全 文 ：中华绒螯蟹幼体消化道甲壳质消化细菌的研究*
薛俊增1* * 吴惠仙2
( 1 杭州师范学院生物系, 杭州 310036; 2浙江大学生命科学学院, 杭州 310012)
On the chitin digestive bacteria from larval gut of Eriocheir sinensis. XUE Junzeng1 , WU Huixian2
( 1Depar tment of Biology , Hangzhou Normal College, Hangzhou 310036, China; 2College of L if e Sciences ,
Zhej iang Univer sity , Hangzhou 310012, China) . Chin . J . A pp l. Ecol . , 2003, 14( 5) : 834~ 836.
The foregut, midgut and hind gut of Er iocheir sinensis from the first Zoea to Megalopa w ere dissected under
asepsis condition. Bacteria w ere separated by plate culture after liquid medium culture. A chitin digestive bacteri
um was separated from the first Zoea fo regut. T he chitin dig est ive bacteria weren t founded in the same experi
ment from the second Zoea to Megalopa. The chitin digestive bacteria showed roundness, protuberance, glassy
humid, margin regular , milkyellow , aerotolerant anaerobe, and grow ing intently surrounding the chitin on the
plate cultur e medium. The chitin could promote the growt h r ate o f some digestive bacteria in lar val gut of the
crab.
Key words Er iocheir sinensis , Gut, Chit in, Digestiv e bacteria.
文章编号 1001- 9332( 2003) 05- 0834- 03 中图分类号 Q959. 223+ . 63 文献标识码 A
* 浙江省自然科学基金资助项目( 397278) .
* * 通讯联系人.
2001- 04- 09收稿, 2001- 07- 23接受.
1 引 言
随着中华绒螯蟹( Er iocheir sinensis)人工育苗规模的扩
大,生产实践中有关小型甲壳类活体饵料投喂问题受到生产
者和一些学者的重视[ 1, 3, 4] , 本研究分析中华绒螯蟹幼体消
化道内甲壳质消化细菌,试图从该方面探讨中华绒螯蟹幼体
与甲壳类活体饵料动物之间的关系.有关水生动物消化道内
甲壳质消化细菌,曾在鱼胃中有发现. 中华绒螯蟹消化道内
微生物的研究未见有报道, 我们对中华绒螯蟹氵蚤 大眼幼
体消化道内甲壳质消化细菌进行了分离筛选,以探讨其消化
机理,并为人工育苗生产中合理选择时机投喂卤虫( A r temia
salina)、枝角类等甲壳类活体饵料提供理论基础.
2 材料与方法
21 材料
中华绒螯蟹 ~ !期氵蚤状幼体和大眼幼体于 1999 年
3~ 4 月采自浙江省宁波市水产研究所河蟹育苗场, 甲壳质
为浙江玉环县海洋生物化学有限公司(试剂级)生产, 实验用
培养液、培养基分别为肉汤蛋白胨培养液和营养琼脂培养
基.
22 细菌分离
将 ~ !期氵蚤状幼体和大眼幼体在无菌条件下用无菌
水冲洗 3遍后,再用 75%酒精浸洗 1~ 2min 进行体表消毒,
然后在严格无菌操作下活体解剖幼体前肠和中、后肠. 取部
分前肠和中、后肠放入添加甲壳质和未添加甲壳质的营养肉
汤蛋白胨培养液中, 置 28~ 30∀ 恒温箱分组作一般培养和
CO2 培养.待营养液出现浑浊后,用接种环. 沾取少量培养液
分别于已放置无菌甲壳质的营养琼脂平板(片状甲壳质置于
平板中央)和未放置甲壳质的营养琼脂平板上作一般培养和
CO2培养条件下的分离培养.筛选获取形态一致可利用甲壳
质的优势菌落, 取单个菌落进一步划线纯化, 直至获得纯培
养菌株, 然后转接到含甲壳质的营养琼脂斜面保存.
3 结果与分析
3 1 氵蚤 幼体消化道甲壳质消化细菌的分离
氵蚤 幼体的前肠经不含有甲壳质培养液一般培养后,
再在不含有甲壳质和含有甲壳质的平板培养基上分别进行
一般培养和 CO2 培养, 分离出的细菌在这 4 种平板培养基
上,菌落的形态、大小、颜色和散发的气味都一致 (表 1) , 不
专性利用甲壳质,兼性厌氧. 前肠经不含甲壳质培养液 CO2
培养后, 平板培养结果也显示分离到的细菌亦不专性利用甲
壳质(表 1) .前肠在含甲壳质的培养液中一般培养后, 平板
培养显示不含甲壳质条件下的一般培养和 CO2 培养均无细
菌生长, 而含甲壳质一般培养和 CO2 培养的平板培养基上
有一致的菌落生长(表 1) , 为专性利用甲壳质的细菌, 兼性
厌氧. 中、后肠在经不含甲壳质培养液一般培养后 ,平板培养
显示分离到的细菌为好氧菌, 对甲壳质不专性利用, 但甲壳
质能促进分离到的细菌的生长(表 1) . 中、后肠经不含甲壳
质培养液 CO2 培养后,平板培养分离到一株厌氧菌, 且不利
用甲壳质(表 1) .中、后肠经含甲壳质培养液一般培养后, 平
板培养分离到一株好氧的细菌,不专性利用甲壳质, 但甲壳
质能促进该菌的生长(表 1) .中、后肠经含甲壳质培养液CO2
培养后,平板培养分离到兼性厌氧菌, 此菌亦不专性利用甲
应 用 生 态 学 报 2003 年 5 月 第 14 卷 第 5 期
CHINESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY, May 2003, 14( 5)#834~ 836
壳质,但甲壳质也能促进其生长 (表 1) .对氵蚤 幼体消化道
甲壳质消化细菌的分离培养结果显示, 氵蚤 幼体前肠中存
在专性利用甲壳质的细菌, 且只在含甲壳质的液体培养和含
甲壳质的平板培养条件下才分离到. 中、后肠中虽不存在甲
表 1 氵蚤 幼体消化道甲壳质消化细菌的分离筛选
Table 1 Separation of chi tin digestive bacteria from larval ( Z1) gut of Eriocheir sinensis
消化道
Gut
培养液培养
L iquid medium
culture
平板培养 Plate cult ure
不含甲壳质Without chitin
一般培养
Normal culture
CO2培养
Culture in CO2
含甲壳质With chitin
一般培养
Normal culture
CO2培养
culture in CO2
前肠Fore
gut
不含甲壳质一般培养 Nor
mal culture without chitin
菌落圆形, 微凸, 直径 0. 8~
1. 5mm, 光滑湿润, 边缘整齐,有刺激性气味, 乳白色
同左 同左 同左
不含甲壳质 CO2 培养 Cul
ture in CO2 without chitin
菌落圆形, 略凸, 直径 0. 1~
0. 6mm, 光滑湿润, 边缘整齐,有刺激性气味, 乳白色
同左 同左 同左
含甲壳质一般培养 Normal
cult ure with chitin
不生长 不生长 菌落集中生长在甲壳质周围, 圆形, 湿润隆起, 边缘光滑整齐, 直径约 1mm,乳黄色
同左
含甲壳质 CO2 培养 Culture
in CO2 with chitin
不生长 不生长 菌落集中生长在甲壳质周围, 圆形, 光滑湿直径 0. 1
~ 0. 6 mm, 凸面, 边缘整齐, 无刺激性气味, 老龄菌能产生不溶于水的淡黄色素
菌落生长形态同左稍偏小直径为 0. 05 ~ 0. 5
mm
中、后肠
Midgut
and hind
gut
不含甲壳质一般培养 Nor
mal culture without chitin
菌落圆形, 直径0. 05 ~ 0. 1
mm ,略凸, 光滑湿润, 边缘隆起, 透明, 有刺激性气味
不生长 菌落圆形, 直径 0. 3~ 0. 5
mm,湿润, 乳黄色,在甲壳质周围长势良好
不生长
不含甲壳质 CO2 培养 cul
ture in CO2 without chitin
不生长 菌落圆形, 平台状干燥有皱纹,直径,
1. 5~ 2mm, 边缘有小缺刻,白色
不生长 同不含甲壳质 CO2 培养
含甲壳质一般培养 Normal
cult ure with chitin
不生长 不生长 菌落圆形,凸面, 直径 0. 3
~ 1mm, 光滑湿润,边缘整齐, 乳黄色,分布于整个平板, 甲壳质周围生长良好
不生长
含甲壳质 CO2 培养 Culture
in CO2 with chitin
不生长 不生长 同右 菌落圆形,微凸,直径0. 1
~ 0. 8mm, 光滑湿润边缘整齐, 半透明, 略有刺激性,乳黄色,分布整个平板,甲质周围生长良好
表 2 氵蚤∃~ 氵蚤!幼体消化道甲壳质消化细菌的分离筛选
Table 2 Separate the chitin digestive bacteria from larval ( Z2~ Z5) gut of Eriocheir sinensis
消化道
Gut
液体培养
Liquid medium cult ure
平板培养 Plate culture
一般培养 Normal culture CO2 培养Culture in CO2
氵蚤∃Z2 一般培养 Normal culture 菌落圆形隆起, 在整个平板上生长良好. 直径0. 5~ 2 同左
前肠 Foregut CO2 培养 Culture in CO2 mm,湿润, 乳白色,有刺激性气味分离到两株优势菌, 同左整个平板上生长良好,菌株 1圆形凸面, 湿润光滑, 边缘整齐, 直径0. 5~ 1mm半透明. 菌株 2圆形隆起,黄色, 直径 1~ 2mm, 湿润光滑,边缘整齐
中、后肠 一般培养 Normal culture 不生长 同左
M idgut and hind gut CO2 培养 Culture in CO2 整块平板上生长良好, 菌落圆形, 略凸, 湿润光滑, 边缘整齐粘液状, 直径0. 1~ 0. 6mm白色 同左氵蚤% Z3 一般培养 Normal culture 菌落圆形凸面,光滑湿润, 边缘整齐, 直径 0. 2~ 1mm,有刺激性, 半透明,整个平面上均生长 不生长前肠 Foregut CO2 培养 Culture in CO2 不生长 菌落圆形凸面. 直径 0. 3~ 1mm, 光滑湿润,边缘整齐, 有臭味,乳白色中、后肠 Midgut and 一般培养 Normal culture 菌落圆形, 略凸,光滑湿润, 边缘整齐, 不生长
hind gut 直径为 0. 1~ 0. 8mm, 有刺激性气味, 乳白色
CO2 培养 culture in CO2 不生长 菌落圆形,平展, 湿润,边缘整齐, 直径 1~
5mm,无刺激性气味, 乳白色氵蚤& Z4 一般培养 Normal culture 菌落圆形, 乳头凸, 湿润光滑, 边缘整齐, 直径 1 ~
3mm, 有气味,半透明 不生长前肠 Foregut CO2 培养 Culture in CO2 不生长 菌落圆形, 湿润光滑, 边缘整齐, 直径 0. 2mm, 有气味,蔓延成薄膜, 乳白色, 整个平面上均生长,甲壳质周围有明显凝集圈中、后肠 Midgut and
hind gut
一般培养 Normal Culture 菌落变形虫状,规则平展, 干燥有皱纹, 边 缘有缺刻,直径 1~ 3mm, 白色,有芳香味 不生长
CO2 培养 Culture in CO2 同右 菌落圆形,凸面, 光滑湿润,边缘整齐, 直径
0. 5~ 1mm, 半透明氵蚤! Z5 一般培养 Normal culture 菌落圆形, 湿润光滑, 边缘整齐,直径 0. 3~ 1mm, 有气味, 淡黄色,整个平面均生长 不生长前肠 Foregut CO2 培养 Culture in CO2 不生长 菌落圆形隆起, 湿润光滑, 边缘整齐, 直径
2~ 3mm, 乳黄色中、后肠 Midgut and
hind gut
一般培养 Normal culture 菌落淡黄色, 圆形,凸面, 湿润光滑, 边缘整齐, 直径为
0. 5~ 1mm有臭味 不生长
CO2 培养 Culture in CO2 不生长 分离到两株优势菌,菌株 1黄色, 菌株2 锈色,两菌株菌落均圆形隆起, 湿润光滑, 边缘整齐,直径 0. 2~ 2mm, 有臭味
8355 期 薛俊增等:中华绒螯蟹幼体消化道甲壳质消化细菌的研究
壳质消化细菌,但甲壳质能促进其中某些细菌的生长. 不含
甲壳质的液体培养和平板培养,无论在一般培养还是 CO 2 培
养条件下,都没有分离到专性利用甲壳质的细菌.
32 氵蚤∃大眼幼体消化道甲壳质消化细菌的分离
对氵蚤 幼体消化道甲壳质消化细菌的分离显示 , 液体
培养和平板培养在不含有甲壳质的条件下, 一般培养和 CO2
培养条件都分离不到专性利用甲壳质的细菌.据此实验过程
中对氵蚤∃大眼幼体分离消化道甲壳质消化细菌的培养条
件进行了调整,取消不含甲壳质条件下的液体培养和平板培
养,所有实验在含有甲壳质条件下进行. 实验结果表明,在氵蚤
∃氵蚤!幼体消化道内没有分离到专性甲壳质消化细菌,但氵蚤
&前肠在含甲壳质的培养液中到 CO2 培养后, 平板培养分离
到 1株厌氧的细菌, 该菌不专性利用甲壳质, 但可促使甲壳
质周围凝集圈的形成(表 2) . 在大眼幼体消化道内同样也没
有分离到专性甲壳质消化细菌,但甲壳质对分离到的细菌都
有促生长作用.
4 讨 论
将中华绒螯蟹氵蚤 幼体前肠置于添加甲壳质的培养液
中增菌培养后划平板发现, 菌落集中生长在甲壳质周围, 而
在离甲壳质较远的培养基和未放置甲壳质的平板上则均不
生长。由此可见, 甲壳质是此菌生长的必备条件, 为专性甲
壳质消化细菌,其能消化分解甲壳质从而获取能源. 同时发
现,经 CO2 分离培养和一般分离培养下菌落的形态特征略有
差异,这可能主要是由生长条件差异所致, 但也不排除氵蚤
幼体内存在有不同甲壳质消化细菌的可能. 此外, 研究发现
甲壳质对氵蚤 幼体中后、肠内分离到的细菌有促生长作用,
我们认为该菌虽然不以甲壳质为主要能源 ,但在代谢过程中
能利用甲壳质.在氵蚤∃幼体大眼幼体的消化道内也无专门
以甲壳质为其能源或营养来源的细菌, 但甲壳质对有些菌株
有促生长作用,说明这些菌其在其代谢过程中也能分解利用
甲壳质从而促进自身生长, 但并不以甲壳质为唯一的能源.
对大眼幼体的前肠增菌培养中发现, 甲壳质的存在改变了菌
株的菌落形态.氵蚤&幼体前肠的 CO 2 分离培养菌在甲壳质
周围则形成了凝集圈,这可能是此菌株在利用甲壳质的代谢
过程中产生了不同的代谢产物所致.
有关报道从不同的角度进行了蟹类幼体对饵料选择、摄
食、利用的研究, 堵南山等[ 1]、李富花等[ 6]、朱丽岩等[ 11]根据
胃磨的发育情况提出, 中华绒螯蟹、锯缘青蟹 ( Scy lla ser r a
ta)、三疣梭子蟹( Por tunus tr ituberculatus )等皆以氵蚤 %期为
投喂卤虫最合适的时期. 江洪波等[ 5] 研究褶皱臂尾轮虫
( Branchionus p licatilis)、卤虫对中华绒螯蟹幼体发育、存活
的影响也认为,氵蚤%期为最适的换饵投喂卤虫时期. 但何林
岗等[ 3]研究发现,中华绒螯蟹从氵蚤 起就可摄食卤虫无节
幼体, 并能正常的发育为幼蟹, 龚孟忠[ 2]研究锯缘青蟹和三
疣梭子蟹幼体饵料发现二者的氵蚤 幼体皆能利用卤虫. 实
践也证明,在中华绒螯蟹育苗生产中, 氵蚤 期适当投喂卤虫
可提高成活率.
氵蚤 幼体前肠中存在专性甲壳质消化细菌, 而它的中
肠、后肠以及氵蚤∃大眼幼体消化道内无专性甲壳质消化细
菌.主要由于氵蚤 幼体期前肠中胃磨发育不全[ 1] , 对小型甲
壳类活体饵料不能通过机械消化磨碎外包的甲壳以供进一
步消化需要,甲壳质消化细菌的存在则以化学消化的方式弥
补了此不足,中、后肠主要是对食物进行进一步的消化吸收,
故无专性甲壳质消化细菌.氵蚤∃大眼幼体机械消化功能加
强,同时前、后肠内表皮发生蜕皮, 肠道本身具有了几丁质
酶,甲壳质消化细菌不再成为必需, 导致在氵蚤 ∃幼体大眼
幼体消化道内未离到专以甲壳质为能源的消化细菌. 几丁质
酶为专一性水解甲壳质的水解酶[ 9] , 许多微生物能够分泌几
丁质酶,除真菌、放线菌外细菌也能够分泌几丁质酶, 含几丁
质酶的细 菌可以利 用几丁质 作为碳源 和能量的 来
源[ 4, 7, 8, 10] , 中华绒螯蟹氵蚤 幼体前肠中的甲壳质消化细菌
分泌几丁质酶,可分解食物中的甲壳质作为碳源和能量的来
源,但更重要的意义在于其能将小型饵料甲壳动物的甲壳分
解,以利于进一步的消化.
致谢 宁波大学尤仲杰先生、宁波市水产研究所施祥元、柳
海先生在实验过程中提供大力支持和帮助, 特此致谢!
参考文献
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作者简介 薛俊增,男, 1966 年生,博士, 副教授,主要从事甲
壳动物发育生物学、生态学研究, 发表论文 20 余篇. Email:
jzxue@ hztc. edu. cn
836 应 用 生 态 学 报 14卷