全 文 ：寄主和分布区系不同的球孢白僵菌
菌株近缘关系的研究*
王成树 李增智 樊美珍 韩宝瑜 (安徽农业大学森林利用学院,合肥 230036)
摘要 观察、测定了来源不同的球孢白僵菌 19 个菌株的培养性状、产孢量、萌发中时、
水分活性、紫外照射活率、水浴活率等指标,将培养性状编码后,由所得的 8 个指标对供试
菌株求相关系数矩阵.分析表明, 不同菌株近缘关系的远近主要由菌株原始分布区系距离
远近所决定,受寄主不同的影响次之.来源于相同(或相近)地区的菌株相关系数可达极显
著水平,而从相同寄主角度分析, 得到菌株间的相关系数有高有低, 多表现为相关不显著.
关键词 球孢白僵菌 近缘关系 寄主 分布区系
Near relation characterization of Beauveria bassiana strains isolated from different hosts and
geographic origins. Wang Chengshu, L i Zengzhi, Fan Meizhen and Han Baoyu ( Anhui Agr i
cultural Univ ersity , H ef ei 230036) . Chin. J . A pp l . Ecol . , 1998, 9(2) : 189~ 194.
The culture characterist ics, spo rulation, half germinat ion time, rapid disand rehydration via
bility , ultraviolet radiation viability and bathing viability of 19 different source strains of Beau
ver ia bassiana were observed or determined. With coding of culture char acteristics, t he correla
tio n coefficient halfmatr ixes of strains w ere calculated according to the 8 acquired indexes. The
results indicate that t he near relation of different str ains w as mainly determined by the distance
among original geographic distr ibutions, and secondly by the hosts. T he corr elation of different
strains fr om the same or close area had a significant differ ence, but t hat from different hosts did
not have it.
Key words Beauver ia bassiana, Characterization, Host, Geogr aphic distribution.
* 国家! 九五∀科技攻关项目( 96- 005- 04- 02-
03) .
1997- 09- 24收稿, 1998- 02- 09接受.
1 引 言
球孢白僵菌( Beauver iabassiana( Bals. )
Vuill. ,下简称白僵菌)是分布极广的虫生
真菌.其寄主范围也很广,涉及昆虫 15目、
149科、512属、700多种, 其中主要是鳞翅
目和鞘翅目昆虫[ 1] . 实验证明, 来源不同
的菌株存在毒力大小、生长速率快慢、产孢
能力高低和抗逆性强弱等有较大差异, 为
此人们采用毒力生物测定、酯酶同工酶分
析、蛋白酶分析,甚至血清学手段等来进行
白僵菌菌株的分型研究[ 2, 6, 7] .本文试通过
测定白僵菌供试菌株的多个生物学和生态
学指标,分析寄主和分布区系不同的白僵
菌菌株间的近缘关系.
2 材料与方法
2. 1 材料
2. 1. 1 菌种及其来源 实验所采用的球孢白僵菌
菌株共 19 株, 其寄主和采集地见表 1. 其中 Bb2
和 Bb4 分别为使用 Bb13 菌粉于宣州麻姑山林场
放菌前后的采集菌株.
2. 1. 2 SDAY 培养基 4% ( w/ v , 下同) 葡萄糖、
1% 蛋白胨、2% 琼脂、1% 酵母浸膏, 蒸馏水
1000ml.
2. 2 方法
应 用 生 态 学 报 1998 年 4 月 第 9 卷 第 2 期
CHINESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY, Apr. 1998, 9( 2)#189~ 194
表 1 供试白僵菌菌株来源
Table 1 Strains of Beauveria bassiana from different hosts
and geographic origins
序号
No.
菌株号
St rains
寄主
Hosts
采集地
Locat ion
1 Bb2 马尾松毛虫 皖 宣州麻姑山
Dend rol im us pu nctatus
2 Bb4 马尾松毛虫 皖 宣州麻姑山
Dend rol im us pu nctatus
3 Bb12 榆绿叶甲 皖 巢县
Pyrr halta aenescens
4 Bb13 马尾松毛虫 皖 霍邱
Dend rol im us pu nctatus
5 Bb14 马尾松毛虫 皖 徽州
Dend rol im us pu nctatus
6 Bb22 双翅目 皖 休宁
Diptera
7 Bb23 马尾松毛虫 皖 六安
Dend rol im us pu nctatus
8 Bb36 光肩星天牛 北京
A noplop hora g labr ipen nis
9 Bb38 家蚕 苏 镇江
Bombyx mori
10 Bb43 角蝉 黔 宽阔水
Membracidae
11 Bb46 角蝉 黔 宽阔水
Membracidae
12 Bb48 马尾松毛虫 广东
Dend rol im us pu nctatus
13 Bb54 鳞翅目 黔 宽阔水
Lepidoptera
14 Bb59 苹果蠹蛾 前南斯拉夫
A mp hiceru s hamatu s
15 Bb71 蝽象 皖 牯牛降
Pentatomidae
16 Bb77 角蝉 黔 宽阔水
Membracidae
17 Bb81 象甲 皖 牯牛降
Curculion idae
18 Bb86 鞘翅目 皖 牯牛降
Coleoptera
19 Bb88 象甲 皖 牯牛降
Curculion idae
2. 2. 1 菌落培养特性的观察 将供试菌株接种在
SDAY 平板上培养 15d 后, 对菌落的质地和颜色
分别参照色谱和唐晓庆等方法, 采用有序多态性
状( Ordered mult istate character )法进行编码[ 3, 4]
(表 2) .
2. 2. 2 不同菌株产孢量的测定 取斜面菌种, 配
表 2 菌落培养形态编码
Table 2 Coding of cultural colony
菌落质地
Colony texture
质地编码
Texture code
菌落颜色
Colony color
颜色编码
Color code
绒状菌丝型 0 银白色 0
瘠薄孢子型 1 白 色 1
疏松孢子型 2 浅 黄 2
厚层孢子型 3 乳 黄 3
致密孢子型 4 棕 黄 4
成浓度约为 1 ∃ 108 孢子%ml- 1孢悬液, 取 0. 5ml
接种于 SDAY 平板上,涂布均匀, 于 25 & 1∋ 下培
养 15d 后, 在平板中心至边缘 1/ 2 处用直径为
8mm 的打孔器取样, 置于含 10ml 0. 1% Tw een
80溶液的试管中,在旋涡振荡器上振荡 5min, 充
分分散.以血球计数板计数孢悬液含孢量, 再换
算成单位面积( mm2 )产孢量 .
2. 2. 3 不同菌株萌发中时的测定 从试管菌种挑
取少许孢子用 0. 1% 的无菌 Tw een80 水配成孢
悬液(浓度以在显微镜 400 倍视野下, 血球计数
板上每小格 4~ 8 个孢子为宜) ,用灭过菌的吸管
吸取 1ml的孢悬液涂布于 SDAY 平板, 25 & 1 ∋
下培养, 12h 左右后每隔 2~ 3h 观察测定 1 次萌
发率, 共观察 5 次. 用最小二乘法求出各个菌株
50%孢子萌发所需的时间( GT 50) .
2. 2. 4 快速失水和吸水对孢子活性影响的测定
取玻璃纸, 剪成若干个直径为 75 & 5mm 的圆片,
用0. 5mol%L - 1的盐酸浸泡 24h 后, 再用 95% 酒精
泡 24h,冲洗干净、湿热灭菌后, 铺于 SDAY 平板
上. 将各供试菌种接种玻璃纸上, 25 & 1 ∋ 下培养
15d后, 揭下产有大量孢子的玻璃纸, 置于 ZK
82A型真空干燥机中, 33 & 1 ∋ 下干燥 24h, 使含
水量降至 7~ 8% . 然后取少许干孢子粉于 0. 1%
Tw een80 溶液中, 振荡均匀后, 用 SDAY 平板测
定其萌发率.
2. 2. 5 不同菌株抗紫外能力的测定 取上述收获
的干孢子粉少许于灭菌后的载玻片上, 然后置于
30W紫外灯(玻片与灯管间距 18cm, 光照强度约
120Lx )下照射 6h,再测定照射后的孢子在 SDAY
平板上的萌发率.
2. 2. 6 耐热性检验 取少许收获的干孢子粉置于
灭菌玻璃管 ( 180mm ∃ 18mm)底部, 然后将玻璃
管放在 40& 0. 5 ∋ 的水浴锅中,水浴 24h 后, 测定
孢子在 SDAY 平板上的萌发率.
2. 2. 7 生长速率的测定 用直径为 8mm 的打孔
器在待测菌株新鲜平板上打孔, 接种到 SDAY 平
板中央, 用封口膜封口,倒置于 25 & 1 ∋ 恒温培养
箱中培养, 每隔 2d 用游标卡尺测量菌落生长直
径,共测 5 次. 由最小二乘法计算菌落生长曲线
斜率.
2. 2. 8 分析方法 对各项数据进行标准化处
理[ 3] ,消除量纲影响后, 电算求不同菌株的相关
190 应 用 生 态 学 报 9 卷
系数( r)矩阵.
3 结果与分析
3. 1 白僵菌菌株的寄主近缘关系
根据白僵菌 19个菌株实验观察和测
定所得的 8 项生物学及生态学指标 (表
3) ,得到供试菌株间的相关系数矩阵(图
1) .本次实验选用的白僵菌菌株寄主多数
是同翅目、鞘翅目和鳞翅目的昆虫(表 1) .
寄主为同翅目的 Bb43、Bb46和 Bb77 均分
离自角蝉, 它们间的两两相关系数均在
0. 980以上, 相关极显著(图 2) . 其培养特
征相近, 产孢量相互间有显著性差异,
Bb 77的紫外照射活率、水浴活率同Bb43
图 1 供试菌株的相关系数( r)矩阵
Fig. 1 Halfmatrix of diff erent st rains on correlation coeff icient ( r) .
图 2 同翅目寄主菌株的相关矩阵
Fig. 2 Halfmatrix of st rains from Homoptera hosts.
和 Bb46有显著或极显著性差异(表 3) .
寄主为鞘翅目的菌株, 除 Bb86不详
外, Bb81、Bb88 均分离自象甲, Bb12 及
Bb36分别分离自榆绿叶甲和光肩天牛. 它
们间的相关系数以 Bb81、Bb86和 Bb88之
间、Bb12和 Bb36之间、Bb36及 Bb81间较
高,分别达显著或极显著水平.而 Bb12 与
Bb81、Bb86及 Bb88三者之间的 r 值较低,
相关不显著(图 3) , 它们之间除了菌落质
地有差异外, 其他在萌发中时、水分活性、
紫外照射活率和水浴活率方面均差异显著
或极显著(表 3) .
图 3 鞘翅目寄主菌株的相关矩阵
Fig. 3 Halfmatrix of st rains f rom Coleoptera hosts.
1912 期 王成树等:寄主和分布区系不同的球孢白僵菌菌株近缘关系的研究
分离自鳞翅目昆虫的菌株 (图 4) , 除
Bb54不详外, Bb2、Bb4、Bb23和 Bb48均分
离自马尾松毛虫, Bb59 分离自苹果蠹蛾.
它们间相关系数有高、有低, r 值由 0. 615
~ 0. 980. 因 Bb2 和 Bb4 分别为麻姑山林
场使用 Bb13 放菌前后的采集菌株, 两者
在所测试的指标中均有较大差异,从其相
关系数大小可以确定, Bb2是当地流行株,
Bb4是 Bb13的复壮分离株. 另外, Bb13除
与 Bb14 相关系数不显著外, Bb13 及 Bb4
与其它菌株的相关性均达显著或极显著水
平. Bb59除与 Bb14的 r值较小外, 与其它
图 4 鳞翅目寄主菌株的相关矩阵
Fig. 4 Halfmatrix of st rains from Lepidoptera host s.
菌株的相关性也均达显著或极显著水平.
3. 2 白僵菌菌株分布区系的近缘关系
实验用菌株多数集中于贵州宽阔水自
然保护区、安徽牯牛降自然保护区及安徽
省不同地县. 采自宽阔水的菌株 Bb43、
Bb46、Bb54及 Bb77,相互间的相关系数很
高,均在 0. 970 以上(图 5) , 相关极显著.
在测定的 8个指标中, 除Bb77的产孢量较
高、水浴活率较低, Bb54 的萌发速率较快
及菌落质地有差别外, 其它各项指标相近
(表 3) .
图 5 黔宽阔水保护区采集菌株相关矩阵
Fig. 5 Halfmatrix of st rains from Kuankuoshui protect ion
aera, Guizhou.
采自牯牛降自然保护区的 Bb71、
Bb81、Bb86及 Bb88 菌株间绝大多数相关
极显著, 只有 Bb81 与其它菌株相关显著
(图 6) . Bb81 主要表现在产孢量较低, 水
分活性、紫外照射活率及水浴活率相对差
异显著或极显著(表 3) .
图 6 皖牯牛降保护区采集菌株相关矩阵
Fig. 6 H alfmatrix of st rains from Guniujiang protection
aera, Anhui.
采集于安徽省不同地县的菌株,可进
一步分为 4 个分布区系, 皖东巢县的
Bb12,皖西大别山区毗邻县霍邱与六安的
Bb13及 Bb23, 皖东南宣州市麻姑山林场
的 Bb2 及 Bb4, 皖南徽州及毗邻休宁的
Bb14和 Bb22. 由图 7 看出, 以 Bb12 与其
它菌株间的 r 值最小,相关均不显著, 表现
出萌发速率慢、水分活性、紫外照射活率及
水浴活率均显著或极显著地低于其它菌
株. Bb13与 Bb23的 r 值为 0. 967, Bb14及
Bb22的 r值为 0. 955,相关均极显著. 如前
192 应 用 生 态 学 报 9 卷
所述, 由于 Bb2为麻姑山林场的当地流行
株,而 Bb4 为 Bb13 的复壮分离株, 所以
Bb2 和 Bb4 的 r 值 ( 0. 758) , 同 Bb2 与
Bb13的值( 0. 744)相近是合理的. 其它如
Bb13 与 Bb14 的 r 值为 0. 615, Bb14 与
Bb23的 r 值为 0. 713, Bb2与 Bb14 的 r 值
为0. 750, 表明采集菌株的地理位置相距愈
远,菌株间的差异性愈大.
图 7 安徽不同地区采集菌株的相关矩阵
Fig. 7 Halfmatrix of st rains f rom dif ferent district s, An
hui.
表 3 球孢白僵菌菌株生物学指标测定结果*
Table 3 Biological characteri stics of Beauveria bassiana strains
菌 株
S trains
菌落质地编码
Colony
texture
code
菌落颜色编码
Colony
color
code
产孢量
Sporulation
( 106孢子%mm- 2)
萌发中时
GT50
( h)
水分活性
Rapid dis- and
re- hydrat ion
viabilit ies
( % )
紫外照射活率
UV radiation
viabilit ies
( % )
水浴活率
Bathing
viabilit ies
( % )
生长曲线斜率
Grow th
rate slope
Bb2 3 2 2. 55 & 0. 56cCD 11. 97 & 1. 30 53. 00 & 7. 89gD 22. 84 & 1. 34fF 2. 26 & 1. 48iH 0. 2580
Bb4 2 1 3. 34 & 0. 85abA 15. 97 & 1. 09 93. 63 & 1. 05abA 81. 40 & 1. 42bcBC 31. 28 & 2. 87gF 0. 1805
Bb12 3 1 1. 52 & 0. 45eE 31. 58 & 1. 27 11. 18 & 1. 06gE 8. 18 & 3. 15gG 4. 62 & 0. 43iGH 0. 2727
Bb13 3 3 2. 91 & 0. 74bBC 17. 21 & 0. 69 94. 80 & 2. 67abA 76. 99 & 4. 98cdCD 85. 14 & 1. 51bB 0. 2338
Bb14 0 1 1. 49 & 0. 23eE 26. 66 & 0. 83 77. 09 & 1. 21cdBC 13. 60 & 1. 07gG 8. 58 & 2. 48hG 0. 2163
Bb22 2 4 1. 29 & 0. 24fE 16. 75 & 0. 48 64. 31 & 4. 45deCD 27. 34 & 4. 97fF 4. 60 & 1. 33iGH 0. 2271
Bb23 4 1 1. 56 & 0. 35eDE 22. 98 & 0. 53 68. 95 & 2. 59deC 60. 15 & 3. 66eE 44. 57 & 7. 08fE 0. 1640
Bb36 3 1 1. 79 & 0. 41dD 30. 83 & 0. 50 31. 75 & 1. 17gD 14. 18 & 4. 98gG 1. 45 & 1. 23iH 0. 1714
Bb38 2 4 2. 91 & 0. 23cCD 11. 10 & 0. 74 69. 25 & 6. 18deC 12. 96 & 1. 49gG 46. 18 & 5. 25fE 0. 2847
Bb43 2 2 1. 41 & 0. 12eE 14. 72 & 0. 46 92. 81 & 1. 70abA 76. 40 & 2. 20cCD 73. 50 & 1. 21dC 0. 2455
Bb46 2 3 1. 00 & 0. 14fF 16. 26 & 0. 80 93. 05 & 1. 16abA 80. 38 & 3. 63bcBC 77. 98 & 1. 59cC 0. 2255
Bb48 2 3 2. 37 & 0. 87cBC 20. 35 & 0. 64 85. 08 & 2. 13bcAB 72. 08 & 1. 14dD 73. 33 & 2. 47dC 0. 2405
Bb54 0 2 1. 40 & 0. 27eE 11. 54 & 1. 02 96. 26 & 1. 59abA 94. 79 & 2. 10aA 93. 35 & 0. 76aA 0. 2520
Bb59 3 0 4. 84 & 0. 95aA 14. 78 & 0. 73 89. 00 & 3. 55abAB 71. 73 & 1. 05dD 67. 06 & 3. 26eD 0. 1515
Bb71 2 2 2. 34 & 0. 45cBC 13. 46 & 0. 78 94. 09 & 3. 28abA 84. 48 & 1. 92bB 90. 22 & 2. 92abAB0. 2477
Bb77 2 1 3. 36 & 0. 67abA 17. 59 & 1. 03 97. 99 & 0. 12aA 96. 25 & 0. 89aA 66. 17 & 2. 56eD 0. 3170
Bb81 2 1 1. 80 & 0. 23dD 23. 06 & 0. 74 65. 06 & 1. 97efD 30. 24 & 2. 64fF 21. 25 & 0. 37gF 0. 2725
Bb86 2 2 3. 02 & 0. 86bB 17. 29 & 0. 99 89. 30 & 3. 87abAB 84. 26 & 1. 16aB 86. 04 & 2. 28bB 0. 3130
Bb88 3 1 3. 42 & 0. 79abA 21. 88 & 0. 84 93. 55 & 0. 81abA 86. 97 & 2. 12bB 92. 26 & 1. 80aA 0. 2565
* 同一列内相同字母表示差异不显著( Duncan( s 新复极差法, 小写字母, P< 0. 05; 大写字母, P < 0. 01) . Within the
same collum, means ( & se) labeled w ith th e same let ter are not significant ly diff erent ( Duncan( s new mult iple range test ,
small let ter, P< 0. 05; capital, P< 0. 01) .
4 讨 论
4. 1 采用多指标研究菌株近缘关系的可
靠性
研究中共观察、测定了白僵菌不同菌
株的 8个指标, 其中菌落形态(质地及颜
色)常被作为微生物分类的指标之一,其他
指标分别反映了菌株的不同特性, 如产孢
量反映了在环境中的扩散、传播范围及能
力;萌发中时、生长曲线斜率反映了孢子的
侵染、致病速率; 紫外照射活率、水浴活率
及水分活性反映了孢子在环境中的抗逆
性[ 8, 11] .所以采用多指标综合分析白僵菌
菌株的近缘关系集中了菌株基因组的多种
表现型,因而更具可靠性. St Leger 等在研
究来源广泛的白僵菌不同菌株(共 4 种,
146个菌株)间的遗传变异性时, 是以葡萄
糖磷酸异构酶、谷光甘肽降解酶、甘油醛
3磷酸脱氢酶和 6磷酸葡萄酸脱氢酶作为
遗传因子表现型,将不同菌株分为 47个基
因型类群[ 12] . 采用单因子研究方式, 往往
会得到不同甚至完全相反的结论,如有人
1932 期 王成树等:寄主和分布区系不同的球孢白僵菌菌株近缘关系的研究
认为白僵菌的蛋白酶产生水平同其毒力有
正相关性[ 7] , 而 Gupta 等证明它与毒力无
相关性[ 9] . 单独采用酯酶同工酶分析, 将
采于同一地区的白僵菌菌株进行分型[ 2] ,
这种方式也值得商榷. 因为不同蛋白质及
其含量的表达,不仅与 DNA 序列有关, 还
受DNA高级结构的调控, 而这种高级结
构易受环境因子的影响而发生变化, 从而
反映在蛋白质表达水平的不同上.
4. 2 寄主和分布区系不同的菌株近缘关
系的远近
研究结果证明, 白僵菌菌株近缘关系
的远近受菌株原始分布区系的影响很大,
受寄主不同的影响次之. 采自贵州宽阔水
保护区的 Bb43、Bb46、Bb54及 Bb77, 虽然
Bb54的寄主为鳞翅目昆虫,但同寄主均为
角蝉的另外3个菌株的 r 值分别达 0. 991、
0. 994及 0. 975, 相关极显著. 同采于安徽
牯牛降保护区的寄主为半翅目的 Bb71 与
寄主均为鞘翅目昆虫的 Bb81、Bb86 及
Bb88 的 r 值分别为 0. 813、0. 999 和
0. 997.采自皖南相邻县的 Bb14(寄主为马
尾松毛虫)与 Bb22(寄主为双翅目昆虫)的
相关系数达 0. 955. 这说明在相同或相近
区域内,白僵菌可以因季节或虫口的变化
等有选择地寄生不同寄主. 寄主同为马尾
松毛虫的 Bb2(皖东南)与 Bb13(皖西)的 r
值为 0. 744, Bb14(皖南)与 Bb23(皖西)的
r值为 0. 750, Bb14 与 Bb48(广东)的 r 值
为 0. 632, 所以菌株近缘关系的寄主依赖
性较弱. Kmitow a对白僵菌 36个菌株的致
病力进行研究表明, 菌株毒力的大小依赖
于地理来源、寄主及在人工培养基上的培
养时间[ 10] . Leal等对来自澳大利亚、巴西、
芬兰和菲律宾的 20 株金龟子绿僵菌
( Metarhiz ium anisop l iae ) 进行 RAPD
PCR分析(使用了 11 个引物) , 发现来自
同一国家的菌株具有更大的遗传相似
性[ 11] .这些研究结果支持了本文的研究结
论.
虫生真菌菌株毒力的高低是其能否作
为生物防治材料的主要参考依据,但作为
一个单指标, 它不能用来衡量来源不同的
菌株近缘关系. 所以本文的研究结论并不
否认白僵菌的选择寄生能力,它对非目标
无脊椎动物仍具有安全性[ 5] .
参考文献
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