全 文 ：DPPH法测定金丝梅体外抗氧化活性＊
段静雨 1 ,李岩 1 ,王健慧 1 ,杨佳 2 ,陆文虎 2 ,余纯旺 3 ,纪传宝 3
(1.徐州医学院药学院中药学教研室 , 江苏 徐州 221004;2.徐州医学院药学专业 2005级;
3.徐州医学院药学专业 2006级)
　　摘要:目的　研究金丝梅(HypericumpatalumThunb.)体外抗氧化作用。方法　以槲皮素为对照 ,采用 DPPH
法测定金丝梅总提物 、氯仿(F2)、乙酸乙酯(F3)和水(F4)部位抗氧化活性。结果　金丝梅总提物 、F2、F3、F4均
有清除 DPPH自由基的能力 , 在低浓度和高浓度时 , F3清除率最高 , F4清除率最低;其中在低浓度时 F3的清除率
高于槲皮素的清除率。结论　金丝梅总提物 、F2、F3、F4的抗氧化结果为进一步研究其抗氧化活性成分及开发利
用本植物提供科学依据。
关键词:金丝梅提取物;DPPH;抗氧化
中图分类号:R285　　文献标志码:A　　文章编号:1000-2065(2009)09-0618-03
DeterminationoftheantioxidantcapacityofHypericumpatalumThunb.
withDPPHassayinvitro
DUANJingyu1 , LIYan1 , WANGJianhui1 , YANGJia2 , LUWenhu2 , YUChunwang3 , JIChuanbao3
(1.DepartmentofTraditionalChineseDrugs, SchoolofPharmacy, XuzhouMedicalColege, Xuzhou, Jiangsu221004, China;
2.PharmacyClassofGrade2005, SchoolofPharmacy, XuzhouMedicalColege;
3.PharmacyClassofGrade2006, SchoolofPharmacy, XuzhouMedicalCollege)
　　Abstract:Objective　ToinvestigatetheantioxidanteffectinvitroofHypericumpatalumThunb.Methods　An-
tioxidantcapacityofthetotalextractsofHypericumpatalumThunb., chloroformfraction(F2), aceticetherfraction
(F3)andwaterfraction(F4)weredeterminedusingtheDPPHassayinvitro.Results　AllthetotalextractsofHyperi-
cumpatalumThunb., F2, F3 andF4 showedantioxidantcapacityofeliminatingDPPHfreeradicals.Atlowandhigh
concentrations, F3 showedhighestclearancerate, whileF4 hadthelowestclearancerate.F3hadahigherclearancerate
thanquercetinatthelowconcentration.Conclusion　TheresultsoftheantioxidantefectofthetotalextractsofHyperi-
cumpatalumThunb., F2, F3 andF4provideascientificbasistotheresearchofactiveconstituentdandtheexploitation
ofHypericumpatalumThunb.
Keywords:HypericumpatalumThunb.;DPPH;antioxidantcapacity
　　金丝梅为藤黄科金丝桃属(HypericumLinn.)
植物 ,又名芒种花 、金丝桃 、云南连翘 、黄花香 、栽秧
花等 ,主要分布于我国西南部 、中部和台湾地区 ,具
有清热解毒 、利尿 、行瘀之功效 ,在我国西南部民间
常用于治疗肝炎 、感冒 、痢疾 、筋骨疼痛 、跌打损伤
等 [ 1] 。对于金丝梅的研究 ,国内外文献报道主要集
中于组织培养的化学成分及生物活性的研究 [ 2 -4] ,
也有报道其总提物具有细胞毒作用及抗菌作
用 [ 5-6] ,而对金丝梅植物地上部分抗氧化 、清除自由
基方面未见报道 。本研究采用 DPPH法对金丝梅总
提物及不同极性部位进行抗氧化能力的测定 ,了解
其抗氧化活性成分在不同极性部位的分布 ,为进一
步研究其抗氧化活性成分及本植物的开发利用奠定
科学基础 。
1　材料和方法
1.1　原料　金丝梅购自江苏沭阳 ,经徐州医学院药
学院中药学教研室王健慧副教授鉴定为藤黄科金丝
桃属金丝梅(HypericumpatalumThunb.)。
1.2　试剂及仪器　DPPH(1, 1 -Dipheyl-2-pic-
rylhydrazylradicle, 1, 1-二苯基 -2-苦基苯肼自由
基)日本和光纯药工业株式会社;槲皮素(中国药品
·618· 徐州医学院学报　ACTA　ACADEMIAE　MEDICINAE　XUZHOU　2009, 29(9)
＊ 基金项目:徐州医学院课题(07KJ05)
生物制品检定所 ,批号:100081-200406);其他试剂
均为分析纯 ,由汕头西陇化工厂有限公司生产 。旋
转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂), 2450型紫外可见
分光光度计(日本岛津公司), FA1004型电子天平
(上海精密科学仪器有限公司),真空干燥箱(巩义
市英峪仪器厂),超声波清洗器(昆山市超声仪器有
限公司)。
1.3　金丝梅提取物及各化学部位的制备　金丝梅
地上部分粗粉 6.5 kg,依次用 90%、70%乙醇渗漉
提取两次 ,合并两次提取液减压浓缩成不含醇味的流
浸膏得总提物 ,总提取物重 607.9 g。按极性由小到
大的顺序依次用石油醚 、氯仿 、乙酸乙酯进行萃取 ,分
别回收溶剂得石油醚(F1)、氯仿(F2)、乙酸乙酯(F3)
和水(F4)4个化学部位 。取适量总提物及各化学部
位置于蒸发皿中 ,于真空干燥箱中减压干燥得干粉。
选择总提物 、F2、F3和 F4作为实验用样品 。
1.4　试液的配制
1.4.1　DPPH溶液的配制 　精密称取 DPPH
0.019 7g,加无水乙醇溶解 ,定容至 50 ml,作为储
备液 。精密移取上述储备液 10ml至 100ml容量瓶
中 ,定容得 100 μmol/L的 DPPH溶液 ,备用。
1.4.2　对照品溶液的配制 　精密称取槲皮素
0.006 6g加无水乙醇溶解 ,定容至 25 ml,作为对照
品溶液 ,备用 。
1.4.3　样品溶液配制　分别精密称取总提物 、F2、
F3和 F4样品 0.006 6 g,用无水乙醇溶解 ,定容至
25 ml,作为样品溶液 ,备用 。
1.5　金丝梅提取物清除 DPPH自由基能力的测定
1.5.1　最大吸收波长的确定　每个 DPPH分子在
溶液中可生成一个稳定的含氮自由基 ,具有典型紫
色 ,当它与提供 1个电子的自由基清除剂作用时 ,生
成无色产物 ,使溶液的典型紫色变浅 。观察 DPPH
溶液在 280 ～ 700 nm波长区间的扫描光谱 , 发现
DPPH在 327 nm和 515 nm处都有强吸收峰 ,加入
槲皮素和 F3样品后 ,这 2个峰值都有降低 ,而 515
nm处的峰值降低较显著 ,如图 1所示 ,因此选取
515nm作为测定波长 ,以提高测定灵敏度 。
1.5.2　DPPH溶液稳定性能及反应时间的确定　
不同的抗氧化剂对自由基的清除速率和清除效果是
不相同的 ,通过测定 515 nm处溶液光密度(D)的变
化可以动态监测其对 DPPH的清除作用情况 ,为了
确定金丝梅总提物 、F2、F3、F4和槲皮素对 DPPH的
清除速率和反应时间 ,分别在 2.9 ml的 DPPH乙醇
溶液中加入 20μl上述溶液和 80μl无水乙醇 ,混合
均匀 ,每隔 2min测定 D值 ,直到 D值基本稳定。各
溶液 D值随时间的变化规律如图 2所示 。
图 1　DPPH的吸收光谱曲线
图 2　DPPH的光密度随时间的变化曲线
　　在加入抗氧化剂的开始几分钟内 ,光密度下降
比较快 ,随着时间的增加 ,光密度的下降趋势逐渐趋
于平缓 , 40min后反应达到基本稳定 。因此选择与
DPPH反应 40 min后测定 D值。
1.5.3　在固定反应时间 DPPH自由基清除率的测
定　测定方法主要参考文献 [ 7-9 ]进行 ,分别在 2.9
ml的 DPPH乙醇溶液中加入 20μl的总提物 、F2、F3、
F4、对照品溶液和 80μl无水乙醇 ,混合均匀 ,反应 40
min后测定低浓度的样品和对照品溶液在 515 nm处
的光密度值 ,平行测定 3次;同样 ,在 2.9ml的 DPPH
乙醇溶液中加入 100μl的上述溶液 ,混合均匀 ,反应
40min后测定高浓度的样品和对照品溶液在 515 nm
处的光密度值 ,平行测定 3次;光密度值记为 D1。同
时分别测定 2.9 ml的 DPPH乙醇溶液中加入 100 μl
无水乙醇的光密度值 D0和 2.9 ml无水乙醇中加入
不同浓度的样品溶液的光密度值 D2。 DPPH清除率
(%)=〔1-(D1 -D2)/D0〕×100%。
2　结　果
2.1　金丝梅提取物清除 DPPH自由基能力　见表 1。
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表 1　金丝梅提取物清除 DPPH自由基能力
种类 DPPH自由基清除率(%)低浓度(1.76 mg/L) 高浓度(8.8 mg/L)
总提物 6.48±1.25 17.53±1.05
F2 5.42±1.32 19.12±0.98
F3 36.49±2.73 62.65±3.56
F4 3.34±0.85 5.68±0.84
槲皮素 31.77±1.98 90.34±5.37
　　从表 1可以看出 ,总提物 、F2、F3、F4和槲皮素
在低浓度和高浓度时 ,均有清除 DPPH自由基的能
力 ,随着浓度的增加 ,清除率增大 。在低浓度时 ,清
除率由高到低顺序为 F3>槲皮素 >总提物 >F2>
F4;在高浓度时 ,清除率由高到低顺序为槲皮素 >
F3>F2>总提物 >F4。其中 F3的清除率在低浓度
时高于槲皮素的清除率 , F4在低浓度和高浓度时清
除率均最低 。
3　讨　论
　　自由基又称游离基 ,在调节细胞的许多生理功
能中起重要作用 ,并且与某些疾病的发生有密切关
系 。许多生理功能受氧化还原反应的信号途径调
控 ,自由基在其中起着信号转导作用 [ 1] 。生物体内
有来源于氧的自由基(ROS)超氧阴离子(O-2 · )、
羟自由基 (· OH)、单线态氧 (1O2 )、过氧化氢
(H2O2)和来源于氮的自由基 (RNS)一氧化氮
(NO)。当氧自由基产生过多或清除能力下降可引
起多种疾病的发生 ,如肿瘤 、糖尿病 、动脉粥样硬化 、
神经退行性疾病 、类风湿性关节炎 、人类免疫缺陷病
毒(HIV)感染 、缺血和再灌注损伤等 [ 10] 。因此 ,预
防或减少体内的氧自由基损伤 ,从而减少疾病的发
生是人们一直期待解决的问题 。
　　金丝梅为藤黄科金丝桃属植物 ,据报道金丝桃
属植物所含主要化学成分为双蒽酮衍生物 、黄烷酮
醇类 、黄酮及黄酮醇类 、口山酮类 、香豆素类 、酚酸
类 、间苯三酚衍生物 、挥发油类 、正烷烃 、正烷醇 、植
物甾醇等[ 11-12] 。黄酮类化合物具有良好的抗氧化
作用 ,已多见报道 [ 13-16] 。根据植物的亲缘关系 ,同
科同属植物往往含有相同骨架类型或相同的化合
物 ,显然从金丝梅中发现具有抗氧化活性的化合物
具有潜在的前景 。
　　槲皮素为黄酮类化合物 ,具有明显的抗氧化活
性 。本研究以槲皮素为对照 ,对金丝梅的总提物 、
F2、F3和 F4部位进行了体外抗氧化活性研究 ,在低
浓度和高浓度时 ,总提物 、F2、F3和 F4均有对 DP-
PH自由基的清除能力 ,其中 F3的清除率最高 , F3
的清除率在低浓度时甚至高于槲皮素。显然 ,总提
物在经过不同极性溶剂萃取后 ,其化学成分依其极
性不同被萃取到相应的溶剂中 ,其中抗氧化活性成
分主要集中在 F3部位 。
本研究结果将为金丝梅抗氧化活性成分的下一
步研究提供科学依据 ,为进一步开发利用本植物奠
定实验基础。
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收稿日期:2009-05-26　修回日期:2009-06-25
本文编辑:王卿
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