文 ：重金属污染土壤毒性的发光菌法诊断 3
李　彬 3 3 　李培军　王　晶　杨桂芬　张海荣　(中国科学院沈阳应用生态研究所 ,沈阳 110015)
【摘要】　应用明亮发光杆菌 T3 ( Photobacterium Phosphoreum)对重金属污染土壤的毒性进行诊断 ,确定了实验
室中采用人为定量投加污染物的情况下 ,土壤的最佳平衡时间为 24h ,最佳浸提时间为 2h ,最佳浸提剂为0. 1mol
·L - 1 Hcl. 对单一和复合污染条件下土壤毒性研究表明 ,单一重金属污染条件下 ,重金属的投加量与发光菌的发
光度间存在明显的相关性 ,根据剂量效应曲线得出 4 种重金属的 EC50分别为 Cd 26. 12mg·kg - 1 、Cu 291. 48mg·
kg - 1 、Zn 72. 46mg·kg - 1和 Pb 2174. 93mg·kg - 1 ,复合污染条件下 ,由于金属的协同作用 ,毒性明显增加 ,从而为
污染土壤的优先修复提供了理论依据.
关键词 　土壤 　毒性 　发光菌
文章编号 　100129332 (2001) 0320443204 　中图分类号 　X171. 5 　文献标识码 　A
Photobacterium phosphoreum assay on the toxicity of soil contaminated by heavy metals. L I Bin ,L I Peijun , WAN G
Jing , YAN G Guifen , ZHAN G Hairong ( Institute of A pplied Ecology , Chinese Academy of Sciences , S henyang
110015) . 2Chin. J . A ppl . Ecol . ,2001 ,12 (3) :443～446.
The toxicity of soil artificially contaminated by heavy metals was assessed with Photobacterium phosphoreum . The re2
sults showed that the duration of optimum balance was 24 hours , and that of optimum extraction was 2 hours. Two
leaching methods were compared , and data showed that optimum leaching solvent was hydrocarbon chloride with a
concentration of 0. 1mol·L - 1 HCL . Dose2response curve indicated that the content of heavy metals was positively re2
lated with the toxicity of soil. The general detection limit given by EC50 of soil contaminated by single heavy metal
were Cd 26. 12 mg·kg - 1 , Cu 291. 48 mg·kg - 1 ,Zn 72. 46 mg·kg - 1 and Pb 2174. 93 mg·kg - 1 . This study also indi2
cated the toxicity of complex heavy metals pollution in soil was stronger than that of individual element . The research
could provide a theoretic base for the remediation of soil contaminated by heavy metals.
Key words 　Soil , Toxicity , Photobacterium phosphoreum .
　　3 国家重点基础研究发展规划项目 ( G199901180825) 和中国科学院
重大资助项目 ( KZ9512B12207201203) .
　　3 3 通讯联系人.
　　2000 - 07 - 24 收稿 ,2001 - 01 - 15 接受.
1 　引 　　言
重金属作为土壤的主要污染物 ,对环境和人类的
健康造成了极大的危害 ,只有对污染土壤的毒性进行
快速诊断 ,才能为污染土壤的预防与治理提供依据. 在
土壤环境科学研究领域中 ,人们一直在试图寻找准确
评价环境污染物生物毒性 (包括急性毒性、亚急性毒性
和慢性毒性) 的方法[1 ,5 ] . 70 年代以来 ,Bulich 研究了
一种以发光菌 ( Photobacteri um ) 冻干制剂为基础的仪
器测定污染物毒性的方法 ,该法的可靠性和灵敏性均
可与传统的研究方法相媲美 ,而其迅速、简便和耗费低
廉的优点却是任何其它方法所远远不及的. 最初 ,此法
主要应用于水体污染物的毒性检测[6 ] ,以后逐步发展
形成了一系列标准的水生生态毒理学实验方法 ,但将
此法应用在土壤污染物毒性检测 ,目前尚无标准的实
验方法. 我国一些研究者已将其用于污染土壤毒性诊
断[2 ,8 ] ,但如何更好地确定土壤毒性的剂量2效应关
系 ,实现土壤毒性的快速诊断 ,从而为清洁土壤标准的
建立提供依据 ,仍然是人们面临的艰巨任务. 本文选取
了 3 种不同类型的土壤 ,在实验室中采用人工定量投
毒的方法 ,探讨了单一和复合污染条件下 ,土壤毒性变
化及其与发光菌相对发光度的关系 ,从而为实现土壤
毒性的发光菌诊断提供了理论依据.
2 　材料与方法
211 　供试材料
21111 供试土壤 　草甸棕壤采自中国科学院沈阳应用生态研
究所十里河生态站无污染实验小区 (0～20cm) ,实验选用过 20
目筛风干土 ,土壤 p H 6. 22 ,重金属含量分别为 Cd 0. 122、Cu
19. 1、Zn 49. 90 和 Pb 25. 7mg·kg - 1 .
21112 供试污染物 　CdCl2·2. 5H2O、CuSO4·5H2O、Pb (NO3 ) 2 、
ZnSO4·7H2O 均为分析纯试剂. 以水溶液的形式投加 ,投加量以
mg·kg - 1风干土计算.
21113 供试生物 　明亮发光杆菌 T3 ( Photobacterium phospho2
reum) ,购自中国科学院南京土壤研究所 ,采用的培养基为 :酵
母浸出汁 0. 5g , 胰蛋白胨 0. 5g , NaCl 3g , Na2 HPO4 0. 5g ,
KH2 PO4 0. 1g ,甘油 0. 3g ,蒸馏水 100ml 配制而成 ,p H6. 8 ,120
磅灭菌 30min.
应 用 生 态 学 报 　2001 年 6 月 　第 12 卷 　第 3 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,J un. 2001 ,12 (3)∶443～446
212 　实验方法
21211 土壤水浸液的制备 　称取 40g 过 20 目筛的土壤 ,按 1∶
2. 5 的比例用蒸馏水浸提 2h ,过滤 ,取滤液 20ml 按 3 %的比例
添加 NaCl 0. 6g ,进行生物毒性测定.
21212 土壤酸浸液的制备 　称取 40g 过 20 目筛的土壤 ,按 1∶
2. 5 的比例用 0. 1mol·L - 1 HCL 浸提 2h ,过滤 ,取滤液 20ml ,调
节 p H 为 6. 6 ,过滤定容 20ml ,按 3 %的比例添加 NaCl0. 6g ,进
行生物毒性测定.
21213 生物毒性测定 　采用南京土壤研究所研制的 GXY22 型
生物毒性测定仪按照 OECD 标准实验方法 [4 ] ,测定土壤浸提液
15min 的毒性.
21214 土壤平衡时间的确定 　称取 40g 草甸棕壤 ,投加 CdCl2·
2. 5H2O、CuSO4·5H2O、Pb(NO3) 2 、ZnSO4·7H2O 的水溶液 ,使其
浓度达 Cu 200mg·kg - 1 、Cd 25mg·kg - 1 、Pb 2000mg·kg - 1 、Zn
20mg·kg - 1 . 取不同平衡时间的土壤 ,烘干 ,浸提 2h 后进行生物
毒性测定.
21215 土壤浸提时间的确定 　称取 40g 草甸棕壤 ,投加 CdCl2·
2. 5H2O、CuSO4·5H2O、Pb(NO3) 2 、ZnSO4·7H2O 的水溶液 ,使其
浓度为 Cu 200mg·kg - 1 、Cd 25mg·kg - 1 、Pb 2000mg·kg - 1和 Zn
20mg·kg - 1 . 平衡 1d 后 ,取不同浸提时间的土壤 ,烘干后进行生
物毒性测定.
21216 重金属浓度的测定 　采用日本岛津 600A 型原子吸收分
光光度仪.
3 　结果与分析
311 　土壤平衡时间对发光菌发光强度的影响
从图 1 可以看出 ,当平衡 1d ,投加 Cd、Cu、Zn、Pb
的土壤浸提液的发光菌的相对发光强度分别为
79. 83 %、48. 95 %、47. 85 %和 30. 25 % ,而在平衡 14d
后 ,发光菌的相对发光强度为 78. 32 %、49. 73 %、
46. 21 %和 30. 79 % ,相对发光度与平衡 1d 无明显改
变 ,由此可看出 ,土壤对重金属离子的吸附作用 (包括
物理吸附及化学吸附) 在 1d 基本完成 ,从而确定了本
实验条件下土壤的最佳平衡时间为 1d ,缩短了实验时
间.
312 　土壤浸提时间对发光菌发光强度的影响
从图 2 可以看出 ,当提取时间为 0. 5h 时 ,投加不
同重金属土壤浸提液的发光菌相对发光强度都最大 ,
随着浸提时间的增加 ,发光强度逐渐下降 ,2h 后 ,发光
强度趋于平稳. 产生这一现象的原因主要在于吸附于
土壤表面的化合物或阴、阳离子与土壤溶液处于平衡
状态 ,具有解吸能力[7 ] ,而土壤对重金属的吸附和解
吸是一个动态平衡过程[3 ] ,解吸量的多少意味着在一
定条件下重金属对地下水和作物吸收等的潜在影响.
解吸的重金属可被认为是粘土矿物、铁锰氧化物、有机
质等主要组分吸附重金属中可被土壤溶液阴、阳离子
所交换的部分 ,这部分金属离子处于固液界面的双电
层的扩散层中 ,活性较高 ,易迁移 ,产生生态影响. 从图
2 可看出 ,30min 时 ,土壤对重金属的解吸不完全 ,浸
提液中重金属含量相对较低 ,发光菌相对发光强度较
高 ,当达到浸提平衡时提取液中重金属浓度不再发生
变化 ,发光菌发光强度最低 ;延长浸提时间 ,发光菌发
光强度也无明显改变 ,因此浸提时间 2h 为最佳[4 ] .
图 1 　土壤平衡时间对发光菌发光度的影响
Fig. 1 Effect of soil balance time on the luminescence of the strain T3.
Ⅰ. Cu(200mg·kg - 1) ,Ⅱ. Cd(25mg·kg - 1) ,Ⅲ. Pb(2000mg·kg - 1) , Ⅳ. Zn(20mg
·kg - 1) .下同 The same below.
图 2 　土壤浸提时间对发光菌发光度的影响
Fig. 2 Effect of extraction time on the luminescence of strain T3.
313 　单一重金属污染条件下典型土壤毒性与发光菌
发光强度的关系
从图 3 可以看出 ,采用土壤水浸液和酸浸液方式 ,
土壤毒性明显不同 ,发光菌的发光强度呈现出明显的
变化 ,随着土壤中重金属投加量的增加 ,采用水浸液方
式 ,发光菌的发光强度与重金属的投加量无明显相关
性 ,而采用酸浸液方式 ,发光菌的发光强度与投加量呈
现出明显的相关性. 从而证明在本实验条件下 ,水浸液
方式不能正确反映土壤的毒性 ,而酸浸液方式能充分
反映土壤的毒性 ,为土壤毒性的发光菌法诊断奠定了
基础.
444 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　12 卷
图 3 　重金属污染土壤浸提液对发光菌发光度的影响
Fig. 3 Effect of extraction solution from soils contaminated by heavy metals
on the luminescence of the strain T3. Ⅰ. 水浸液 Water extraction solution ,
Ⅱ. 酸浸液 Acid extraction solution.
　　同时 ,从图3还可看出 ,4种重金属污染土壤的毒
性强弱有明显的差异 ,Zn 污染的土壤 ,当 Cd 投加量为
1. 5mg·kg - 1时 ,发光菌的发光度为 87. 23 % ; 20mg·
kg - 1时 ,发光度为 63. 68 % ;当 Cd 投加量升高到 30mg
·kg - 1时 ,发光菌的发光度即降低到 26. 97 % ,Cu 投加
量为 100mg·kg - 1 时 ,发光菌的发光度为 91. 73 % ;
200mg·kg - 1时 ,发光度为 75. 41 % ;而 300mg·kg - 1
时 ,发光度仅为 43. 09 % ,对于 Pb 污染的土壤 ,投加量
为 500mg·kg - 1时 ,发光度为 80. 43 % ; 1500mg·kg - 1
时 ,发光度为 58. 64 % ; 3000mg·kg - 1 时 ,发光度为
31. 24 % ,当土壤中 Zn 投加量为 30mg·kg - 1时 ,酸浸
液发光菌的发光度为 70. 77 % ;40mg·kg - 1时 ,发光菌
的发光度为 61. 64 % ;当 Zn 浓度升高到 60mg·kg - 1
时 ,发光菌的发光度仅为 35. 5 % ,由此可以认为对于
草甸棕壤 ,Cd 污染土壤的毒性最强 ,而 Pb 污染土壤的
毒性最弱.
将土壤重金属投加量和发光菌的发光度进行计算
机优化拟和 ,结果见表 1. 从表 1 可以看出 ,重金属的
投加量与发光菌发光度之间呈显著相关 ,以发光菌发
光度抑制一半 ( EC50) 为标准 ,根据计算机确定的优化
拟和方程得出土壤重金属投加量分别为 : Cd 26. 12mg
·kg - 1 、Cu 291. 48mg·kg - 1 、Zn 46. 03mg·kg - 1和 Pb
2174. 93mg·kg - 1 .
表 1 　重金属投加量与发光菌相对发光度的关系
Table 1 Relationship bet ween the concentration of heavy metals added to
soil and the luminosity of Photobacterium phosphoreum
重金属
Heavy
metals
投加金属浓度与发光菌
发光度的优化拟和方程
Optimum quasi2conjunction equation of
concentration (C) with buminosity ( T)
r EC50
Cd Y = - 1. 4X + 86. 299 0. 9456 3 3 26. 12
Cu Y = - 0. 223X + 115 0. 9807 3 3 291. 48
Zn Y = - 53. 33lnX + 254. 33 0. 9877 3 3 46. 03
Pb Y = - 0. 015X + 83. 059 0. 9636 3 3 2174. 93
314 　复合污染条件下的土壤毒性对发光菌发光度的
影响
从表 2 可以看出 ,由于复合污染 ,重金属之间的相
加、协同、竞争等作用 ,使草甸棕壤的毒性在复合污染
情况下与单一重金属污染时相比有了明显的变化 ,对
4 种重金属在复合污染条件下对发光菌发光度的影响
进行极差分析 ,结果表明 , Pb 对发光菌发光度的影响
最大 ,R (极差) 为 47. 1 ,其次是 Cu、Zn , R 值分别为
34. 51和 15. 84 ,而 Cd 对发光菌发光度的影响最小 ,R
值仅为 15. 27. 当 4 种重金属分别以最低浓度 Cd 1. 0
mg·kg - 1 、Cu 50mg·kg - 1 、Zn 10mg·kg - 1和 Pb 300mg
·kg - 1投加时 ,土壤酸浸液对发光菌无毒性 ,相反却产
生较强的刺激作用 ,使发光菌的发光度达对照的
111. 09 %. 当 Cu、Zn、Pb 3 种重金属分别以最高浓度
Cu 150mg·kg - 1 、Zn 30mg·kg - 1和 Pb 1000mg·kg - 1 ,
Cd 以 1. 0mg·kg - 1投加时 ,土壤酸浸液对发光菌有强
烈的毒性 ,发光菌的发光度仅为对照的 13. 64 %. 另外
从表中可以看出使发光菌发光度约为对照的 50 %时 ,
土壤中 4 种重金属的投加量分别为 Cd 5. 0mg·kg - 1 、
Cu 150mg·kg - 1 、Zn 20mg·kg - 1和 Pb 300mg·kg - 1 .
5443 期 　　　　　　　　　　　　　　　李 　彬等 :重金属污染土壤毒性的发光菌法诊断 　　　　　　　　　
表 2 　草甸棕壤 L9( 34)正交实验结果分析
Table 2 Results of orthogonal array L9( 3 ×4) ( mg·kg - 1dry soil)
实验号
No.
Cd
1
Zn
2
Cu
3
Pb
4
RL
1 1 (1. 0) 1 (10) 1 (50) 1 (300) 111. 09
2 1 (1. 0) 2 (20) 2 (100) 2 (700) 41. 18
3 1 (1. 0) 3 (30) 3 (150) 3 (1000) 13164
4 2 (5. 0) 1 (10) 2 (100) 3 (1000) 31126
5 2 (5. 0) 2 (20) 3 (150) 1 (300) 52198
6 2 (5. 0) 3 (30) 1 (50) 2 (700) 48158
7 3 (10) 1 (10) 3 (150) 2 (700) 25167
8 3 (10) 2 (20) 1 (50) 3 (1000) 36115
9 3 (10) 3 (30) 2 (100) 1 (300) 58128
X1 (1 水平总计) 165191 168102 195182 222135 6 X =
X2 (2 水平总计) 132182 130631 130172 115143 418183
X3 (3 水平总计) 12011 12015 92129 81105ŠX1 5513 56101 65127 74112ŠX2 44127 43144 43157 38148ŠX3 40103 40117 30176 27102
R 15127 15184 34151 4711
RL :发光菌相对发光度 ( %) Relative luminescence of strain T3.
4 　结 　　论
411 　应用发光菌法对重金属污染土壤的毒性进行诊
断 ,方法是可行的 ,并且快速、敏感、操作迅速.
412 　0. 1mol·L - 1 HCL 浸提土壤能充分反映土壤的毒
性 ,重金属的投加量与发光菌的发光度仍极显著相关 (α
< 0101) ,而水浸液的方法不能正确反映土壤的毒性.
413 　在实验室中 ,采用人工投毒的方法 ,土壤的最佳
平衡时间为 24h ,最佳浸提时间为 2h.
414 　单一重金属污染条件下 ,草甸棕壤 4 种重金属的
EC50为 Cd 26. 12mg·kg - 1 、Zn 46. 03mg·kg - 1 、Cu
291. 48mg·kg - 1和 Pb 2174. 93mg·kg - 1 .
415 　单一污染条件下 ,4 种重金属在 3 种土壤中毒性
的强弱 Pb < Cu < Zn < Cd.
416 　种重金属复合污染条件下的毒性 EC50 值 ,草甸
棕壤 Cd 5. 0mg·kg - 1 、Cu 150mg·kg - 1 、Zn 30mg·kg - 1
和 Pb 300mg·kg - 1 .
417 　复合污染条件下 ,重金属污染土壤的 EC50值比
单一污染物污染条件下要小得多 ,表明重金属存在协
同作用.
参考文献
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作者简介 　李 　彬 ,女 ,1974 年生 ,硕士 ,主要从事污染生态和
生态毒理学研究 ,发表论文 4 篇. E2mail : libin-libin @hotmail.
com
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