全 文 ：油樟 （Cinnamomum longepaniculatum） 是樟科
（Lauraceae）樟属（Cinnamomum）的国家Ⅱ级重点保
护野生植物，油樟资源非常有限 ,主要分布于四川
宜宾。 油樟广泛用于医药、化工、香料、食品和国防
工业 ［1，2］。 同属植物天竺桂 （Cinnamomum japoni－
cum）水提液对细胞悬浮培养次生代谢产物的影响
研究未见报道。 外界因子可诱导细胞悬浮培养中
次生代谢产物的产生或增加， 而这些外界因子主
要是人工添加的化学诱导剂，如磷酸盐、水杨酸、
苯丙氨酸、酪氨酸、D-果糖、甘露醇和硫酸镧等 ［1～3］。
植物天然提取物， 特别是同属植物的提取物作为
诱导剂诱导悬浮细胞次生代谢产物的积累的研究
未见报导。黄酮类物质有多重生物学功能 ［4，5］。本文
拟采用天竺桂水提液作为诱导剂添加到油樟叶悬
浮培养系中，测定黄酮类物质积累的情况，为进一
步的黄酮类物质诱导剂的研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料 天竺桂叶片采集于宜宾学院校
园内。 油樟悬浮培养体系由宜宾学院发酵资源与
应用四川省高校重点实验室提供。
1.2 试验方法
1.2.1 天竺桂水提液的制备 叶片经清洗 、拭
擦 、去除经脉 、粉碎后 ，称取天竺桂叶粉末 50 g，
放入盛有 300 mL 的蒸馏水中， 用玻璃棒进行搅
拌 15 min，纱布过滤 3 次，得水提液。 向水提液中
加石油醚 250 mL 搅拌后， 倒入 1000 mL 分液漏
斗中静止 24 h。 收集下层相，得水提液 250 mL 放
4℃保存备用。 所得水提液的浓度相当于 200 mg
（天竺桂叶重）/mL。
1.2.2 培养基的制备及接种 在液体培养基
B5+6-BA2 mg/L（以下单位同）+NAA0.5 中分别加入
15 mL （T1）、30 mL （T2）、45 mL （T3）、60 mL （T4）
提取液，使提取液在培养基中的浓度为 3 g （天竺
桂叶重）/L、6 g/L、9 g/L、12 g/L。 准确称取愈伤组
织 2 g，接入培养基中，24℃，115 r/min，悬浮培养。
45 d 后收集愈伤组织。60℃烘干至恒重。以不加天
竺桂提取液为对照（C）。
1.2.3 黄酮类物质的定性检测 根据颜色反
应 ［6，7］鉴定黄酮物质。 盐酸—镁粉反应：在样品的
乙醇溶液中加入少许 Mg 粉振摇， 再滴加 3 滴浓
盐酸 ，水浴加热 5 min，观察溶液颜色变化 ；铅盐
反应：将 1％的乙酸铅加入样品的乙醇溶液中，即
可生成黄至红色沉淀。
1.2.4 黄酮类物质的定量检测
1.2.4.1 标准曲线的制作 标准曲线的制备：精
密称取干燥至恒重的芦丁，配制成 2 mg /mL 的乙
醇液，取 10 mL 水稀释到 100 mL。 吸取 0.00 mL，
1.00 mL，2.00 mL，3.00 mL，4.00 mL，5.00 mL，
6.00 mL 分别置于 25 mL 容量瓶中,各加水至 6 mL，
加 5％亚硝酸钠溶液 1 mL，混匀 ，放置 6 min，加
天竺桂水提液对油樟悬浮细胞黄酮类积累的影响*
王 平 1 张 萍 2** 侯 茂 2 魏 琴 2，3*** 扬 扬 3
（1 四川省简阳中学 四川简阳 641400
2 宜宾学院生命科学与食品工程学院西南特色经济植物保护与利用重点实验室 四川宜宾 644000
3 发酵资源与应用四川省高校重点实验室 四川宜宾 644000）
摘要 将天竺桂水提液作为诱导剂添加于油樟叶悬浮培养系中， 测定其黄酮类物质积累
的影响。 结果表明，天竺桂水提液可促进油樟叶悬浮细胞黄酮类物质积累，在 3~12 g（叶鲜重）/L
浓度范围内，6 g/L 浓度下积累黄酮类物质最多。 这为同属植物天竺桂水提液中可能存在黄酮
类物质的诱导剂的探讨奠定基础。
关键词 天竺桂 油樟 细胞悬浮培养 黄酮类物质
中国图书分类号：Q813.1+1 文献标识码：B
*基金项目：四川省教育厅重点项目 （08ZA002），四川省科技厅（2010JY0093），四川省青年科技创新研究团队 （2011JTD0035）
**与第一作者同等贡献
***通讯作者
2012年 第 47 卷 第 10 期 生 物 学 通 报 39
C T1 T2 T3 T4
OD 0.0002 0.022 0.0421 0.0370 0.0312
黄酮含量% 0.071% 0.78% 1.50% 1.32% 1.11%
1％硝酸铝溶液 1 mL，混匀，放置 6 min，加 4%氢
氧化钠试液 10 mL，再加水至刻度，摇匀，放置 15
min，在 510 nm 测吸光度，绘制吸收度——浓度标
准曲线 ［8，9］，由 Origin 7.0 软件得出回归方程。
1.2.4.2 供试品溶液的制备 参照陈长东、赵小
妹等 ［10，11］方法进行。 各称取 2 g 细胞 （干重 ），研
细 ，过 100 目筛 ，加入 95％乙醇 30 mL，40℃超声
波水浴 30 min，过滤 ，85℃水浴回流 1 h，定容至
30 mL，用于检测黄酮类物质。 以不加水提液的愈
伤组织为对照。
1.2.4.3 样品含量的测定 吸取各乙醇萃取液
3 mL 置于 25 mL 容量瓶中，按照 1. 2.4.1 的方法
测吸光度（y）。对应标准曲线求得浓度（x）。样品含
量的计算方法：
黄酮含量%= X×25
每毫升萃取液含干细胞的重量
×100％
2 实验结果及分析
2.1 颜色反应结果
盐酸-镁粉反应：反应后溶液成粉红色。
铅盐反应：溶液出现浑浊，静置后，观察试管
底部出现淡黄色沉淀。
由这 2 种颜色反应结果可以证明该提取物中
含有黄酮物质。
2.2 标准曲线
吸收度——浓度标准曲线，见下图，得回归方
程为：
Y=8.79121X R2=99.74%
注：X：黄酮的浓度（mg/mL）Y：吸光度（OD 值）
芦丁黄酮浓度标准曲线图
2.3 含量测定结果 测得 C、T1、T2、T3、T4 各样
品的吸光值 （y）分别为 0.0002、0.022、0.0421、
0.0370、0.0312，由回归方程计算 x，由 1.2.4.3 的公
式计算出愈伤组织干细胞中黄酮的含量见下表。
黄酮类质量百分比
由此可见，在不加入天竺桂提取液的情况下，
其黄酮含量很少（0.071%）。 在 0~6 g/L 的天竺桂
提取液浓度范围内， 黄酮的积累随天竺桂提取液
添加量的增加而增加，6 g/L 的天竺桂提取液后其
黄酮含量最高 （1.50%），随后黄酮的积累随天竺
桂提取液添加量的增加而减少。
前人的研究表明 ［12，13］，在培养体系中加入次
生代谢产物的诱导剂有助于次生代谢产物的积
累。本实验结果表明，天竺桂水提液促进油樟叶悬
浮培养细胞的积累。 这与天竺桂水提液中可能存
在黄酮类物质诱导因子有关。 天竺桂与油樟为同
属植物， 特别是是否存在黄酮类物质的前体物质
或其他诱导因子有待进一步研究。
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王 平：wp66617@163.com）
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