全 文 ：二氧化硫对地衣中共生藻菌营养关系影响研究*
孔繁翔* * 胡 伟 桑伟莲 王连生
(南京大学环境学院污染控制与资源化研究国家重点实验室,南京 210093)
摘要 为探讨地衣对大气污染特别敏感的原因, 分离淡腹黄梅衣( X anthoparmellia mex icana)的共生藻
和共生真菌, 并重新合成地衣.研究了地衣及纯化培养的藻和菌在 SO2 污染短期胁迫下的生理反应. 结果
表明, 叶绿素 a比叶绿素 b 易受伤害;叶绿素对 0. 5mg!L- 1的熏气最敏感, 水溶液暴露时叶绿素 PQa值的
下降与 SO2 的吸收量有相关性.地衣中酸性磷酸酶活性主要由共生藻所决定. 丙二醇含量在共生藻和菌
以及地衣样品中无显著差异; 还原型谷胱甘肽 GSH 含量在共生菌中明显高于共生藻, 并与 SO2 胁迫强度
密切相关. 可以作为地衣过氧化状态和受损的生物标志物.共生真菌承担了地衣主要的抗氧化任务, 由于
物质与能量的消耗, 共生藻比共生菌更容易受到伤害.
关键词 淡腹黄梅衣 SO2 营养关系 抗氧化系统
文章编号 1001- 9332( 2002) 02- 0151- 05 中图分类号 X171 5 文献标识码 A
Effects of sulphur dioxide on the relationship between symbionts in lichen. KONG Fanxiang, HU Wei, SANG
Weilian, WANG Liansheng ( School of the Env ir onment, State K ey L aborator y of Pollution Contr ol and Re
sour ces Reuse, Nanj ing Univer sity , Nanj ing 210093) . Chin. J . A pp l . Ecol . , 2002, 13( 2) : 151~ 155.
X anthoparmellia mexicana was successfully isolating and culturing from its two symbionts and, preliminarily resymbio
sising its thalli in vitr o performed from pure cultured photobiont and mycobiont. The solution exposure method w as ap
plied, confirming the tox ic effect of sulfite solution with pH 40. The biochemical responses of lichen thalli and cultured
symbionts to the short time stress of SO2 were studied. The chlorophyll PQa value of photobiont was correlated with its
absorption of SO2 . Chlorophyll a was more sensitive than chlorophyll b; chlorophyll was damaged most severely by the
exposure of 0 5mg!L- 1 of SO2 fumigation, but was aggravated with the increase in the concentration of SO2 by way of
solution exposure. The activity of acid phosphatase in lichen was mainly dependent on the photobiont. Reduced glu
tathione( GSH) was activated by ox idative str ess of SO2. GSH was confirmed to be highly correlated with SO2 stress, and
was proposed to be a significant and prospective biomarker of the status of lichen antioxidant system and the oxidative
damage in lichen. The mycobiont was proposed to mainly r esist the oxidative stress by SO2, while the photobiont was
damaged more easily with energy depletion.
Key words Xanthoparmellia mex icana, SO2 , Antiox idant defense system.
* 国家自然科学基金( 39570150)和教育部骨干教师基金资助项目.
* * 通讯联系人.
2001- 07- 19收稿, 2001- 09- 12接受.
1 引 言
地衣对大气 SO2污染特别敏感. 目前文献报道
主要是分别研究污染物对藻类和真菌的作用, 对藻
类与真菌两共生生物之间的营养关系影响报道较
少. SO2 对地衣的影响研究方法中水溶液暴露法更
接近于 SO2 的作用机理[ 6] , 且易于准备和控制, 不
同实验室的数据易于比较. 目前国内对地衣的熏气
研究较少,水溶液法仍未见报道.本实验采用水溶液
处理法处理人工分离的地衣真菌、藻类的纯培养物
和人工合成的地衣体, 观察 SO2 胁迫对地衣体内共
生藻细胞和真菌的生产过程和营养物质吸收以及抗
氧化能力的影响,阐明地衣对大气污染特别敏感的
原因.
2 材料与方法
2 1 实验材料
淡腹黄梅衣 ( Xanthoparmellia mex icana)于 1998 年和
1999 年 4、5 月从南京紫金山 ( 32∀6#N, 118∀50#E)向阳岩石
上采集. 紫金山 SO2年日均浓度为 45~ 50g!m- 3, 新鲜采集
的地衣在 2h 内送达实验室.
2 2 共生藻和共生菌的分离培养
2 2 1 共生藻的分离培养 剪取新鲜采集的淡腹黄梅衣的
干净裂片, 在加有玻珠的蒸馏水中反复荡洗去除地衣裂片表
面沾附的尘土和杂物. 裂片用 0. 1% HgCl2 消毒 1 ~ 2min
后, 转移至无菌室,无菌水振荡洗涤. 在解剖镜下将地衣的藻
胞层刮离髓层, 血球计数板计数藻胞浓度(约为 2. 5 ∃ 106
应 用 生 态 学 报 2002 年 2 月 第 13 卷 第 2 期
CHINESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY, Feb. 2002, 13( 2)%151~ 155
个!ml- 1) , 以 100, 10- 1, 10- 2 , 10- 3稀释度, 0. 05ml!皿- 1分
别涂布于 LF 培养基平板上[ 8] , 25 & 3000Lux 光照培养. 15
~ 20d 左右出现藻落, 进一步划线纯化即获得无菌单藻落.
分离得到的共生藻鉴定为共球藻属( T reboux ia sp. ) , 生长极
其缓慢,藻胞在液体培养基中易聚成藻团.
222 共生菌的分离培养 无菌条件下刮去地衣裂片的上
皮层和藻胞层, 取髓层菌丝用无菌水漂洗 3 次, 转移至 LF
培养基平板上. 25& 培养. 接种 3d 后, 在平板中补充已过滤
除菌的生物素(维生素 H, 0. 5mg!ml- 1)和维生素 B1 ( 10mg!
ml- 1) . 共生菌在 12~ 20d 后形成菌丝,菌落初时为白色绒毛
状,逐渐变厚实. 随后开始出现黄色菌环. 由于未形成分生
孢子,菌种的鉴定有待进行.
223 从分离的共生藻和菌合成地衣 将共生藻藻液浓
缩,接种至 2% 水琼脂斜面, 培养 5d 后, 接入共生菌菌丝,
25 & , 3000Lux 光照培养,光暗周期比为 12%12.
23 SO2 水溶液暴露实验
根据动态熏气实验结果[ 7]以及 SO 2 水气状态浓度换算
公式[ 3, 4]设置水溶液处理浓度 (表 1) .称取 0. 50g Na2SO3 定
容于 500ml容量瓶中作为 SO2储备液,实验时稀释配成新鲜
染毒液, 暴露实验中实际 SO2 浓度用甲醛吸收盐酸副玫瑰
苯胺分光光度法测定. 根据文献[ 5]及预实验结果, SO 2 水溶
液的 pH 值设为 4. 0.在此条件下 24 h 内水溶液中 SO2 浓度
变化率小于 10% ,进行短期暴露实验.
表 1 水溶液中 SO2 浓度设定及实际气态浓度
Table 1 Designed and actual concentration of SO2 in the exposured solu
tion
项目
Item
组别 Group
1 2 3 4 5 6
SO2气态( v/ v, mg!L- 1) 0. 0 0. 25 0. 5 1. 5 3. 0 6. 0
SO2水溶液 ( wt/ wt, mg!L- 1) 0. 0 5. 15 7. 28 12. 60 17. 84 25. 23
SO2 实际浓度( mg!L- 1) 0. 0 5. 03 7. 52 11. 50 17. 30 27. 70
偏差 Deviation( % ) 0. 0 - 2. 3 3. 3 - 8. 7 - 3. 0 10. 0
处理前 1 天,收集共球藻和共生菌, 分别置于蒸馏水 24
h进行营养饥饿.藻液用离心法, 菌用筛网过滤法收集, 与地
衣共生体三者分别加入到不同浓度的 SO2 水溶液中进行处
理实验. 生物样品在 SO2 水溶液中振荡处理 8h, 25 & ,
3000Lx 光照.测定生物处理前后水溶液SO2 浓度和 pH 值变
化.处理后收集样品, 过滤收集藻和菌;地衣用吸水纸吸干表
面,蒸馏水洗涤后除去水分. 称取 3 份样品 95 & 烘 2h, 称量
后再烘 1h 恒重, 以此换算出藻菌的干重与鲜重的比值.
24 生化指标测定
在水溶液处理后,收获、冷冻地衣体、共生藻和菌, 按文
献中所述方法测定叶绿素含量、脱镁叶绿素比值 ( PQa )、酸
性磷酸酶活性、丙二醇含量和还原谷胱苷肽 ( GSH ) 含
量[ 1, 2, 12] .
25 数据处理
每一指标测定均设 3~ 4 个平行.用 STATGRAFIC 统计
软件包处理数据.数据的显著性差异用 ANOVA的多重比较
检验( LSD)计算检验. 结果以均值和测定误差报告, 柱形图
或线图上方符号代表数据之间差异的显著程度.
3 结果与讨论
31 地衣人工合成结果观察
共生菌接入试管后,菌丝向外生长,并延伸至藻
胞团周围. 接种 30d 内菌丝逐渐包围藻胞团, 40d
后,藻菌紧密混合在一起,但整团混合物呈现藻的深
绿色.镜检发现被菌丝包围的藻胞呈现灰绿色, 排列
紧密,出现一定程度的藻菌定位分化,藻胞被菌丝包
裹着推移至藻菌混合团的外侧, 在其上伸展有薄薄
的菌丝,藻胞层后面是松散的菌丝层,出现了菌丝裹
着藻胞向外伸展的指状结构 (图 1d) . 160d后共生
混合物中菌丝与藻胞紧密缠绕, 形成了类似于原植
体的生长.藻胞以营养细胞分裂和静孢子方式扩大
藻胞数量,在解剖镜下观察,可见到原植体出现了背
腹之分. 贴着琼脂斜面的腹部为褐色紧密的菌丝组
织,背面的黄褐色菌层上有绿色藻胞团,为菌丝所包
围.用压片法在显微镜下观察,原植体的中心部位为
菌丝组织,在腹部有少量的藻胞,背面为菌丝缠绕着
藻胞,根据已有文献报道,人工合成的地衣缺少皮层
部分[ 9] ,藻胞层分布在原植体外面, 因此共生体逐
步发育成地衣[ 10, 11] .
32 SO2 对地衣、共生藻和共生菌的生理影响
321 对地衣和共生藻叶绿素含量的影响 SO2
水溶液对地衣共生体和共球藻中叶绿素 PQa 值的
影响见图 2.在共球藻处理组中, SO2处理明显降低
了其 PQa值, 从 1. 5mg!L- 1到 6. 0mg!L- 1, PQa值
从对照组的 1. 39分别下降到 1. 34和 1. 16; 在地衣
处理组中,低浓度 SO2 处理对 PQa值的影响并不明
显.只有当 SO2 浓度高达 3. 0mg!L - 1,地衣的 PQa
值才出现显著下降.可见,地衣共生体不如纯培养的
共球藻对 SO2 敏感. 这可能由于共球藻培养于液态
培养基中, 以单细胞或小的藻胞团存在, 与 SO2 接
触的表面积远大于地衣,其吸收 SO2 的能力和受损
机率亦比地衣共生体大. SO2 处理对共球藻和地衣
叶绿素含量的影响见图 3. 结果表明, 叶绿素 a 随
SO2处理浓度升高而明显下降, 而叶绿素 b虽有所
下降,但无统计学差异.叶绿素 a 比叶绿素 b对 SO2
的胁迫更加敏感, 与 PQa值的变化规律类似. 在地
衣中虽然叶绿素 a 在 SO2 浓度高于 3. 0mg!L - 1时
由 1. 50mg!g- 1 DW下降到 1. 4mg!g - 1DW 左右,叶
绿素 b由对照组中的 2mg!g- 1DW 以上下降到3. 0
mg!L- 1处理时的 1. 94mg!g- 1DW 和 6. 0mg!L - 1处
理组中的1. 83mg!g- 1DW. 但SO2水溶液处理未显
152 应 用 生 态 学 报 13卷
图 1 地衣中共生藻和共生菌分离及再共生
Fig. 1 Isolat ion and resymbios is of lichen from photobiont and m ycobiont .
a)共生藻 Photobiont ( 100∃ ) ; b)共生菌 Mycobiont ( 100∃ ) ; c)菌丝缠绕着藻细胞Algal cells tw ined by hyphae( 33∃ ) ; d)共生体中藻菌定位分
化 Aggregate symbionts changing from homogeneneity to diff erent iat ion( 33∃ ) ; e)藻细胞外围覆盖菌丝Algal cells enveloped by hyphae ( 33∃ ) ; f )
形成一定结构的地衣体 The format ion of th e resynthesis structure of lichen ( 20∃ ) .
著减少地衣叶绿素含量.
322 对地衣、共生藻和共生菌内酸性磷酸酶活性
的影响 藻、菌和地衣体内的酸性磷酸酶活性测定
结果见图 4. 由图 4可知,地衣共生体内该酶的活性
高于共球藻和共生菌酶活性 10 倍. 同时, 共生菌的
酶活性随 SO2 处理浓度的升高而显著下降. 地衣和
共球藻的酶活性则呈现相似的 V 型变化趋势:
05mg!L- 1处理时酶活性最低, 1. 5, 3. 0和 6. 0mg!
L- 1处理的酶活性虽比对照组和 0. 25mg!L- 1处理
的低, 但与 0. 5mg!L- 1相比呈现上升的趋势. 地衣
的各处理组间无统计学差异, 但在共生藻的各处理
组间的酶活性则有明显差异, 由于地衣和共生藻两
者酶活性的变化趋势相互平行, 可以认为地衣中酸
性磷酸酶主要由共生藻决定, 即在酸性环境中,地衣
吸收 P 主要依靠共生藻, 而不是真菌菌丝.
323 对地衣、共生藻和共生菌内丙二醛含量影响
膜脂的过氧化程度可用丙二醛含量来衡量. 对丙
二醛的测定表明,短时间 SO2 暴露对地衣的丙二醛
含量影响不大, 所有暴露浓度的地衣丙二醛含量不
存在显著性差异(图 5) . 可能共生状态对地衣抗御
SO2 氧化胁迫有一定贡献. 但培养的共球藻和共生
菌在 SO2 胁迫下丙二醛含量呈明显增长, 而且都在
SO2 浓度达到0. 5mg!L - 1时丙二醛含量出现显著升
高.就丙二醛含量增长的程度而言,共球藻的伤害症
状比共生菌明显.
324 对地衣、共生藻和共生菌 GSH 含量的影响
GSH 含量测定结果表明(图 6) ,共生菌的 GSH 含
量比共球藻高 1 个数量级,这是一个非常引人注意
的结果,它表明在共生状态下,地衣用以抵抗氧化胁
迫的 GSH 可能主要来源于共生真菌, 共生菌承担着
地衣抗氧化的作用 .地衣、共生藻和共生菌的GSH
图 2 SO 2水溶液处理对地衣和共球藻 PQa 值的影响
Fig. 2 Effect s of SO 2 solut ion exposure on PQa in lichen and Tre boux ia
sp.
∋ 共球藻 T rebou xia sp. , ( 共生菌 Mycobiont .图中字母相同表
示无显著差异No significant dif ferent is indicated by the same let ter.下
同 The same below .
1532 期 孔繁翔等:二氧化硫对地衣中共生藻菌营养关系影响研究
图 3 SO 2 水溶液处理对地衣和共球藻叶绿素含量的影响
Fig. 3 Ef fects of SO 2 solut ion exposure on chlorophyll content in lichen
and Tre boux ia sp.
∋ 共球藻叶绿素 a Chlorophyll a in Tre boux ia sp, ( 共球藻叶绿素
b Chlorophyll b in T reboux ia sp, ) 地衣叶绿素 a C hlorophyll a in
lichen, ∗ 地衣叶绿素 b Chlorophyll b in lich en.
图 4 SO 2 水溶液处理对地衣、共球藻和共生菌酸性磷酸酶活性的影响
Fig. 4 Ef fects of SO 2 solut ion exposure on acid phosphatase in lichen and
cultured photobiont and mycobiont .
∋ 共生藻 Photobiont , ( 共生菌 Mycobiont , ) 地衣 Lichen.
含量均表现为先升后降的趋势, 共球藻和地衣尤为
明显.这可能是在氧化胁迫下,生物通过各种途径调
动或诱导产生尽可能多的 GSH 来去除氧自由基, 但
GSH的更新需要充足的能量和物质供应来维持
( GSSG 还原为 GSH , 需消耗还原力 NADPH) , 所
以,如果胁迫强度进一步加强,能量供应不足, 将导
致 GSH 含量下降.因此,根据本实验结果可以假设:
GSH 含量升高意味着生物防御系统在起着有效的
保护作用,一旦其含量低于对照, 则表明生物受损.
因此, GSH 含量变化可以作为监测环境影响的生物
标志物. 如果将 GSH 与其它指标联系起来, 可以发
现,共球藻的 PQa值在 GSH 含量上升时基本不变;
而在 1. 5和 3. 0mg!L- 1处理组, GSH 含量下降到一
定水平, PQa 值明显下降; 在 6. 0mg!L - 1处理组,
GSH 和 PQa值都大幅度下降.
图 5 SO 2水溶液暴露对地衣、共球藻和共生菌丙二醛含量的影响
Fig. 5 Ef fect s of SO2 solut ion exposure on malondialdehyde ( MDA) con
tent in lichen and cultured photobiont and mycobiont.
∋ 共生菌 Mycobiont , ( 地衣 Lichen, ) 共生藻 Photobiont .
图 6 SO 2水溶液处理对地衣、共球藻和共生菌 GSH 含量的影响
Fig. 6 Effect s of SO 2 solut ion exposure on GSH content in l ichen and cul
tured photobiont and mycobiont .
∋ 地衣 Lichen, ( 共生藻 Photobiont , ) 共生菌 Mycobiont .
对地衣、共生藻和共生菌的生理生化指标测定
表明,一旦受到外界干扰, 藻类可能会首先受到伤
害;地衣的抗氧化胁迫则主要由共生菌所承担. 在地
衣中真菌占有的生物量比藻类高, 在受到外界环境
干扰时,一方面叶绿素含量下降,光合作用过程受到
抑制,同化产物减少;同时, 为抵抗恶劣环境,生产力
水平本身就十分低下的藻类所合成的物质与能量又
大部分运输到真菌菌丝中, 以形成 GSH 等来抵御外
界恶劣环境.但由于物质与能量的限制,真菌不可能
储备很多 GSH .因此, 地衣对外界的环境压力的抗
性十分脆弱, 这可能是地衣对大气污染特别敏感的
主要原因之一.
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作者简介 孔繁翔, 男, 1957 年 11 月生, 博士, 教授, 博士生
导师,南京大学环境学院副院长, 中国生态学会污染生态专
业委员会副主任. 主要从事分子生态毒理学研究,发表论文
40 余篇, 主编教材 1 本. Email: kongfx @ jlonline. com 或
kongfx3@ nju. edu. cn
致 读 者 ! 作 者
+应用生态学报,系中国科学院沈阳应用生态研究所和中国生态学会主办的国内外公开发行的学术性期
刊,科学出版社出版.国际标准刊号为 ISSN10019332. 专门刊载有关应用生态学(主要包括森林生态学、农
业生态学、草地牧业生态学、渔业生态学、自然资源生态学、景观生态学、全球生态学、城市生态学、污染生态
学、化学生态学、生态工程学等)的具有创新性的综合性论文、研究报告和研究简报等.
本刊创刊于 1990年,现为月刊,采用国际标准开本( 210mm ∃ 285mm) , 128面,每期 28万字. 本刊系中
国自然科学核心期刊,曾荣获全国优秀科技期刊和中国科学院优秀期刊称号.本刊整体质量和水平已达到相
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1552 期 孔繁翔等:二氧化硫对地衣中共生藻菌营养关系影响研究