全 文 ：光合细菌 Rhodopseudomonas 产氢
的影响因子实验研究 3
朱核光　赵琦琳　史家梁　(华东师范大学环境科学系 ,上海 200062)
【摘要】　利用光合细菌 Rhodopseudomonas 8 株菌株研究初期活性、光照强度、C 源种类、菌
株差异对生物产氢的影响表明 ,不同菌株的 C源利用性有较大差异 ,但对乳酸钠都有很好
的利用性. 细菌的初期活性对产氢有一定程度的影响 ,稳定生长期的细菌比对数生长期的
细菌产氢活性略高. 光照强度对产氢活性的影响明显 ,在光饱和度以下 ,光照强度大则产
氢速率高. 不同菌种的产氢性能有效大差异 ,从上海地区有机污染环境中分离到的
Rhodopseudomonas B21菌株在以乳酸钠 (50 mmol·L - 1) 为 C 源、谷氨酸钠 (10 mol·L - 1) 为 N
源 ,6 000 Lx 光照、30 ℃下 ,最大产氢速率达到 14. 7 ml·h - 1·g - 1细胞干重.
关键词 　光合细菌 　产氢 　影响因子
Affecting factors on hydrogen production by photosynthetic bacteria Rhodopseudomonas . Zhu
Heguang ,Zhao Yilin and Shi Jialiang( East China Normal University , Shanghai 200062) . 2Chin. J .
Appl . Ecol . ,1997 ,8 (2) :194～198.
8 strains of photosynthetic bacteria Rhodopseudomonas were used to study the effect of bacterial initial
activity , illumination intensity , carbon sources , strain differences on their hydrogen production. The
results show that different strains are differed significantly in carbon source utilization ,but they can uti2
lize sodium lactate very well. Bacteria initial activity affects hydrogen production to a certain extent ,
and the hydrogen production activity of the bacteria is slightly higher in its stable growth phase than
that in exponential growth phase. Illumination intensity has a significant influence on hydrogen produc2
tion. Higher illumination intensity leads to higher hydrogen production rate. Strain B21 of Rhodopseu2
domonas isolated from organically polluted areas of Shanghai has a very high hydrogen production rate ,
being 14. 7 ml·h - 1·g - 1 (dry cell) with the carbon source of sodium lactate (50 mmol·L - 1) , nitro2
gen source of sodium glutamate (10 mmol·L - 1) , illumination intensity of 6000 lux , and the tempera2
ture of 30 ℃.
Key words 　Photosynthetic bacteria , Hydrogen production , Affecting factor.
　　3 上海市环保局重点科研基金资助项目.
1995 年 8 月 9 日收稿 ,1996 年 4 月 4 日接受.
1 　引 　　言
光合细菌在光照条件下的产氢主要是
固氮酶功能的发挥. 固氮酶在缺少其生理
性基质 N2 或产物 NH +4 时能还原质子放出
H2[10 ] . 因此 ,光合细菌利用有机物产氢时 ,
固氮酶的抑制因素、电子供体的种类即 C
源以及光照强度都会对其产生重要影
响[6 ,8 ,9 ] ,同时菌种的个体差异及内部酶系
统的发育程度等也会造成不可忽视的影
响. 对光合细菌产氢的研究已引起国内学
者的重视和兴趣 ,吴永强等[2 ]曾考察了铵
及氮气对浑球红假单胞菌放氢的影响 ;刘
双江等[1 ]分离筛选出了高效的紫色非硫细
菌产氢菌株. 本研究选用光合细菌红螺菌
科红假单胞菌属 ( Rhodopseudomonas) 的 8
株菌株 ,初步考察了菌种的初期活性、光照
强度、不同 C 源以及菌种异对产氢的影
应 用 生 态 学 报 　1997 年 4 月 　第 8 卷 　第 2 期 　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHINESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY,Apr. 1997 ,8 (2)∶194～198
响 ,并获得了具有优异产氢性能的菌株.
2 　材料与方法
2. 1 　供试菌种
光合细菌 Rhodopseudomonas B21 、B22 、4. 1、SB
菌株用苹果酸钠 (2 g·L - 1) 培养基、光照厌氧条件
下从上海地区有机污染环境中富集分离得到. 这
些菌株均为革兰氏阴性菌 ,油镜下观察呈球型或
短杆型 ,菌液外观呈洋红或紫红色 ,能利用醋酸、
丙酸、丁酸、戊酸、苹果酸、琥珀酸、延胡素酸、乳
酸等多种有机酸光照厌氧条件下生长. 吸收光谱
的两个有效吸收峰都在 806～874 nm 近红外区域
内 ,其产氢特性尚未研究. 光合细菌 Rhodobacter
sphaeroides (原名为 Rhodopseudo2 monas sphaeroides)
RV、DSM、S、ATCC菌株由日本通产省工业技术院
生命工学工业技术研究所惠赠.
2. 2 　培养基
　　培养基分为生长培养基和产氢培养基 . Rp. 、
B21 、B22 、4. 1、SB 菌株的生长培养基含有醋酸钠
1 g ,琥珀酸钠 1 g ,酵母浸出汁 0. 5 g ,硫酸铵 1 g ,
基础培养基 1 L. Rb. sphaeroides RV、DSM、S、ATCC
菌株的生长培养基含硫酸铵 1. 25 g ,琥珀酸钠
9. 8 g ,酵母浸出汁 1. 0 g ,基础培养基 1 L. 基础培
养基成分参照文献 [ 7 ] . 产氢培养基含谷氨酸钠
1. 872 g ,乳酸钠 9. 34 g ,碳酸氢钠 1. 5 g ,基础培养
基 1 L. 在进行不同 C源对产氢的影响试验中 ,乳
酸钠用其它 C 源代替 ,投加量保持相同的摩尔
数 ,其它成分不变.
2. 3 　实验方法
在 120 ml 的细胞培养瓶中 (受光面积为 38
cm
2)加入产氢培养基 ,置于厌氧缸中 ,抽气减压直
至培养液中气泡大量溢出 ,静止 30 min ,以充分赶
跑培养液中的氧气 ,高温灭菌 ,冷却后快速接种
处于某一生长期的菌液 (菌液生长条件为 30 ℃,
厌氧光照) ,接种量约 20 % ;然后快速置于恒温玻
璃水浴缸中 ,温度保持 30 ℃,光线从光源透过水
浴缸的玻璃 ,再透过细胞培养瓶壁照射到细胞表
面上. 光源为 50 W卤钨冷光灯 ,通过改变光源与
玻璃水浴缸的距离可调节光照强度 ,光照强度用
水下照度仪测定 (上海嘉定学联仪表厂生产) ,所
产生的气体用排水集气法收集于带刻度的 200 ml
倒置针筒中 ,并用气相色谱仪 ( GC2RIA ,Shimadzu)
进行纯度分析. 实验中所观察的影响因子有 C 源
的种类、细菌的初期活性、光照强度、菌种的差
异.
3 　实验结果
3. 1 　不同 C源的产氢利用性
由于 C 源的种类较多 ,仅观察了光合
细菌均能很好利用的柠檬酸循环中间产物
琥珀酸、苹果酸 ,以及乳酸发酵产物乳酸 ,
以检验不同 C源对产氢的影响. 图 1～3 分
别表示光合细菌对乳酸钠、琥珀酸钠、苹果
酸钠的产氢利用性.
　　尽管乳酸钠、琥珀酸钠、苹果酸钠都是
能被 Rhodopseudomonas 属的细菌有效地用
于生长代谢的生理活性物质[3 ] , 但在产
图 1 　光合细菌对乳酸钠的产氢利用性
Fig. 1 Utilization of sodium lactate for hydrogen production by
photosynthetic bacteria.
图 2 　光合细菌对琥珀酸钠的产氢利用性
Fig. 2 Utilization of sodium succinate for hydrogen production
by photosynthetic bacteria.
5912 期 　　　　　　朱核光等 :光合细菌 Rhodopseudomonas 产氢的影响因子实验研究 　　　　　
图 3 　光合细菌对苹果酸钠的产氢利用性
Fig. 3 Utilization of sodium malate for hydrogen production by
photosynthetic bacteria.
氢条件下光合细菌对它们的利用却表现出
了一定的差异 ;其中以乳酸钠的利用性最
好 ,该结论和 Hillmer 等的报道相一致[4 ] .
对乳酸钠 B21、B22、4. 1、SB 4 菌株都能有效
地利用 ,最大产氢速率分别为 14. 7、12、6. 8
和 3. 3 ml·h - 1·g - 1细胞干重 ,并且在接种
20 h 后便开始释放 H2 . 对琥珀酸钠只有
B21、B22菌株能有效地利用 ,最大产氢速率
分别为 13. 3 和 6. 9 ml·h - 1·g - 1细胞干重 ,
接种 40 h 后开始观察到释放氢 ; 对苹果酸
钠虽也观察到了 4 株菌株的不同程度的放
氢现象 ,但其中只有 B21菌株利用效果好 ,
接种 30 h 后便开始释放 H2 ,而其它 3 株菌
则在 90 h 后才开始释放 H2 .
从图 2、3 可见 ,B21菌株利用琥珀酸钠
和苹果酸钠产氢 ,从 22～40 h 开始 ,一直
持续到 160 h 以上 ,说明固氮酶在催化产
氢代谢中所发挥的作用是一种不可逆的作
用 ,而且这种酶系统在一定条件下是相当
稳定的. 本实验结果表明 ,B21菌株具有比
其它 3 株菌优异的产氢性能.
3. 2 　不同初期活性对产氢的影响
具有不同初期活性的细菌所具有的酶
系统的发育程度有所不同 ,不同初期活性
可用微生物的不同生长期来规定. 在本实
验中 ,分别取处于对数生长期和稳定期的
光合细菌来观察不同初期活性对产氢的影
响. 由于在前一个实验中已发现 B21菌株具
有较高的产氢速率 ,因此 ,选此菌株来进行
实验. 测定 B21菌株的生长曲线时 ,细胞浓
度用 7230 分光光度计 660 nm 波长的吸光
值来表示.
图 4 表示 B21菌株的生长曲线. B21菌
株在 2～20 h 期间处于对数生长期 ,而 20 h
后则逐渐进入稳定生长期. 因此 ,分别取培
养 16 h 和 26 h 的菌种接种到产氢培养基
中进行产氢试验 ,结果示于图 5.
图 4 　Rp. B21菌株的生长曲线
Fig. 4 Growth curves of Rhodopseudomonas B21 strain.
图 5 　不同生长期的 B21菌株的产氢比较
Fig. 5 Comparison of hydrogen productions by Rhodop2 seu2
domsonas B21 strain in different growth phases.
　　从图 5 可以看出 ,处于不同生长期的
光合细菌的产氢活性略有差异. 处于稳定
期的光合细菌的产氢能力略高于对数生长
期 ,这表明光合细菌内产氢的酶系统发育
程度不同对产氢有一定影响. 此外 ,在本实
691 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　8 卷
验条件下 ,处于稳定生长期的光合细菌 ,对
培养基中的基质包括对产氢有抑制作用的
铵盐的利用比较充分 ,因而随接种进入产
氢环境的抑制因素较少 ,有利于产氢酶系
功能的发挥.
3. 3 　不同光照强度对产氢的影响
从图 6 可见 ,光合细菌的产氢活性随
着光照强度的增大而增大 ,在 10 000 和
6 000 Lx 下比在 1 000 Lx 下产氢活性显著
提高 ,10 000 Lx 下最大产氢速率达到 12. 5
ml·h - 1·g - 1细胞干重 ,6 000 Lx 下为 10 ml·
h - 1·g - 1细胞干重 ,而在 1000 Lx 下仅为 3
ml·h - 1·g - 1细胞干重 ,而且释氢较迟. 在
10 000 Lx 下和在 6 000 Lx 下产氢活性差别
相对说比较小 ,光照强度增加到一定程度
后对产氢活性的影响将会逐渐减小 ,因此 ,
5 000～12 000 Lx 下进行产氢较适宜. 光合
细菌产氢对光照强度的依赖性说明直接从
光源中吸收能量在光合细菌内部的氧化还
原过程或电子传递过程中发挥了重要作
用.
图 6 　不同光照强度对产氢的影响
Fig. 6 Effect of light intensity on hydrogen production.
3. 4 　不同光合细菌产氢性能差异
在不同 C 源的利用性实验中已初步
证明了不同光合细菌对同一 C 源产氢利
用性 存 在 差 异 , 在 本 实 验 中 用 Rb.
sphaeroides RV、DSM、S、ATCC 菌株进一步
对此加以验证 (图 7) .
　　图7同样表明了不同菌株对乳酸钠具
图 7 　不同菌种对乳酸钠的利用性差异
Fig. 7 Difference of sodium lactate utilization by different
species.
有不同的产氢利用性 ,ATCC菌株在试验时
段内无释氢现象发生. 不同菌株对同一 C
源产氢利用性差异的存在反映了光合细菌
内部氢代谢系统的个体差异的存在.
4 　讨 　　论
4. 1 　C源的选择性
在 C 源利用性试验中 ,尽管仅试验了
3 种不同 C 源 ,但已表现出了较大的差异
性.这种差异性的存在主要是由于不同 C
源是以不同方式进入光合细菌内部代谢过
程的 ,以及在厌氧条件下形成的还原性质
子 H +的能力不一样 ,而 H + 积累所形成的
还原力吸收光激活的电子直接导致了氢分
子的释放. 了解光合细菌产氢过程中 C 源
的利用性对利用有机废水进行产氢有重要
意义 ,有助于确定哪些废水更适合于产氢.
另外试验的 3 种 C源乳酸、苹果酸、琥珀酸
也是有机废水酸化过程的重要产物.
4. 2 　光照强度的依赖性
光合细菌产氢强烈依赖于光照强度.
光照强度增加能增加光合作用的强度 ,从
而为产氢反应提供更多的能量和受激发电
子 ,加快产氢速度. 如果光照强度过大 ,接
近或超过光饱和值 ,则光照强度的影响会
随之下降. 光能的利用效率也会随之降低.
三宅淳等[8 ]研究结果同样说明了这一点.
7912 期 　　　　　　朱核光等 :光合细菌 Rhodopseudomonas 产氢的影响因子实验研究 　　　　　
4. 3 　不同菌种产氢能力的差异
不同的光合细菌由于其自身进化过程
上的差异 ,其所形成的酶系统必然会有差
异 ,表现在产氢的能力上也必然不同 ,因
此 ,高效产氢菌株的筛选一直是研究者探
索的课题. 由于本研究的大部分实验都是
以从上海地区有机污染环境中分离到的
Rhodopseudomonas 菌的一些菌株为材料 ,因
此 ,本实验也是对这些菌株的产氢性能的
研究. 其中 B21菌株以乳酸钠 50 mmol·L - 1
为 C 源 ,谷氨酸钠 10 mmol·L - 1 ,6 000 Lx
光照 ,30 ℃下产氢速率达到 14. 7 ml·h - 1·
g - 1细胞干重. 这一产氢速率比 Xing2Yi
Mao [5 ]等所分离到的大部分光合细菌菌株
的产氢速率都高. 与刘双江等[1 ]所分离到
紫色非硫光合细菌的产氢效率相当. 这些
菌株可望在应用有机废水的产氢实践中得
以应用.
致谢 　本实验得到日本通产省工业技术院生命
工学工业技术所能量变换研究室在菌种方面的
支持 ,得到该室三宅淳 (Jun Miyake) 博士、浅田泰
男 ( Yasio Asada) 博士许多建设性的意见 ,在此表
示衷心感谢.
参考文献
1 　刘双江、杨惠芳、周培瑾. 1993. 产氢非硫光合细菌
的分离与筛选. 微生物学通报 ,20 (5) :259～265.
2 　吴永强、陈秉俭、仇 　哲. 1991. 浑球红假单胞菌在
暗处发酵生长时的固氮酶、吸氢酶以及放氢机制的
研究. 微生物学通报 ,18 (2) :71～74.
3 　北村博、森田茂广、山下仁平. 1984. 光合成细菌. 学
会出版ÃÓ 一 ,47.
4 　Hillmer ,P. , Gest ,H. 1977. H2 metabolism in the photo2
synthetic bacteria Rhodopseudomonas capsulata : H2 pro2
duction by growing culture. J . Bacterioil . ,129 (2) : 734
～731.
5 　Mao Xing2Yi , Miyake , J . and Kawamura , S. 1986.
Screening photosynthetic bacteria for hydrogen production
from organic acids , J . Ferment . Technol , 64 (3) :245～
249.
6 　Mitsui ,A. ,Ohta , Y. et al . 1981. Photosynthetic bacteria
as alternative energy sources ———Overview on hydrogen
production research. Proceeding of The 2th International
Conference on Alternative Energy Source ,3403～3410.
7 　Miyake ,J . ,Mao ,X. Y. and Kawamura ,S. 1983. Photo2
production of hydrogen from glucose by a co2culture of a
photosynthetic bacteria and Clostridium butyricum , J .
Ferment . Technol , 62 (6) :531～535.
8 　Miyake ,J . , Kawamura , S. 1987. Efficient conversion of
light energy to hydrogen by photosynthetic bacteria. Pro2
ceeding of the IUPC Chemrawn VI Would Conference on
Advanced Material and Innovations in Energy. Transporta2
tion and Communications , Nippon Toshi Center , Tokyo ,
Japan , ⅡH14.
9 　Ormerod ,J . G. , Ormerod , K. S. , Gest ,H. 1961. Light2
dependent utlization of organic compound and photopro2
duction of molecular hydrogen by photosynthetic bacteria ,
relationships with nitrogen metabolism. Achiv. Biochem2
istry and Biophysics , 94 :449～463.
10 Weaver ,P. F. ,Lien ,S. and Seibert ,M. 1977. Photobio2
logical production of hydrogen. Solar Energy ,24 :3～45.
891 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　8 卷