全 文 ：类黄酮激活根瘤菌在油菜上结瘤和固氮的研究初报 3
胡小加 3 3 　张学江　(中国农业科学院油料作物研究所 ,武汉 430062)
Edward C. Cocking 　Gordon S. Webster 　(诺丁汉大学生命科学系 ,诺丁汉 N G7 2RD 英国)
Nodulation of flavonoid2stimulated rhizobia on oilseed rape and nitrogen f ixation. Hu Xiaojia , Zhang Xuejiang
( Institute of Oil Crops , Chinese Academy of A gricultural Sciences. W uhan , 430062) , Edward C. Cocking and
Gordon S. Webster ( Depart ment of L if e Science , U niversity of Nottingham , N G7 , 2 RD , U K) . 2Chin. J . A p2
pl . Ecol . ,1999 ,10 (1) :127～128.
Flavonoid2stimulated rhizobia were used to inoculate the seedling roots of oilseed rape , making the rhizobia intrude
into the roots , form para2nodules and fix nitrogen. The results show that rhizobia stimulated by flavonoid could ef2
fectively invade root cells and form para2nodules containing rhizobia , with nodulation rate of 100 %. The strains iso2
lated from para2nodules of oilseed rape could successfully re2inoculated to original host . The determination of anti2
serum show that the strains could agglutinate with test rhizobia. Electron microscopic observation shows that the
cells of para2nodule were full of bacteria. The activity of N2fixing enzyme in para2nodules determined by acetylene
reduction method was 142. 01 nmol C2 H4·g - 1·h - 1 .
Key words 　Flavonoid , Rhizobium , Oilseed rape.
　　3 国家自然科学基金资助项目 (39470016) .
　　3 3 通讯联系人.
　　1996 - 07 - 16 收稿 ,1996 - 12 - 28 接受.
1 　引 　　言
　　自然界大多数植物不具备共生固氮系统 . 在非豆科中除
Parasponia[8 ]外 ,至今还未发现其它非豆科植物能像豆科植物
一样与根瘤菌形成共生. 聂延富报道了 2. 42D 能使小麦根系
诱导结瘤的作用 [2 ] . Al2Mallen 等研究了根瘤菌在水稻和油菜
幼苗根系上形成的根瘤结构 [4 ,5 ] ,这些根瘤的形成是由于利
用酶降解了根细胞壁 ,去掉了根瘤菌进入植物根部细胞的障
碍而发生的. Tchan 等[6 ]通过固氮螺菌进一步证实 2. 42D 对
小麦结瘤的作用 ,并称这种根瘤菌结构为“类根瘤”. 曹燕珍
等[3 ]用协助细菌法来促进固氮徽生物和非豆科植物形成类根
瘤. 胡小加[1 ]采用果胶细菌法诱导根瘤菌进入油菜根系结瘤.
类黄酮是豆科植物所产生的一类活性物质. 本研究是采用类
黄酮激活根瘤菌的结瘤基因 ,使被激活的根瘤菌侵入油菜根
系结瘤并固氮.
2 　材料与方法
2 . 1 　生物材料
　　试验用油菜品种为甘蓝型油菜 Alaska ,根瘤菌为田菁
( Sesbania rost rata) 根瘤菌株 A zorhizobium caulinodans ORS
571.以上生物材料均由英国诺丁汉大学生命科学系植物基因
操纵实验室提供.
2 . 2 　类黄酮 (Naringenin)
　　苷配基 ,4’. 5. 72三羟黄烷酮 (Sigma chemical Co St . Louis ,
USA) .
2 . 3 　种子处理和幼苗的培养
　　种子用 0. 1 %HgCl2 进行常规表面灭菌 ,在 28 ℃下催芽.
待种子萌发后 ,将胚根放置在含有半固体无氧培养基试管中.
26 ℃黑暗条件下培养 24h. 同时加入 2 ×10 - 5 (M) 的类黄酮和
根瘤菌 (1 ×108 细胞 ml - 1) . 再将幼苗置于 24 ℃光照室培养 ,
光照强度为 400μEm - 2·S - 1 .
2. 4 　油菜类根瘤内含菌的分离、回接、抗血清制备和抗血清
凝集反应
　　当油菜生长至 30d ,选择较大的类根瘤 ,按常规表面灭菌
后 ,作平板分离 ,取单菌落纯化. 用纯分离物作回接试验. 抗
血清制备和抗血清凝集反应按文献[9 ]描述的方法进行.
2. 5 　固氮酶活性测定
　　取生长在试管中的类根瘤 ,用乙炔还源法测定其固氮活
性[1 ] .
2. 6 　透射电镜观察
　　将培养 30d 的类根瘤固定在 2. 5 %三戊二醛/ 25m mol·
L - 1磷酸氢二钾溶液中 ,p H 为 6. 8. 然后再以 1 %锇酸固定. E2
pon 812 环氧树脂包埋 ,超薄切片. 作醋酸双氧铀2柠檬酸铅双
重染色. 电镜观察.
3 　结 　　果
3. 1 　类黄酮激活根瘤菌在油菜上形成类根瘤
　　类黄酮在适合的浓度下 (2 ×10 - 5 M) 能有效地激活根瘤
菌的结瘤基因 ,使根瘤菌侵入油菜根部 ,并使其发生变异. 接
种 15d 后 ,根部形成类根瘤 (图版 1) ,结瘤率为 100 %. 而空白
对照、类黄酮对照和根瘤菌对照根部均无变异出现.
3. 2 　类根瘤内含菌的分离回接及抗血清反应
　　从油菜类根瘤中分离出的细菌 ,经纯化后回接到原寄主
植物田菁上. 在接种 14d 后能在其上结瘤 ,并能与 ORS571 产
应 用 生 态 学 报 　1999 年 2 月 　第 10 卷 　第 1 期 　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,Feb. 1999 ,10 (1)∶127～128
生抗血清反应. 证明所分离的菌为原接种的根瘤菌 ORS571.
3 . 3 　固氮酶活性测定
　　经类黄酮激活的根瘤菌接种的油菜 ,生长 25d 均能形成
类根瘤. 生长 30d 后用乙炔还源法测定了 180 株油菜苗的固
氮酶活性. 结果表明类黄酮加根瘤菌 ORS571 形成的类根瘤
具有明显的乙炔还原作用 (表 1) ,但和田菁根瘤固氮酶活性
相差甚远 ,仅为它的 6. 24 %.
表 1 　油菜类根瘤的固氮酶活性
Table 1 Nitrogenase activity of oilseed rape para2nodules
处理
Treatments
试验重复
Replications
固氮酶活性
Nitrogenase activity
(nmol C2H4·g - 1
·h - 1 ±SE)
空白对照 Blank control 180 0
类黄酮对照 Flavonoid control 180 0
ORS571 对照 ORS571 control 180 0
类黄酮加 ORS571 Flavonoid + ORS571 180 142. 01 ±11. 76
图版说明 Explanation of Plate
1. 油菜类生根瘤. 类生根瘤的形状大小与根瘤相同. 标尺 :0. 05cm.
根瘤 ( N) . 根 ( R) . The para2nodule of oilseed rape. The para2nodule
showed the same size and shape as its root counterparts. Nodule (N) .
Root (R) . 2. 类生根瘤透射电镜切片. 植物细胞内充满根瘤菌 (3000
×) . 植物细胞 ( PC) . 植物细胞壁 ( PCW) . 根瘤菌 ( A) . Transverse
section of the para2nodule. The plant cell full of rhizobia ( 3000 ×) .
Plant cell ( PC) . Plant cell wall ( PCW) . Rhizobia (A) .
3. 4 　电子显徽镜观察
　　电镜观察可明显地看到类根瘤细胞内有感染细菌的分布
(图版) .
4 　讨 　　论
　　功能瘤的形成是一个复杂的过程 ,包含有不同表型的阶
段[9 ] ,而每个阶段既决定于细菌基因 ,又依赖于寄主植物的基
因. Truchet [8 ]等报道了在紫花苜蓿根系自发形成的无根瘤菌
的瘤子是有组织的结构而不是变态的肿瘤. 在豆科中 ,有结瘤
的遗传信息 ,而根瘤菌的基因仅仅作为起动植物的结瘤过程.
在非豆科植物中 ,可能也有类似豆科植物的全部结瘤遗传信
息 ,或者有部分有关的遗传信息. 所以有些植物 ,像油菜可能
有部分基因与豆科植物中结瘤基因 DNA 是同源的. 研究表
明 ,根瘤菌和非豆科不但可以形成类根瘤 ,而且这种根瘤具有
乙炔还原作用. 为了构建一个新的共生体 ,不但要选择根瘤菌
和植物的适当组合 ,也需要对二者进行遗传改造 ,使它们相互
适配. 要实现像根瘤菌2豆科植物共生体系的高固氮功能 ,并
扩大到油菜、小麦、水稻等许多非豆科植物 ,尚需深入研究.
致谢 　本研究的部分工作是在英国诺丁汉大学生命科学系受
英国皇家学会资助完成的.
参考文献
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symbiosis. In : Newton , W. E. et al . eds. Nitrogen Fixation. Uni2
versity Park Press. 103～129.
作者简介 　胡小加 ,男 ,1960 年生 ,副研究员 ,从事非豆科植
物结瘤固氮研究 ,发表文章 10 余篇.
821 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　10 卷