全 文 ：两种羟基苯乙酸对大豆萌发的化感效应研究*
阮维斌1* * 刘默涵1 黄 斌2 阎 飞2 王敬国2 高玉葆1
( 1 南开大学生命科学学院,天津 300071; 2中国农业大学植物营养系,北京 100094)
摘要 通过田间和室内试验相结合, 利用高效液相色谱检测大豆根际土壤和残茬腐解液中的对羟基苯
乙酸和间羟基苯乙酸的含量; 在培养皿内研究两种酚酸对大豆生长抑制效应; 研究了二者对大豆 DNA 熔
点( Tm)的影响,并采用 SDSPAGE方法研究二者对根系蛋白合成的影响. 结果表明, 在大豆根际土壤和
残茬腐解液中检测到对羟基苯乙酸; 两种羟基苯乙酸处理后,大豆侧根数和主根长均显著减少, 表现出明
显的化感抑制效应, 间羟基苯乙酸的抑制效应更明显; 两种羟基苯乙酸使大豆 DNA 的熔点( Tm)下降, 一
些小分子蛋白的合成受到影响, 从而抑制大豆生长, 表现出典型的化感效应.
关键词 大豆 化感 对羟基苯乙酸 间羟基苯乙酸
文章编号 1001- 9332( 2003) 05- 0785- 04 中图分类号 Q948. 12 文献标识码 A
Allelopathic ef fect of pand mhydroxyphenylacetic acid on soybean ( Glycine max L. ) germination. RUAN
Weibin1 , L IU Mohan1, HUANG Bin2 , YAN Fei2 , WANG Jingguo2, GAO Yubao1 ( 1College of L if e Science,
Nankai Univer sity , T ianj in 300071, China; 2Depar tment of Plant Nutr ition , China Agricultural Universi
ty , Beij ing 100094, China) . Chin. J . A pp l . Ecol . , 2003, 14( 5) : 785~ 788.
In present w ork the phydroxyphenylacet ic acid ( PHPA ) and mhydroxyphenylacetic acid( MHPA ) in rhizo
spheric soil solutions and decomposed root residues were detected by High Performance L iquid Chromato graphy
( HPLC) , and their effects on soybean germination at the level of 0, 30, 60, 150, 300 and 600 mg!kg- 1, o n
melting temperature of DNA at the level of 600 mg!kg - 1 and on cytoplasm protein patterns at the level of 0, 30,
150, 300 mg!kg- 1 w ere also studied. PHPA and MHPA were detected in decomposed products o f root r esidue
and soil solutions collected from rhizosphere in which soil sickness was occurr ed, but no t detected in so il on which
soybean rotated wit h w heat. The standard samples of PHPA and MH PA w ere used for bio assay in Petr i dish.
The main root length and later al root number of soybean were seriously reduced, even at t he level of 30 mg!
L - 1. Soybean germination and root g rowth w ere retarded ser iously by MHPA, in contr ast w ith PHPA. At the
level of 600 mg! kg - 1, the melting temperature ( Tm) of soybean DNA w as incr eased sharply from 77∀ to
84. 5 ∀ with PHPA, and from 77∀ to 88. 5∀ with MHPA. Tm w as affected markly by MHPA, compared to
PHPA, and the result w as consistent wit h that of bioassay. The cytoplasm protein patterns of soybean leaves
were obtained from SDSPAGE, showing several low weight molecular pro teins w ere affected, especially on 16.
1kD and 20. 2kD. The r esults implied that PH PA and MHPA had allelopathic effect on soybean, and might have
a role in soilsickness of soybean.
Key words Soybean ( Glycine max L. ) , Allelopathy, Hydroxypheny lacetic acid.
* 国家重点基础研究发展规划项目( G2000018601) 和国家自然科学
基金资助项目( 39870488) .
* * 通讯联系人. Email: caurw b@ eyou. com
2002- 09- 19收稿, 2003- 04- 03接受.
1 引 言
植物种内的化感作用称作自毒作用,葫芦科植
物如西瓜、黄瓜等存在自毒现象[ 17] . 据报道自毒作
用是导致柑桔再植障碍的主要因素之一[ 5] . 苜蓿存
在自毒现象, 其自毒物质主要为氯原酸[ 3] . 杉木根
桩在分解过程中酚类物质向外释放并会在土壤中积
累,根桩周围土壤中酚类物质含量高于非根桩周围
土壤, 盆栽试验说明酚类物质会影响杉木种子的萌
芽率, 杉木中的酚酸类自毒物质是影响下一代杉木
生长的重要因子[ 7] .大豆连作障碍是东北大豆生产
面临的主要问题之一. 东北地区是我国大豆的主产
区,然而大豆连作障碍问题比较突出,造成大豆生长
不良、产量降低、品质下降. 大豆连作障碍的因子很
多,包括大豆胞囊线虫和有害病原微生物在内的土
壤有害生物的危害、自毒物质的生长抑制作用
等[ 16] .有研究表明, 微生物分泌的毒素物质抑制大
豆生长[ 6] . 杜英君[ 4]使用组培技术在无菌条件下研
究表明大豆根系分泌物和大豆组织水浸液对大豆苗
存在化感作用,且检测到酚酸类化感物质如香草酸、
香草醛和对羟基苯甲酸, 并认为自毒作用是导致连
作大豆减产的主要因素之一.豆饼混入砂土中(比例
为 15 g!kg- 1土)后导致大豆发芽率为 0,发芽受到
显著抑制( P < 0. 05) (未发表) .这些研究证实大豆
应 用 生 态 学 报 2003 年 5 月 第 14 卷 第 5 期
CHINESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY, May 2003, 14( 5)#785~ 788
连作障碍中化感自毒作用的存在.我们以前的质谱
结果推测大豆残茬腐解液中存在羟基苯乙酸. 本试
验拟对此进行验证, 并检测土壤中该物质含量,研究
其对大豆生长是否存在自毒效应和相应作用机制.
2 材料与方法
21 残茬和土壤溶液中化感物质的检测
211 仪器和试剂 HPLC( Shimadzu I. D 岛津 LC4A ) , 采
用 C18反相柱( 250mm ∃ 4. 6mm ) , 紫外检测波长 280nm, 柱
温 35 ∀ . 进样量为 5l,流动相组分为甲醇#水= 40#60(流动
相中高纯水用分析纯的冰醋酸调节 pH 值为 2. 60) , 流速为
1. 0ml!min- 1. 间羟基苯乙酸 ( mhydroxypheny lacetic acid,
MHPA)、对羟基苯乙酸( phydroxyphenylacetic acid, PH PA )
购自 Sigma公司,甲醇为国产色谱纯(天津四友) , 冰醋酸和
其它实验所用试剂均为国产分析纯.
212 样品的采集和制备 从黑龙江省农业科学院土壤肥
料研究所试验地采集正茬(正常轮作)和连作 2 年(连续 3 年
种植大豆)大豆根际土.将 50ml浸提剂(甲醇#乙酸乙酯#丙
酮= 1#1#1,所有试剂均为国产分析纯 )加入 10g 土样中, 振
荡 10h( 25 ∀ ,转速 180r!min- 1) , 然后过滤浸提掖并挥发至
干,用甲醇溶解后进行 HPLC 测定.大豆根残茬腐解 30d 后,
分别用石油醚、乙酸乙酯萃取残茬腐解液, 对乙酸乙酯相直
接进行HPLC 检测[ 14] .
22 生物检测: 将直径为 90mm 的培养皿进行湿热灭菌后,
在其中加入 2 张定性滤纸(新星, 杭州富阳特种纸厂) , 然后
播种 10 粒经过 3%H2O2 消毒的种子(合丰 25) , 25∀ 恒温培
养96h 后, 调查侧根数和主根长. 试验设 6 个浓度水平: 0、
30、60、150、300、600 mg!kg- 1, 其中 MHPA 设4 次重复, PH
PA 设 6 次重复.生物检测试验重复 3次 .
23 Tm 值测定: 选取新鲜叶片 1. 50g, 采用 CTAB 法(十六
烷基三甲基溴化铵)提取 DNA[ 11] , 并进行纯度检测和 Tm 值
测定( UV365 型紫外可见近红外双光束分光光度计, 带有
SPR8程序升温仪,日本岛津) . MH PA 和 PHPA 的供试浓度
为 600 mg!kg - 1.
24 全细胞蛋白 SDSPAGE 在灭菌的培养皿中铺双层滤
纸,将 15 枚大豆种子置于其中, 分别用两种羟基苯乙酸处
理,供试浓度水平均为: 0、30、150、600 mg!kg - 1. 25∀ 下培
养发芽后, 取 1g鲜根和胚轴用液氮研磨后加入 2 倍体积上
样缓冲液破细胞壁. 采用 15% 分离胶和 3% 浓缩胶, 胶的厚
度为 2mm, 染色采用考马斯亮蓝法[ 15] .
25 方差分析
生物检测数据采用 SAS 方差分析, 并进行 LSD( P <
0. 05)统计检验.
3 结果与分析
31 大豆根际土壤和残茬腐解液中酚酸的检测
由表 1可知,在根残茬腐解液和连作 2年土壤
浸提液中分别检测到PHPA,而未检测到 MHPA. 正
表 1 正茬和连作 2年土壤和根残茬腐解液中羟基苯乙酸的检测
Table 1 Measurement of PHPA and MHPA in rhizospheric soil under
normal rotation and continuous cropping system and decomposed root
residue solution (mg!kg- 1)
样品 S ample PHPA MHPA
正茬土壤 S oil under normal rotat ion ND ND
连作 2年土壤 Soil under cont inuous cropping for 2 years 2. 298 ND
根残茬腐解液 Solut ion of decomposed root residue 9. 960 ND
ND:未检测到 Not detected.
表 2 两种羟基苯乙酸对大豆侧根数和主根长的影响
Table 2 Effect of PHPA and MHPA at different levels on the soybean
lateral root number and main root length
浓度
Concen
tration
( mg!kg- 1)
PHPA
侧根数 Lateral
root number
( No. per plant)
主根长M ain
ro ot leng th
( cm)
MHPA
侧根数L ateral
root number
( No. per plant)
主根长 Main
root length
( cm )
0 17. 3a* 10. 7a 18. 3a 9. 1a
30 11. 1bc 9. 6a 10. 8b 8. 1b
60 14. 5ab 9. 7a 9. 8b 7. 3b
150 10. 6bc 7. 7b 8. 0bc 6. 4bc
300 8. 3c 7. 6b 4. 7cd 4. 7cd
600 7. 7c 6. 4b 1. 2d 3. 1d
* 同一列字母相同者表示差异不显著,字母不同表示差异显著 Means within a
column followed by the same let ter are no t significantly different at 5% level by
LSD test.
茬土壤浸提液中则未检测到酚酸.
32 生物检测
表 2 是不同浓度水平的 PHPA 和 MHPA对大
豆发芽过程中的侧根数和主根长的影响. 结果表明,
随着浓度的增加, 两种酚酸对侧根数、主根长有抑制
且呈现不断增加的趋势. MHPA 对大豆生长的抑制
程度比 PHPA 深, 其在 30 mg!kg- 1水平下,使大豆
侧根数、主根长两个指标均显著下降.
33 Tm 值
两种酚酸对大豆 DNA 的 T m 的影响见图 1.
DNA的双螺旋结构失去一半时的温度称为该 DNA
的熔点或溶解温度 ( M elting temperature, Tm ) . 本
试验研究表明大豆DNA的T m值是77 ∀ , 在6 00
图 1 两种羟基苯乙酸处理后大豆 DNA 的 Tm 的变化
Fig. 1 Melting temperature variat ion of soybean DNA in th e absence
( PH PA or MHPA) ( % ) and in the presence of PHPA ( & ) and MHPA
( ∋ ) .
786 应 用 生 态 学 报 14卷
mg!kg- 1水平下, PHPA、MHPA 处理后大豆 DNA
的 Tm 值分别增加到 84. 5 ∀ 、88. 5 ∀ .
34 大豆根系的 SDSPAGE 全细胞蛋白分析
图 2 表明, 各处理之间分子量为 34. 0kD、30. 6
kD、20. 2kD、16. 1kD 蛋白的合成量有差别. PHPA
与 MHPA 处理相比, 20. 2kD、16. 1kD 蛋白的合成
量有明显的差别,其中, PHPA 3个水平均具有16. 1
kD蛋白条带, 而对照和 MHPA 的 3 个水平此条带
则不明显.
图 2两种羟基苯乙酸处理后大豆根系的全细胞蛋白分析的电泳图谱
( SDSPAGE)
Fig. 2 Whole cell protein SDSPAGE analysis of the soybean root t reated
w ith PHPA and MHPA.
条带 1~ 3, 6~ 8分别代表 PHPA和 MHPA的 3个水平: 600、150、30
mg!kg- 1. Lane 1~ 3 and Land 6~ 8, stand for PHPA and MHPA at the
level of 600, 150, 30 mg!kg- 1, respectively; 条带 4 为标记 Land 4,
mark;条带 5为对照 Land 5, CK.
4 讨 论
本试验中采用的浸提剂相对比较温和, 避免了
用强碱破坏土壤结构将有机质中的酚酸提取出来的
可能.检测结果表明,重茬土壤和大豆根残茬腐解液
中存在 PHPA,而正茬土壤中则未检测到该物质. 植
物根系分泌物中有机成分很多,有可能是 PHPA 间
接或直接的来源. 当然, 收获后遗留在土壤中根、叶
等经过微生物腐解后的产物也是根际土壤中 PHPA
的来源(表 1) . 当其累积到一定程度有可能抑制大
豆生长.本实验在土壤浸提液中检测到 PHPA,而土
壤溶液中两种酚酸的浓度实际是多少, 只有田间直
接原位提取土壤溶液后才可能得到,得到的实际浓
度是否起作用还需进一步研究. 化感物质在土壤中
的行为非常复杂,化感物质胜红蓟素经过土壤转化
的产物甲氧基取代苯甲酸、乙酸等仍然具有明显的
生物活性[ 9] , 本试验中仅检测到 PHPA,而活性较高
的MHPA 则未检测到, 二者是否相互转化, 需进一
步研究.研究表明,胡桃树分泌的化感物质胡桃醌图
空间分布有差异, 与树干中心相比, 距离树干中心
4. 25m 处土壤中胡桃醌的含量下降了 80% [ 8] .两种
羟基苯乙酸在土壤中空间分布如何, 尚不清楚.
生物试验表明, PHPA 和MHPA在浓度为 30mg!
kg- 1时, 即表现出抑制大豆生长的趋势, 尤其是
MHPA, 其抑制程度达到显著水平. 两种酚酸在
300mg!kg- 1和 600mg!kg - 1水平下,造成侧根极度
缩短,侧根之间几乎连成一体而成片状分布,主根表
皮的侧根发生处和皮层部分开裂,下胚轴变粗, 这可
能与激素代谢紊乱有关. Baziramakenga等[ 1]报道苯
甲酸和肉桂酸通过氧化或与巯基交联而破坏大豆根
细胞上的膜蛋白, 从而抑制大豆生长.有研究表明酚
酸物质影响细胞扩张、膜透性、蛋白合成、酶活性
等[ 10] .水稻叶片的浸提液能够显著抑制稗草体内超
氧化物歧化酶( SOD)和过氧化氢酶( CAT)的活性,
从而影响其生长[ 12] , 研究表明水稻中存在多种酚
酸类生长抑制物质. 有研究在残茬腐解产物中检测
到香草酸、丁香酸、香豆酸和阿魏酸, 从培养过大豆
苗的培养基中和大豆苗水浸液检测到香草酸、香草
醛和对羟基苯甲酸等酚酸类化学物质[ 4, 14] ,而包括
对羟基苯甲酸在内的多种酚酸是一类典型的化感物
质. PHPA和 MHPA 与对羟基苯甲酸结构类似, 其
是否对大豆的细胞膜有影响,有待进一步研究.
大豆 DNA的熔解温度 Tm 值升高, 这表明大
豆的 DNA 的复制已经受到影响,但 PHPA 或 MH
PA能否跨过大豆脂膜和细胞核膜而与 DNA 直接
结合从而影响细胞复制, 尚需深入研究. 有研究表
明,番红与 DNA 的结合后容易导致 Tm 值升高[ 2] ,
影响 DNA 的复制和植物生长.
全细胞蛋白 SDSPAGE 分析结果表明, 两种酚
酸处理后, 20. 2kD和 16. 1kD 蛋白的合成量出现明
显差别(图 2) . 马樱丹的水浸提取物严重抑制西红
柿胚根长,细胞胞质内蛋白合成增加,证明在细胞水
平上西红柿的生化代谢过程发生改变[ 13] .两种酚酸
尤其是 MHPA更加抑制大豆侧根的发生,具体哪些
基因的表达受到影响, 有待于借助 mRNA差别显示
法等分子生物学的方法研究相关基因.
致谢 本研究中大豆蛋白 SDSPAGE 图像分析和酚酸的
HPLC 测定分别得到了南开大学生命科学学院刘桂琴老师
和吕宪禹老师的帮助.
参考文献
1 Baziramak enga R, Leoux GD and Simard RR. 1995. Ef fects of ben
zoic and cinnamic acids on membrane permeabilit y of soybean roots.
J Chem Ecol , 21: 1271~ 1285
2 Cao Y and He XW. 1998. S tudies of interaction betw een safranine
7875 期 阮维斌等:两种羟基苯乙酸对大豆萌发的化感效应研究
T and double helix DNA by spect ral m ethods. S pectr ochem Acta
Par t A , 54: 883~ 892
3 Chung Illm in, S eigler D and Miller DA, et al . 2000. Autotoxic
compounds from fresh alfalfa leaf ext ract s: ident if icat ion and bio
logical act ivity. J Chem Ecol , 26( 1) : 315~ 327
4 Du Y J (杜英君) an d Jin YH(靳月华) . 1999. Simulat ions of al
lelopathy in cont inuous cropping of soybean . Chin J App l Ecol (应
用生态学报) , 10( 2) : 209~ 212 ( in Chin ese)
5 Hassan MS , ALSaadaw i IS and ELBehadl i AH. 1989. Cit rus re
plant problem in Iraq II. Possible role of allelopathy. Plant and
Soi l , 116: 157~ 160
6 Hu JCH(胡江春) and Wang SJ( 王书锦) . 1996. Study on soil
sickn ess by soybean cont inuous cropping I. Effect of mycotoxin
produced by Penici ll ium p urpu rogenum. Chin J App l Ecol (应用
生态学报) , 7( 4) : 396~ 400 ( in Chinese)
7 Huang ZQ(黄志群) , Liao LP(廖利平) , Wang SL(汪思龙) , et
al . 2000. Dynamics of phenolic content of Chinese f ir stumproot s
and the rhizosphere soil an d it( s allelopathy. Chin J Ap pl Ecol (应
用生态学报) , 11( 2) : 190~ 192 ( in Chinese)
8 Jose S and Gillespie AR. 1998. Allelopathy in black walnut
( Juglans nig ra L. ) alley cropping I. Spat iot emporal variat ion in
soil juglone in a black w alnutcorn ( Zea mays L. ) alley cropping
system in the midw estern USA. Plan t and Soi l , 203: 191~ 197
9 Kong CH (孔垂华) , Xu XH (徐效华) , Chen JJ (陈建军) , et
al . 2002. Allelopathy of Ageratum conz oides IX. T ransformat ion
of main allelochemical in the soil. Acta Ecol S in (生态学报) , 22
( 8) : 1189~ 1195 ( in Chinese)
10 Leather GR and Einhellig FA. 1988. Bioassay of naturally occur
ring allelochemicals for toxicity. J Chem Ecol , 14: 1821~ 1828
11 Lin JH(林加涵) , Wei WL(魏文铃) , Peng XX(彭宣宪) , eds.
2001. Modern Biological Experiment ). Beijing: China Higher Ed
ucat ion Press, and Berlin, Heidelberg: SpringerVerlag. 100 ~ 102
( in Chinese)
12 Lin WX(林文雄) , He HL(何华勤) , Guo YC(郭玉春) , e t al .
2001. Rice allelopathy and it s physiobiochemical characterist ics.
Chin J App l Ecol (应用生态学报) , 12( 6) : 871~ 875 ( in Ch i
nese)
13 RomeroRomero T, Anaya AL and CruzOrteg R. 2002. Screening
for effect s of phytochemical variabilit y on cytoplasmic protein syn
thesis pat tern of crop plants. J Chem Ecol , 28( 3) : 617~ 629
14 Ruan WB(阮维斌) , Zhao ZJ(赵紫娟) , Xue J (薛 健) , et al .
2001. M easurement of five allelopathic related phenolic acids by
high performance l iquid chromatography. Chin J Ap pl Env i ron Bi
ol (应用与环境生物学报) , 7( 6) : 609~ 612 ( in Chinese)
15 Xu XD( 许晓东 ) and Chen WX (陈文新) . 1996. Analysis on
Rhiz obium t ianshanense by w hole cell protein elect rophoresis and
multilocus enzym e elect rophoresis. Microbiology(微生物学通报 ) ,
23( 3) : 131~ 135 ( in Chinese)
16 Yang QK( 杨庆凯 ) , Ma ZF(马占峰) and Li JL (李济文 ) .
1994. The problem countmeasured of soybean follows next crop in
Heilongjiang Provin ce. Soybean Sci (大豆科学) , 13: 157~ 163 ( in
Chinese)
17 Yu JQ, Shou SY, Qian YR, e t al . 1999. Autotoxic potential of cu
curbit crops. Plant and Soil , 223: 147~ 151
作者简介 阮维斌, 男, 1971年 6月生, 博士, 南开大学生
命科学学院副教授. 主要从事作物连作障碍研究. Email:
caurwb@ yahoo . com. cn.
788 应 用 生 态 学 报 14卷