全 文 ：应 用 生 态 学 报 年 ! 月 第 ∀ 卷 第 # 期
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转基因微生物生态学及大田释放风险
评价研究
张尚通 许崇任 比京大学生命科学学院讹京 < =! 3
【摘要】 向环境中释放转基因微生物可能会带来一 系列的安全问题 > 在大面积释放之前
必须对转基因徽生物在环境中发生基因转移的潜力 、存活能力 、扩散能力及对生态系统的
潜在影响等进行生态学研究和风险评价 , 同时还要探索有效的检侧方法和风险评价策略 >
该研究有助于分子生态学的发展和生物技术的安全应用 , 具有重要的理论和实践意义 >
关键词 分子生态学 转基因微生物 释放 风险评价
( ?≅ 7≅ Α 8 ≅ Β Α? Χ ? ΔΕ? Φ 778 ? ΧΑ 二Χ? Γ ?Η Ι Ε? Γ ≅ ΓΑΦ 川ϑΙϑ Φ Χ Η Γ7ϑ Κ Φ ϑϑ? ϑ ϑ Ι ? Χ Δ Β≅ Γ Δ加ΕΓ 17Φ Χ Χ?ΗΓ? 7?Φϑ ? > Λ Μ Φ Χ Α ) ΜΦ Χ ΑΔ ≅ Χ Α Φ Χ Η Ν 6 ∃ Μ ≅ Χ Α Γ? Χ 9肠左亡Α 亡 ≅Β / ΕΒ? ) Ο Ε?一 , 1? Κ Ε二 , ≅ ΕΠ? Γ>’ΕΘΔ8 , Ρ ? ΕΣ Χ Α < < = ! 3一 ∃Μ ΕΧ 二 > 人护; > (Ο ≅ 7 > , , ∀ 9# 3 : # ; ∀一 # # < >
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ΔΦ Χ Δ 1 Φ Γ Φ Ι ? Δ? Γ ϑ 7ΕΚ ? ϑ 6 Γ Π ΕΠ Φ 7 , Η Εϑ ϑ ? Ι ΕΧ Φ ΔΕ≅ Χ Φ Χ Η ?≅ Ι Υ ? ΔΕΔ Ε≅ Χ > &Δ‘∀ Φ 7ϑ ≅ ΕΙ 1≅ ΓΔ Φ Χ Δ Δ≅ ϑ ? Φ Γ? Μ
Β≅ Γ Ι ≅ Γ ? Π Φ 7ΕΗ Ι ? Δ Μ≅ Η ϑ ≅ Β Η ? Δ ?? ΔΕ≅ Χ Φ Χ Η Δ≅ ΕΙ 1Γ ≅ Π ? ΔΜ? ϑ Δ ΓΦ Δ? Α 8 ≅ Β Γ Εϑ Κ Φ ϑ ϑ ? ϑ ϑ Ι ? Χ Δ > Τ Μ ?
ϑ Δ6 Η 8 ∀ Μ ? 7Υ Β6 7 Β≅ Γ Η ? Π ? 7≅ Υ Ι ? Χ Δ ≅ Β Ι ≅ 7? ? 6 7Φ Γ ? ? ≅ 7≅ Α 8 Φ Χ Η Φ Υ Υ7Ε?Φ ΔΕ≅ Χ ≅ Β Ω Ε≅ Δ? ? Μ Χ ≅ 7≅ Α 8 >
Ζ ? 8 Ξ ≅ Γ Η ϑ ς ≅ 7? ? 6 7Φ Γ ? ? ≅ 7≅ Α 8 , 4 ( ς ϑ , 1 7Φ Χ Χ ? Η Γ ? 7? Φ ϑ ? , − Εϑ Κ Φ ϑ ϑ ? ϑ ϑ Ι ? Χ Δ ,
引 言
现代生物技术给人类展示了美好的发
展前景 , 但同时也带来了转基因生物安全
性的争论 > 许多科学家担心大量远缘物种
基因重组会打破物种的界限 , 影响 自然的
进化历程 > 由于 在环境中引入的转基因生
物具有全新的性状 , 可能对群落结构 和生
态系统的功能造成 影响 > 转基 因生物还 可
能影响 人体健康 , 基 因工程 中大量使 用的
抗抗生素标记基因 , 进入环境后可能转移
到 某种病原菌中引起疾病的流行 > 有的生
态学家甚至预言转基 因生物的释放将带来
“不可避免的环境灾难 ” > 而另一些科学家 ,
尤其是分子生物学家 > 坚信生物技术产 品
是安全的 , 出现这种灾难的机会极为微小 >
! ∀ 年在 . ϑ Ε7≅ Ι Φ Γ 召开的讨论 会第
一次表明了全球科学 家对重组 2 ∋ . 安全
性问题的关 注 [;∴ > 这次会议不仅标志着转
基因生物安全性研究的开端 , 而且引起各
国政府的重视 > 美国政府从 =< 年代初开始
干预美国的生物工程行动 [ ’<∴ > = ] 年 又公
布 了“生物技术法规协调大纲 ” > 欧共体在
< 年也公布 了两个法规— < ⊥ ; 针对 转基 因生物在封 闭环境中 的应 用 _ <⊥
; < 针对 转基因生物有计划的 环境释放 >
他们都规定对转基因生物 在环境中的释放
必须进行风险评价 ,
经过近 ;< 年的研究 , 对转基因生物的
存活 、定居 、扩散以及基因转移潜力等问题
# 年 ; 月 # < 日收到 >
应 用 生 态 学 报 ∀ 卷
都有了更深入的了解 > 由于微生物具有种
类多 、繁殖快 、分布广 、 易 培养 、代谢能 力
强 、容易发生变异等特点 , 在基因工程上应
用最为广泛 , 因此转基因微生物 的安全性
研究也做得最 多>
转基因生物是 否安全 , 目前国际上还
没有定论 > 但是越来越多的转基 因生物向
环境 中释放 已势在 必行 > 深入研 究转基 因
生物的生态学 , 不仅可以减少转基 因生物
环境释放 中的不确定因素 , 而且 可了解转
基因生物释放后的竟争以及建立种群的必
要 条件 , 帮助转基因生物在环境 中建立种
群 > 因此 , 转基因生物安全性和生态学的研
究对生物技术的应用有重要 的推动作用 >
同时 , 也有助于新兴的分子生态学的发展 >
; 转基因微生物的安全问题
大多数转基因微生物将被设计成在人
类的管理和控制下生存和繁殖 > 但是 , 如果
一种转基因微生物在没有 人的干预下也能
存活 , 或在转基因微生物和非转 基因生物
之 间发生基 因转移 , 那么就可能具有潜 在
的安全问题 >
以下概括地列出几类生物技术需要避
免的意外情况 : 转基因微生物扩散到 释
放区外成为有害生物 转基因微生物通
过杂交或别的途径与其它生物交换遗传物
质 , 出现新的有害生物或增强有害生物 的
危害性 一个假想的例子是 ,病原菌如果获
得 了转基因生物中的抗抗生素的性状 , 就
可能增强竞争力和生理耐受力 , 甚至引起
疾病的流行 ! 对非 目标生物造成危害 如
微生物通过转基因扩大了宿主范围 , 就可
以在侵染 目标害虫时也感染有益的 昆虫
转基因微生物作用不完全 , 产生意外的
负效应 如 用转基 因微生物降解三氯 乙烯
和四氯 乙烯 , 由于降解不完全 , 产生更毒的
乙烯氯化物「’∀ 〕 # 改变生物 群落的结构
如果转基因微生物有很高的适合度和竞争
能力 , 就可能取代其它物种 , 产生复杂的生
态效应 , 如改变营养循环 , 使引入其它 更有
效的生物变得 很难等等 ∃影响生态系统
的能量流动和物质循环 例如 , 如果转基因
根瘤菌能显著提高 固氮能力 , 那么氮很 可
能在土壤中富集起来 过量的土壤含氮量
可能引起新的杂草种群的建立 , 加大硝酸
盐的流失 , 以及提高氮的氧化 物进入大气
的量 % 破坏生物多样性 , 造成生物资源的
不可挽 回的消失 转基因微生物通过竞争
和干扰 使某些野生物种和其它 自然物种
消失 这些 物种的消失很可能代表 了基因
库中基因的消失 人们可以仔细设计转基
因微生物 , 通过选择亲本及其性状 , 选择基
因改变的形式和表达调控方式 , 对 释放环
境的条件作周密的计划和经常的监督 , 尽
量避免出现上述情况 , 使转基 因微生物释
放的风险降到最低限度
& 转基因微生物大田释放风险评价
需要考虑的主要问题
对转基因微生物进行环境风险评价涉
及许多学 科 , 包括 分子生物学 、微生物学 、
遗传学 、细胞生物学 、进化生物学 、生理学 、
种群和群落生态学 以及生态 系统科学 同
时必须考虑许多问题 , 如转基 因微生物的
构建 、存活和繁殖能力 、扩散到释放区外的
潜力 、基 因转移的可能性 、释放规模和频度
的影响 、与其它 生物的相互作用以 及对物
理环境的影响等等
& ∋ 转基因微生物的构建
分子和细胞生物学技术可以精确地改
变基 因 , 这种 能力增 加了科学 家们把握基
因组中不发生意外变化的信心 , 但并不能
保证对这一转基 因微生物的所有生态学特
性都能加 以预 测 对转基因微生物构建的
评价必须包括 任何插入基因组的 ( ) ∗ 序
列 、( ) ∗ 的来源及其目的功能一般说来 ,
# 期 张尚通等 :转基因微生物生态学及大田释放风险评价研究
外源基因来源于无任何亲缘关系的物种比
来源于同一物种的潜在影响要大得 多 _ 如
果转入基因能表达 , 合成新的基因产物 , 它
更可能在生态 系统中起新的作用 > 对于微
生物 , 2 ∋ . 插入的位置也非常重要 , 因为
2 ∋ . 片段插入质粒 比插入染色体更容易
传播和扩散 >
# > ; 基因转移
环境中大多数细菌都能与附近的细菌
交换遗传信息 > 要 考察 2 ∋ . 是否具有潜
在的从转基因微生物向土著细菌转移的风
险 , 必须考虑以下几个因素 : 用分子生物
学技 术测定是否 发生基因转移 + 如果确
实 发生 了基因转移 , 就得考虑新产生的遗
传信息是否能在细菌中保留和表达 + ! 如
果能够保留并表达 , 必须评价对其它生物
区系的影响
质粒能够频繁地转移 , 不宜广泛将这
类转基因微生物应用于环境释放 但是 由
于易于操作 , 具有许多潜在的应 用价值 , 质
粒又常常作为重要的基因工程载体 因此
质粒的转移间题一直是转基因生物安全性
研究的中心问题
质粒 ( ) ∗ 通 过接合转 移的问题 , 在
陆地和水域生态 系统中都有研 究 最 近 ,
,− ./ 01 等川发现 在非灭菌的土壤 中 , 以 含
质粒 23 4 56 慢 生型 大豆根瘤菌 7 召28 办 9
动∋: ; 占−。‘< 尸= > , , ?‘≅ 。 , Α Β Χ ( ∗ ∋:& 为供体 ,
以 多种大豆根瘤菌为受体 , 质粒的接合转
移率高达 Δ ∋ Ε ∋; 一6 该质粒 含有多个抗抗
生素基因 Χ < −Φ 等〔’‘〕也对环境中质粒的接
合转移作了深入的研究 质粒 也可以通 过
转导和转化等机制发生转移
基因转移是制订转基因微生物释放风
险评价计划时必须考虑的重要 因素 目前
发展的一些新技术 , 如 自杀性载体的应用 ,
可以逐渐阻止重组 ( ) ∗ 的转移
比基因转移更重要的是遗传信息的表
达 , 而存活是表达的前提 存活 问题是考虑
转基因微生物效能的中心问题
& & 转基因微生物的适合度
转基 因微生物的适合度 包括它在环境
中的存活能 力 、繁殖能力和竞争能力等等
转基 因微生物释放后如果 要起作 用 , 不管
是 人们期 望的作用还是意外的负作 用 首
先必须能够 存活 环境 中有许多影响存活
的因素 非生物因素中最重要的是营养 、温
度和 ΓΗ 值 + 生物因素主要有原生生物 的
取食 、噬 菌体 的侵染以及与其它 已建立了
牢固生态位的土著菌的竞争 +此外 , 各种酶
和抗生素也会导致释放物种的消失
人们常认为额外基因的加入会降低生
物的存活能力 , 因为这不 仅需 要合成额外
的核酸和蛋 白质 , 新性状的表达也会干扰
正常的生理过程 许多转基因微生物在土
壤中的实验都表明释放后细菌密度总是逐
渐下降〔’Ιϑ 但是 也有例外的情况 ∋Δ Δ∋ 年
在美国路易斯安那观察到〔习带有标记基因
的慢生型大豆根瘤菌在试验结束后仍然存
留在试验区内 , 而且 比土著根瘤菌具有更
强的竞争能 力
转基 因微 生物大 田释 放以后 , 一般都
不希望它代替原有物种 , 或在环境 中长期
存留 但实际上转基因微 生物释放 后是很
难消除 的 少数个体 7低于检测水平 Α仍 然
可 以存 留一 段 时间—一 Κ >0 Λ 10 0Μ Ν称 之为
“可存活 , 但无法培养 ” 7 Ο −8 Π 01 Π Θ Φ . > . 9
Ρ Θ0 ΦΘ 28 Π0 1 Α的状态 9一 然后在环境条件适宜的时候突然萌发
可 见 , 释放 转基 因微生物和 释放化学
物 质有很大差异 , 它的影响并不一定随 着
时间的延续和 离释放点距离的增加而减
小 转基 因微生物的存活状况是风 险评价
的重要内容
& 5 扩散和转运
如果转基因微生物能扩散到释放区以
应 用 生 态 学 报 ∀ 卷
外 , 并且能够存活 , 就大大增加了潜在的危
险性 > 转基因微生物本身的运动能力很弱 ,
但有很多因素能影响转基因生物的扩散 ,
如昆虫 、啮齿类 、鸟类和人的携带 , 灌溉 系
统的转运以及风的影响等等 > 细菌可 以在
空气中存活很长时间 , 因此可以移动到离
释放点很远的地方 , 有的可随气流移动数
百公里 , 由植物组织和土壤颗粒携带的细
菌还可以移动得更远〔’〕> /Ε Χ Η ≅ Ξ 等〔’‘〕发现
活 的丁香 假单胞 菌 9Υ ϑ?6 Η≅ Ι ≅, 。 : ϑ8 ΓΕ , Θ
Α Φ 尸 3密度随着离喷雾点距离的增加呈指数
下降 , 而细菌在 目标植物上的存活率 比在
邻近植物上高 < 倍以上 > 但这方面的研究
还作得很少 >
# > ∀ 释放规模和频度
转基因微生物需要建立持续的种群才
能起作用 > 大多数生物种群都存在一个阂
值 , 当密度低于 闹值时 > 种群就会灭绝 > 因
此 , 释放规模 9包括释放密度和地理范围 3
对转基 因微生物能 否建立 种群有很 大影
响 > 大种群既可 以抵消捕食或其它原因导
致的高死亡率 , 又可 以提供足够的遗传变
异 , 从中可 以选择能够适应新环境的基因
型 > 不同的转基因生物 , 其最低的有效接种
密度差异很大 , 所以对不 同的生物应作具
体的评价 >
释放频度也会影响种群的建立 > 频繁
地释放可以使更多的个体发现适合于繁殖
和建立种群 的环境 , 从而使存活的个体数
达到阑值 > 此外 , 释放的季节 、环境状况和
释放 的方式也有很大的影响 > 转基因微生
物可以通过注射进入植物的木质部 , 也可
以用喷雾或与土壤 混合的方法 释放 > 不同
的初始条件也会影响种群能否建立 >
# > ] 潜在的生态影响
生态系统有两个基 本特征 : 它 们都
有一定的结构 + 这些结构可以产生特定
的功能 结构和功能具有密切的关系 , 改变
其中一个就会影响其它 因此 , 在评价转基
因微生物对生态系统的影响时 , 必 须同时
考虑结构和功能两个方面 如果 引入的转
基因微生物有很高的适合度并能在生态系
统中转移 , 就容易造成土著种群的替换 , 在
微生物中尤其容易发生 由此可能产生复
杂的生态效应 , 如营养循环的改变图
自然的微生物群落中有许多 “多余成
分 ” 7 2 1 Σ Θ . Σ 8 . 1 Τ Α , 即许多物种起相似的生
态作用 因此某些 自‘然物种被替换 , 对整个
生态系统并不会造成太大的影响 但是不
言而喻 , 这些功能等价的物种 的其它生态
特性无疑是存在差异的
转基因微生物对生态系统功能的影响
很难预测 和评价 到 目前 为止还没有观察
到转基因微生物对生态系统功能产生明显
的负作用
对 生态 系统 中哪些环境 参数 需要检
测 , 在特定情况下某一参数的 “正常值 ”该
取多少 , 目前还没有一致的意见 生态系统
中需要检测的环境参数很多 , 包括酶和营
养物的浓 度 、生 产量 Υ呼 吸量 的 比率 以及
ΓΗ 变化等〔’〕, 这方面还有许多工作要做
不 同的转基因微生物有不同的功能影
响 因此 , 参数的选择往往依赖于转基因生
物的构建及其 目的
5 转基因微生物检测及风险评价方法
5 ∋ 检测方法
要对转基因微生物的环境风险进行评
价 , 首 先必须有 可靠 的方法从复 杂的环境
样品 中检测这种生物 环境 中存在大量的
干扰因素 , 如 具有大 量相似特性的土著微
生物 , 众多的物理 因素等等 ‘+而且转基因微
生物在环境中有时密度会降得很低 , 出现
‘可存活 , 而无法培养 ”的情况 , 因此要求检
测方法既 要有较好的特异性 , 又要有较高
的灵敏度 另外 , 还要求准确性高 , 重复性
# 期 张尚通等 :转基因微生物生态学及大田释放风险评价研究
好 , 而且能够广泛应用于取 自不同环境的
样品 > 为了对越来越多的转基因微生物进
行环境风险评价 , 科学 家们还在努力寻 找
能够避开实验室培养造成的偏差 , 可以直
接在环境 中进行原位分析 、效率高而 费用
低的检测方法 >
目前同时具备这些条件的方法尚未找
到 , 至今所用的各种方法各有利弊 >
> > 平板菌落计数法 这是应用较多的
方法 > 利用不同的选择培养基 , 可以具有较
好的特异性 > 它 比直接的观察计数方法要
好得多 > 因使用简单染色或荧光染色进行
直接计数 , 不能把 目标细菌和其它细菌区
分开来 > 它的缺点是必须依赖于细菌在培
养基上的生长 > 不过在许多细菌的检测中 ,
它仍 然是一种廉价而可靠的方法 〔”〕>
> > ; 免疫荧光抗体法 利用有荧光的单
克隆抗体与环境样品中特定的细菌发生免
疫 反应进行直接检测 , 不依赖于在培养基
上的生长 > 这种方法的缺点是无法区分 死
细胞和活细胞 , 而且受环境 中大量物理 因
素的干扰 , 灵敏度较低 >
> > # 核酸序列分析 将从环境样品中分
离的细菌中的重组 2 ∋ . 或核糖体 − ∋ .
提取后进行序列分析 , 具有很高的特异性 >
但这种方法 由于干扰 因素多 , 而且实际操
作困难 , 不宜推广应用 >
> / 2 ∋ . 杂交技 术 这种方 法可以用
基 因探针直接检测环境样 品 , 而且不依赖
于特定基因的表达 , 因此可以检测在培养
基上 无法生长的转基 因微 生物 > 但是环境
中许多基 因都能与探 针杂 交 > Ζ 盯ΕΔ ΨΦ 和
) Φ 78 ? Γϑ 川认为在检测到 目标基 因之 前 , 样
品中至少有 ∀ ⎯以上的 2 ∋ . 已 经与探针
杂交 , 这 就 导 致 灵 敏 度 的 降低 > )Δ ?Β ΒΦ Χ
等〔‘∀」结合 1∃ − 技术进行检测 , 大大提高了
灵敏度 > 它的缺点是昂贵 、复杂 、不 易于推
广普及 > 但 目前许多人仍在深入研究 1∃−
在环境中的应用 [Π> ’# ·“〕, 认为这是很有前途
的检测方法 >
此外 , 还 有许多与上述方法类似的检
测方法 > 针对不同的转基因微生物 , 应该选
择不同的检测方法 , 不能拘泥于某一种 >
> ; 初步风 险评价的可靠方法—微宇宙 9ς Ε? Γ≅ ? ≅ ϑ Ι ϑ 3法
微宇宙方法在 !< 年代 已经应用于化
学物质的风险评价 > 4Ε 7? Δ 和 α ΕΔ 定义微
宇宙为 “可以控制和复制的实验系统 , 它能
模拟真实环境的一部分 ’,[? 〕> 要在小规模 田
间试验之前评价转基因微生物 的存活状
况 、基因转移潜力‘以及生态效应 , 微宇宙法
是基本的评价方法 > 若设计使用适当 , 可以
得到许多其它方法不能得到的数据 , 但对
其结果的解释必须十分小心 > 微宇 宙有许
多优点 : 如体积小 , 可重复 , 实验参数清楚 ,
有真实的物理 、化学和生物相互作用 , 可估
>价生态影响等等 _ 微宇宙的整 个装置都能
灭菌 , 可 以安全地接种小量或 大量的微生
物进行实验 > 此外 , 还可以在微宇宙中方便
地进行其它许多环境参数的研 究 > 用于评
价转基因微生物的释放风险 , 可测定其扩
散 、存活 、定居 、基 因转移能力 及对生态系
统结构和功能的影响 >
微宇宙的不足之处是实验 周期较长 ,
有时需要几周甚至 年 > 不同 的研究人员
使用不同 的微宇宙 , 使实验结果 的可 比性
降低 , 为此 , 美国政府已规定了统一规格的
微宇宙闲 > 微宇 宙的 容积可小至 < Ι 7 , 也
可大至 Λ≅ < / > 在转基因微生物实施大面积
释放之前 , 在 微宇宙中可完成大 多数参数
的风险评价 >
参考文献
Ρ Φ Γ ΓΜ ≅ 6 ϑ ? , > α > , 1 Φ 76 Χ Ε Ω ≅ , . β > = ] > . ϑ ϑ ? ϑ ϑ Θ
Ε一 ΓΜ ? Γ ΓΦ Χ ϑΥ ≅ Γ Γ Φ Χ Η ΒΦ Δ ? ≅ Β Ω Ε≅ ? Χ Α ΕΧ ? ? Γ ? Η Ι ΕΘ
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