全 文 ：第 4 卷 第 4 期
1 9 9 1 年 8 月
林业 科 学研 究
FO R ES T R ESEA R CH
V o l
.
4
,
N o
.
4
A u g
。 ,
1 9 9 1
白僵菌醋酶谱稳定性的研究
张永安 陈昌洁
(中国林业 科学研究院林业研究所 )
摘共 通过对球抱白任菌 B ea o ve r : 。 b。 : 。: a”a 菌体角醉同工醉分析过程中的五个试验条件研
究表明, 该菌休醋醉同工醉谱比较稳定 。 只要分析材料和相应的保护剂选择得当 , 并在一个稳 定
的试验条件下就可将其作为分类的一种生化指标 。
关. 润 球抱白似菌 , 醋醉 , 聚丙烯酞胺 , 凝胶电泳
同工酶是结构差异而性质相同的酶蛋白分子 , 是基因的次级表达 , 可以作为生理或遗传
研究的指标 [ ‘}。 目前有关同工酶的研究报道很多 , 而同工酶与试验条件的关系研究 报 道较
少 。 大多数研究结果都是基于个人的研究方法 , 因而 , 同种材料常常会得出多种结果 , 影响
了成果的交流和应用 。 为了促进 白僵菌研究工作的发展 , 于 1 9 8 8~ 1 9 8 9年对白僵菌菌体酮酶
同工酶分析过程中的部分条件进行了研究 , 现将结果报道于下 。
1 材料与方法
1
。
1 , 株
以法国赠送的球抱白僵菌 B o a : v 。, fa ba s s ia , a (B a ls . ) V u ill. 第 1 1号菌株为分析材料 。
1
。
2 培并荞 衰 1 绝娜‘组成
胡 6 种培耗 , 其中 6 号为酥 , 1一~ 5 号为液体 , 比较同状态不同营养和同营养不同状态条件下醋酶谱带变化(表 l )。1 . 3 提取液在两种缓冲液的基础上 , 分别加入不 同的保护物质配成 8 种提 取 液 (表 2 ), 均 置4 ℃冰箱中保存备用。1 . 4 , 休培养与 . 醉提取取制备好的装有定量培养基的三角瓶 ,接入一定量的分生抱子 , 摇匀置 27 土 1 ℃恒温箱中静止培养。 定时取出菌体 , 用蒸馏水冲洗三次 , 抽滤或滤纸吸水 后 称 湿 重 , 按1 , l比例加入提取液 , 一 6 ℃冰箱中 过夜 。
次 日取出加入适量石英砂于研钵中 , 冰浴条
本文于 19 9 0年 3 月 2 日收到 .
序号 代 号 组分和含t (1 0 0 m l)
P D A
S D B、‘
S D BYC
P S PV
S D A Y
马铃 , 2 0 9 , 有蔺箱 2 9
蛋白拣 1 9 , 有有箱 4 9 , 醉母 *
0
.
2 9
蛋 白陈1 9 , 有蔺 . 4 9 , 醉母 *
0
.
2 9
,
JL T 质¹ 。. 2 9
马铃 , 20 9 , 蔗摘2 9 , 礴徽 二组
钾 0 . 3 9 , 硫艘拱 0 . 15 9 , 维生
素 B 1 1 m g
牛 肉* 0 . 3 9 , 侠化陈 1 9 , 节萄
箱 1 9 , 舰化钠 0 . 5 9
蛋 白陈1 9 , 有萄褚4 9 , 醉母 *
0
.
2 9 , 琼脂 1 . 5 9
¹ 上 海试荆 二厂生产 , 研成粉状后使用 。
4 期 张永安等 : 自僵菌醋酶谱稳定性的研究
表 2 提 取 液 配 方
序 号 代 号
PH 6
.
5 磷酸
缓 冲液(m l)
p H s
.
3电极
缓 冲液(m l)
a 一琉基 乙醇
(m l) ( g )
丙 三 醉
(m l)
E D T A
( g 、
1 P 2 0
2 P a 2 0 0
.
1
3 PS G Ze 6 4
4 Pa G 2 0 0
.
1 4
5 P a S 2 0 0
.
1 6
6 P a SG 2 0 0
.
1 6 4
7 Pa S G E 2 0 0
.
1 6 4 0
.
15
8 T A a S G 2 0 0
.
1 6 4
件下研磨成浆, 1 5 0 0 0 r p m , 离心 15 m in ( 4 ℃ ) , 取上清液作为电泳样品。
1
。
5 菌醉同工 . 分析
采用高PH 不连续聚丙烯酞胺凝胶板状电泳技术 : 2 ’“】。 醋酶染色 , 将 示醋酸蔡 醋 20 m g
溶于 2 m l丙酮 , 加入 0 。 1 M pH 6 . 8磷酸缓冲液Z O m l, 再加 2 0 m g 固蓝一R R , 过滤后 染色 。
染色结束后水洗 , 然后加 1 %冰醋酸固定〔4 ] 。 结果分析是根据酶带的 El 值将酶谱划 分 为A
区和 B 区 , 并以 酶谱总带数 、 主酶带数和主酶带浓度为依据比较分析 [“〕。
2 研究结果
2
。
1 培养基筛选
在 6 种培养基上的比较研究结果表明(表 3 ) , 液体培养基优于固体培养基 , 其中 5 种液
体培养基 , 由于营养成分不同 , 特别是有微量物质存在的培养基 , 培养出的菌体醋酶谱差异
较明显 。
衰 3 培养甚与. 醉奋的关系 (9 m l, sd)
醋 醉 谱 PD A SD BY S D BY C PS PV D N S D A Y
A
:
主带 浓度 B : 二强二 中
A
: 二强
B
: 二强
A
:
B
:
二强
二强
A
: 一弱一 中
B
: 二弱
A
: 二中
B
: 一中一强
八 : 一强
B
: 二强
2
.
2 培养基用量与嘴醉谱的关系
表 4 表明 , 同一时间 (5 天)终止培养时 , 较小量的培养基已不能满足菌体生长需要的营
养 , 故生长不良 , 影响同工酶合成 。
表 4 SOB 丫培养基用l 与酸蔺诊的关系
醋 醉 谱 3 m l 4 m l s m l 7 m l g m l 1 0 m l
总 带 教 9 9 1 0 1 1 12 1 2
主 带 数
主带浓度
A
: 二强
B
: 一 中一强
A
:
B
:
二强
一强一 中
A
:
B
:
二强
一强一中
A
: 二强 A :
B
: 二强 B :
二强
二强
A
:
B
:
二强
二强
41 6 林 业 科 学 研 究 4 卷
2
.
3 不同培养时间醋醉进的变化
1 ~ 10 天菌体生 一氏过程中醋酶谱的变化情况见表 5 。 24
测出醋酶 。 2 一 4夭酶带数逐渐增加 , 5一G天达到高峰 , 从 7
要在A 区 。
衰 5 醉斑与生长时间的关系
h 的培养物 (离心 ) , 量小而未 检
夭开始酶带数减少 , 而月 .变化主
(S D B Y
,
9 m l)
呛 醉 i阵 2 4 h 4 8 h 3 d 4 d s d 6 d 8 d g d
你 带 数
主 带 数
7 8 ] 1 1 2 1 2 1 0 1 0 10 9
主带浓度
: 0 八 : 0
n
: 二弱 B : 二弱 言: 二弱 八 :二强 B : 二强二强 \ :11 : 二强二强 入 : 一 弱一强 :、: 一强 八 : 一强 八 : 一强13 : 二强 U : 二强 l〕: 二强 11 . 二中
2
.
4 接种且对菌醉进的影晌
试验表明接种量对醋酶谱影响不大 ,
生袍子9 . 5 X 1 0 。个/ m l。 结果见表 6 。
衰 6
但在多菌株比较时应尽可能要接近 。 供试母液含分
接种, 对醉姗的形晌 (S D BY , 9 m l, sd )
阶 阶 潜 廿 液 稀杆 2 倍 稀释2 0倍 稀释2 0 0倍
12 ] 2数饮翻比口4沪‘J月.总主
主 带 浓 度 二票 入 :l弓: 重票
稀释 8 倍
1 2
4
、: 二强
11
: 二强
入 : 二 强
n
: 二 强
八 : 二涡
B
: 二强
2
.
5 提取液对苗醉进的形晌
8 种提取液提取出的醋酶 , 电泳分析结果差异显著 。 两种不同 p H 缓 冲液之间没有明显
差异 , 而醋酶谱差异较大的是那些加入了不同保护剂的提取液(表 7 )。 其中 P 和 Pa 提 取 液
是提取出醋酶后 , 在酶液中加入蔗糖和丙只醉 。 菌体取自同
一 J音养 纂 (SD BY ) , 同一三角瓶 。
3 结论与讨论
(1) 本项研究认为 , 虽然醋酶同工酶受较多因素影响 ,
但只要严格控制试验条件 , 排除人为因素干扰 , 酝酶同工酶
仍是一种理想的生化指标。 由于试验条件涉及较多 , 本文只
提供在 10 m l S D BY 培养磷(5 O m l三角瓶 )上培养 5 天的菌
体(27 士 1 ℃ )经过用 P o SG 提取 液冰浴研磨提取 出的酶液电
泳西行酶图谱 , 见图 1 。
(2) 一特定酶 的从因 , 在生物体内的特定空 间和时间是
否表达或表达 录多少 , 并不决定干酶结构信 仓木身 , 而决定
于 基因表达的调往沐系 , 这一体系是以内因为依据 , 外因为
条件而作用的 )’, 6 1 。 同时同工酶也可能由于物理或 化学方法
的改变而 引起变化。 所以在自僵菌醋酶同工酶分析 r}, , 既要
旧 1 最住试验条 {’l 下 1 号自怪 苗
醋醉谱示 愈
(入 : 打j o ~ 6 0 1弓: 刀f 6 0 ~ 1 0。)
4 期 张永安等: 白僵菌醋酶谱稳定性的研究 41 7
表 7 提取液对醉谁的形晌 (S D BY , 。m l, sb )
醋 醉 谱 P“ PS G P“G Pa S P“S G P a S G E T A a S G
A
:
主带浓度 B : 二强一中
1 2
4
了、: 二强
B
: 二 中
1 3
3
八 : 二强
B
: 一 中
1 2
4
A
: 二强
B
: 二 中
12
4
A
: 二强
B
: 一 中一弱
12
4
A
: 二强
B
: 二强
A
:
B
:
二 强
一 中
1 2
4
A
: 二 强
B
: 二 强
保持材料的一致和环境条件的稳定 , 又要避免处理方法所带来的不利影响。
参 考 文 献
〔1 〕 周光宇, 1 9 8 3 , 有关同工醉分析的几个问题 , 植物生理学通讯 , (1) : 1~ 4 。
〔2 〕莽克强等 , 19 75 , 聚丙烯醉胺握胶电泳 , 科学 出版社。
〔3 〕徐大雅等 , 1 9 82 , 痊霉蛋白质的聚丙烯跳胺凝胶盘状 电泳 , 真菌学报 , 1 (1 ) : 40 ~ 4 7
【4 〕徐卫明等 , 1 98 5 , 小鼠胚胎组织、 成体组织和胚胎癌细胞醋酶同功酶谱的比较研 究 ,
~ 10 4
0
〔5 〕张永安等 , 19 87 , 白僵菌醋酶型及其与毒力关 系的初步研究 , 林业科技通讯 , (1 2 ) :
〔6 〕 梅慧生 , 19 8 1 , 植物同工俞研 究的某些进展 , 植物生理学通讯 , (3) : 1 ~ 7o
实验生物学报 , 1 8 (1 ) : 9
1 4 ~ 16
。
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e s te r a se
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一
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s w e r e e h a n g e d un d
e r
d iffe r e n t e ond it i
o n s
。
o n th e o the r h a n d
, s o m e sid e e ffe e t e a u se d b y E D T A
w a s o b se r v e d
。
T he r e fo r e
,
w e ma y m
ak e a e o nc lus io n t h a t a s ta b le e s te r a s e
e le e tr o Ph o r e t ie Pa tt e rn u s e d a s a e la ss ifie a tio 尽 e r ite r io n fo r s tr a in s o f B e a -
“刀 e了fa ba ss釜a n a e a n b e o bta in e d u n d e r th e s u ita b le e o n d lt io n s 。
K e y w o r ds 丑e a : 。e : ia ba s s玄a : a : e s te r a s e ; Po ly a c ryla m id e ; g e l e le c tr o Ph o r-
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