全 文 ：文章编号:1008-9926(2006)05-0353-04　　中图分类号:R969.4;R967　　　文献标识码:A
过山枫乙醇提取物抗类风湿关节炎疗效观察及免疫机制探讨①
朱传武② ,赵志玲③ ,佟　丽 ,彭　康
(②南方医科大学中医药学院　广东　广州　510515;③中国人民解放军广州军区联勤部　广东　广州　510507)
摘　要:目的　通过观察过山枫乙醇提取物对大鼠胶原诱导性关节炎模型的作用 , 探讨过山枫治疗类风湿性关节炎的疗效和
免疫作用机制。方法　制作类风湿性关节炎大鼠模型 ,观察药物对其炎症 、免疫系统等方面影响。结果　醇提大剂量组淋巴
细胞增殖作用显著高于模型组 。关节软骨内 MMP-3、TIMP-1和 MMP-3/TIMP-1模型组与正常组之间存在显著性差异。结论
　过山枫乙醇提取物具有抗炎 、调节免疫的药理作用。
关键词:过山枫;类风湿性关节炎;疗效;免疫机制
TheCurativeEfectsandImmuneMechanismonRAwithGSF①
ZHUChuan-Wu② , ZHAOZhi-Ling③ , TONGLi, PENGKang
(②TheTCMDepartmentoftheSouthernMedicineUniversity, Guangzhou　510515, Guangdong　China)
(③HealthDepartmentofJointServicesofGuangzhouMilitaryCommand, Guangzhou　510507, Guangdong　China)
Abstracts:AimToexploretheanti-rheumatoidarthritisefectandimmunemechanismofGSFethanolextract.by
observetheefectofGSFethanolextractonthecolagen-inducedarthritismodelinrats.MethodsFirstacolagen-
inducedarthritismodelwasinrats, andcreatedthentheimmunesystemofthemodelratswasobservedafterGSF
ethanolextracttreatment.ResultsTheratioofratslymphocyteproliferationintheGSFethanolextracthighdose
groupwashigherthanatofthecontrolgroup.ThecontentofMMP-3, TIMP-1 andMMP-3 /TIMP-1 intheratsar-
ticularcartilageoftheGSFethanolextracthighdosegroupwaslowerthanthoseofthecontrolgroup.Conclusions
GSFethanolextracthasthesignificantanti-inflammatoryefectwhilebeingabletobeingadjusttotheimmunesys-
tem.
KEYWORDS:GSF;RA;CurativeEfects;ImmuneMechanism
　　类风湿关节炎 (RheumatoidArthritisRA)是自
身免疫性疾病 ,严重影响患者生活质量。目前抗类
风湿关节炎药物种类较多 。各类药物通过不同的机
制来发挥药效 ,但有的作用不明显 ,有的毒性和副作
用较大 。
国内外的医疗和科研工作者都在寻找疗效确
切 、毒副作用小的新药 。我国的传统医药在 RA的
治疗方面有着悠久的历史 , 过山枫 (Celastrus
aculeatusMerr)是南蛇藤属植物 ,文献记载过山枫味
苦 、辛 ,性凉 。功效清热解毒 、活血止痛 、祛风利湿 。
民间长期用来治疗风湿痹痛等 [ 1] 。关于其药理作
用研究和化学成分研究目前国内外仍未见报道 。本
研究选择其乙醇提取物作为研究对象 ,通过干预类
风湿关节炎疾病动物模型 ,对其抗类风湿关节炎机
理展开初步探讨 ,并对其安全性进行实验研究 ,为过
山枫的药物开发奠定初步基础。
1　材料和方法
1.1　动物和分组　动物:清洁级 Wistar大鼠 , ♀,
130 ～ 170g(第一军医大学实验动物中心 。动物合格
证号为:2002-009)。实验前置动物于实验室内适应
环境 3d,室温 18 ～ 20℃,相对湿度 65%。随机将动
物分为 7组 ,每组 7只:正常组 ,正常喂养;模型组 ,
制作 II型胶原诱导的大鼠关节炎模型 。雷公藤总
苷组 , 大鼠关节炎模型制作后给予雷公藤总苷
20mg/日。 GSF醇提物大 、中 、小剂量组 ,大鼠关节
·353·　解放军药学学报　第 22卷第 5期　　过山枫乙醇提取物抗类风湿关节炎疗效观察及免疫机制探讨　　朱传武　　
①
②
基金项目:NIH补充替代医学基金 , No.5f05002013
作者简介:朱传武(1974-),男 ,安徽合肥人 ,硕士 ,讲师 ,主治医师。研究方向:中药药理。 Tel:(020)61648256;E-mail:zhu9297@fim-
mu.com
　　通讯作者:佟　丽(1956-),女 ,黑龙江哈尔滨人 ,研究员。研究方向:中药药理研究。 Tel:(020)61648549;E-mail:tli 88@gahoo.com
炎模型制作后给予大(42g生药 /kg)、中(28g生药 /
kg)、小(14g生药 /kg)剂量过山枫乙醇提取物。
1.2　试剂与仪器　R系列旋转蒸发仪(上海申生科
技有限公司), TC-15套式恒温器(浙江新华医疗器械
厂), DZF-605型真空干燥箱(上海精宏实验设备有限
公司),过山枫粗粉 9 000g按照醇提程序进行 ,共得
895g提取物粉末 , 1g提取物粉末相当于 10.06g原药
粉 ,小牛 I型胶原(自制), CTA(Sigma公司), GSF醇提
液(1g·ml-1),雷公滕多苷片(湖南珠州市制药厂 ,批
号 2003113),兔抗大鼠 MMP-3单克隆抗体 、生物素化
山羊抗兔 IgG、免疫组化 SABC试剂盒(均为武汉博士
德公司), AlcianBlue染料(Sigma公司)。
1.3　类风湿关节炎模型制备　I型胶原诱导的大
鼠关节炎模型:酸溶性 I型胶原 50ml溶于 0.1mol,
25ml醋酸溶液中 , 4℃过夜然后于冰浴下滴加等体
积完全弗氏佐剂(CTA)研磨均匀制成乳剂使胶原含
量为 1mg· ml-1 ,在大鼠尾根部 、背部及颈部皮内分
别注射 0.1、0.2、0.2ml胶原乳(0.5ml/只),注射前
用乙醇局部消毒 。第 14d以 100μl/只的含胶原 1mg
· ml-1的 CTA再次免疫大鼠。以大鼠后足出现红
肿为起病时间 ,各组随机抽取大鼠考察各项指标包
括检查体征表现 、局部关节组织病理学检查 、免疫学
检查 、血液学检查 、影象学检查 。
1.4　过山枫乙醇提取物对炎症积分的影响　方法:
实验大鼠经过 2次小牛 I型胶原免疫后 ,分别观察
足趾肿胀情况 ,按有关要求分级标准 ,记录分数 ,隔
天记录 1次 ,直到实验结束前 1d,采用每只大鼠积
分相加方法 。由于正常组无炎症 ,因此不需正常组
炎症积分数据比较。
1.5　GSF对免疫性关节炎模型大鼠淋巴细胞增殖
的影响　方法:大鼠造模 ,给药同前 ,实验结束后 ,取
模型组皮下淋巴结 ,制备淋巴细胞总液 ,置于 96孔
培养板中 ,同时加入药物血清 , 72h后 ,用 MTT比色
法测定细胞增殖的作用。
1.6　GSF对免疫性关节炎模型大鼠关节软骨内
MMP-3和 TIMP-1的表达影响　方法:切片经 HE染
色 、免疫组化染色和 AB染色后 ,进行组织学观察 。
通过与计算机相连的显微摄影系统采集图像 ,利用
Tiger920软件进行图像分析 , 半定量测定 TIMP-1、
MMP-3的积分光密度(IOD)。治疗时间为 5周 。
2　结果
2.1　过山枫乙醇提取物对炎症积分的影响　第 3d
开始 ,治疗组与模型组比较有显著性差异(P<0.05,
P<0.01),说明 GSF有显著抑制 II型胶原诱发的免
疫性关节炎的炎症作用 ,其大剂量组作用非常显著 ,
其延长发病时间与其它 3药物组比较有显著性差异
(P<0.01),提示 GSF抗炎作用主要成份在醇提取
物成份中 ,见表 1。
表 1　炎症积分记录( x±s, n=7)
Tab1　Inflammationintegral( x±s, n=7)
天
数 模型组 雷公藤组
过山枫
大剂量 中剂量 小剂量
1 0.64 ±1.0 0.50±0.8 0.21±0.4 0.28 ±0.5 0.38 ±0.8
3 1.93 ±2.3 0.93±1.1 0.14±0.5c 0.32±0.7b 0.46 ±0.9b
5 3.71 ±2.4 1.50±1.9b 0.14±0.4c 0.59±0.9b 0.85 ±1.5b
7 5.71 ±3.4 2.57±2.9b 0.21±0.8c 1.27±1.0b 1.85 ±2.4b
9 7.14 ±3.6 4.07±3.5b 0.28±0.8c 2.39±1.4b 3.08 ±2.7b
11 7.28 ±3.6 4.28±3.6b 0.78±1.6c 2.47±1.6b 3.46 ±2.7b
13 7.71 ±3.5 4.07±3.6b 0.86±1.9c 2.68±2.0b 3.15 ±2.6b
15 7.78 ±3.0 4.14±3.7b 0.71±1.5c 2.81±2.5b 3.46 ±2.7b
18 7.78 ±3.0 4.36±3.7b 1.00±2.3c 3.23±2.6b 4.69 ±3.3b
21 7.78 ±3.0 4.21±3.7b 0.93±2.3c 3.35±2.8b 4.46 ±3.3b
23 7.71 ±2.9 4.50±3.4b 0.99±2.3c 3.48±3.0b 4.69 ±3.3b
　　注:与模型组比较 , bP<0.05, cP<0.01
2.2　GSF对免疫性关节炎模型大鼠淋巴细胞增殖
的影响　过山枫大剂量组淋巴细胞增殖作用显著高
于模型组(P<0.05),结果见表 2。
表 2　淋巴细胞增殖( x±s, n=7)
Tab2　Proliferationoflymphocyte( x±s, n=7)
组别 例数 淋巴
模型组 7 5.28 ±1.96
雷公藤组 5 7.74 ±3.79
过山枫大剂量 5 14.1 ±1.83b
　　　中剂量 7 9.34 ±2.21
　　　小剂量 4 4.75 ±1.92
　　注:与模型组比较 , bP<0.05
2.3　GSF对模型大鼠关节软骨内 MMP-3和 TIMP-1
的表达影响　模型组与正常组之间 , MMP-3、TIMP-1、
MMP-3/TIMP-1表达量存在显著性差异(P<0.05);
GSF可以显著抑制关节软骨内 MMP-3、TIMP-1和
MMP-3 /TIMP-1的表达 ,结果见 3。
表 3　关节软骨内 MMP-3和TIMP-1的表达
Tab3　ExpressionofMMP-3 andTIMP-1 inarticularcartilage
项目 正常组治疗前 治疗后
模型组
治疗前 治疗后
TIMP-1 17.13±2.39 17.08±2.33 27.64±2.48b18.06 ±2.30b
MMP-3 19.40±2.92 19.12±2.89 80.70±3.00b19.35±2.84bf
MMP-3/
TIMP-1 1.160±0.2931.191±0.2872.942±0.316b1.073 ±0.342b
　　注:与正常组比较 , bP<0.05;与模型组治疗前比较 , fP<0.05
·354· 　解放军药学学报　2006年 10月　第 22卷　第 5期　　　PharmJChinPLA　Vol22　 No5　Oct2006　　　　　
3　讨论
3.1　类风湿关节炎是一自身免疫性疾病 ,是以对称
性关节炎为主要临床表现的慢性 、异质性 、进行性侵
袭性疾病。研究表明类风湿性关节炎发病机制与感
染 、遗传 、内分泌等因素有关 ,众多细胞因子参与其
发病。主要病理改变为关节滑膜及周围结缔组织异
常增生 、关节软骨进行性破坏为主的慢性自身免疫
性疾病 。MMP-TIMP在组织塑型 ,细胞外基质逆转 、
伤口修复过程中起重要作用 ,是近年来 RA研究中
的热点之一 。
3.2　1987年 OkadaY研究发现 , RA患者的关节液
中 MMP-1、MMP-2、MMP-3显著增高 ,对关节的结构
有明显破坏作用[ 2] 。早期 RA血清中 MMP-1和
MMP-2的表达水平与疾病的活动性和预期的功能
损害及 X线表现呈正相关[ 3] 。通过对 307例临床
患者研究发现 ,患者关节液中 MMP-3浓度显著增
高 ,可以作为 RA的早期诊断和治疗观察指标之一 ,
尤其在血清阴性患者中适合 [ 4] 。动物实验发现 ,在
患关节炎的狗的关节腔滑液中 MMP-3的浓度显著
增高 ,可以作为狗类风湿性关节炎的诊断标志 [ 5] 。
基因研究发现 , MMP-3的基因多态性与 RA的严重
性相关 ,而不是与 RA的是否发生相关 ,研究这种多
态性有助于早期预见 RA的严重程度[ 6] 。 MMP-
TIMP与 RA的治疗也有密切关系 ,研究发现 ,抑制
RA患者 MMP-3的表达 ,可以有效保护 RA患者的
骨关节破坏 。在 RA患者中 , MMP-1和 MMP-3的表
达与巨噬细胞聚集和渗透相关 ,抑制 MMP-1表达可
以显著减少巨噬细胞聚集 ,减轻炎症症状 [ 7] 。异唑
类衍生物来氟米特(Leflunomide)是一种新型抗炎
及免疫调节剂 ,对类风湿治疗作用的机理之一是通
过抑制 MMP-3。
3.3　我国的传统医药在 RA的治疗方面有着悠久
的历史 , RA属中医学 “痹证 ”范畴。中医认为其发
生的原因为外感风寒湿热之邪 ,而内气血亏虚肝肾
不足 ,二者导致外邪凝滞经络肌肤 ,气血运行不畅 。
故应祛风 、散寒 、除湿 、活血通络来宣痹通络。
过山枫是我国民间久用的一种植物药 ,祖国医
学最早记录过山枫的文献见于 《植物名实图考》蔓
草类。过山枫性温 、味辛 、有小毒 ,归肝 、膀胱经 ,功
能是驱风除湿 ,活血止痛 ,消肿解毒。主治筋骨疼
痛 、四肢麻木 、腰腿痛 、闭经 、小儿惊风 、痧症 、痢疾肿
毒 、跌打损伤等。研究发现过山枫中主要成分有萜
类 、黄酮类 、醇类等。民间常用该药煎汤或外敷来治
疗风湿痹痛。该药的汤剂和酊剂已经在临床应用多
年治疗类风湿关节炎 (RheumatoidArthritis)并取得
良好疗效 。过山枫的抗炎镇痛及免疫调节作用可能
是其治疗 RA药用功效的重要基础。基于上述原
因 ,我们对过山枫的临床效果 、免疫机制进行了系列
研究 。
临床效果方面 ,本研究通过比较过山枫素和雷
公藤甲素(雷公藤内酯醇)对 PHA诱导的人外周单
核淋巴细胞增殖实验的影响 ,发现在它们各自的最
适浓度下 ,雷公藤甲素的抑制活性略高于过山枫素
且均无细胞毒作用 ,但是在两倍于最适浓度的剂量
下 ,雷公藤甲素的细胞毒性远高于过山枫素。我们
的前期实验结果显示过山枫的 LD50要高于雷公藤
多苷片 ,在佐剂致大鼠足趾肿胀实验中 ,过山枫醇提
高剂量组具有明显的抗炎消肿作用 ,与以雷公藤多
苷片为阳性药的对照组比较其干预结果有显著性差
异。在毛细血管通透性实验中 ,醇提高剂量组与以
阿斯匹林为阳性药的对照组也有显著性差异 ,在棉
球肉芽肿实验中 ,过山枫醇提高剂量组与阳性对照
组虽无显著性差异但均有明显抗炎作用 。这些都提
示过山枫有确切的抗炎作用 ,与文献记载一致。
免疫调节作用方面已证实 ,过山枫乙醇提取物
可逆抑制多种有丝分裂原及混合淋巴细胞反应引起
的淋巴细胞增生 ,同时能使淋巴细胞移动减慢 、诱导
人 T淋巴细胞株 CEM-6T细胞凋亡。本实验结果表
明 ,大剂量组淋巴细胞增殖作用显著高于模型组。
由于 MMP-3、TIMP-1和 MMP-3/TIMP-1与类风湿性
关节炎关节畸形关系密切 ,本实验研究发现 ,过山枫
乙醇提取物可以显著抑制关节软骨内 MMP-3、
TIMP-1和 MMP-3 /TIMP-1的表达 ,从而保护关节软
骨 ,改善类风湿的关节变化 ,减少畸形发生。
综上所述 ,过山枫乙醇提取物具有抗炎 、调节免
疫的药理作用;对类风湿性关节炎有明确的治疗作
用。对于其治疗类风湿性关节炎的作用机制 ,值得
深入研究 。
参考文献:
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and3 fromrheumatoidsynovialcelsaresuficienttodestroyjoints
[ J] .JRheumatol, 1987, 14:41
[ 3] 　GreenMJ, GoughAK, DevlinJ, etal.SerumMMP-3 andMMP-1
andprogressionofjointdamageinearlyrheumatoidarthritis[ J].
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·355·　解放军药学学报　2006年 10月　第 22卷　第 5期　　　PharmJChinPLA　Vol22　 No5　Oct2006　　　　　
文章编号:1008-9926(2006)05-0356-03　　中图分类号:R943　　　文献标识码:A
人血清白蛋白可注射用植入剂的制备及体外释放研究
尹东锋① ,鲁　晶②
(①中国人民解放军第二军医大学　药学院　上海　200433;②中国人民解放军第 302医院　北京　100039)
摘　要:目的　制备人血清白蛋白(HSA)可注射用植入剂 ,为多肽 、蛋白类药物提供了一种制剂技术平台 。方法　以聚乳酸-
羟基乙酸共聚物(PLGA)为载体材料 N-甲基-2-吡咯烷酮为共溶剂制备载 HSA长效可注射用植入剂;用微量 BCA法考察微球
的体外释药特性及影响因素。结果　加入泊洛沙姆 188后制备的长效可注射用植入剂在一个月内的累积释放显著提高。结
论　载 HSA长效可注射用植入剂可在体外缓释一个月。
关键词:人血清白蛋白;注射用植入剂;聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA);体外释放
StudyofinVitroReleaseandPreparationMethodofHumanSerumAlbuminIn-
jectableImplant
YINDong-Feng① , LUJing②
(①SchoolofPharmacy, SecondMilitaryMedicalUniversity, Shanghai　200433　China)
(②hospitalof302 PLA, Beijing　100039　China)
ABSTRACT:AimToprepareinjectableimplantloadedwithhumanserumalbumin(HSA)anddevelopitslong-
actingdosageform, soastoprovidatechnicalplatformforthepeptideandproteindeliverysystem.MethodsIn-
jectableimplantloadedwithHSAwaspreparedwithpoly(lactic-co-glycolicacid)(PLGA)asthecarriermaterial
andN-methyl-2-pyrolidoneasco-solvent.Theinvitroreleasebehavioranditsinfluencingfactorsweredetermined
bymicro-BCAmethod.ResultsTheaccumulatedreleaseoftheinjectableimplantcanbesignificantlyimproved
whenF-68 wasadded.ConclusionHSAcanbeentrappedininjectableimplanttoyieldone-monthcontinuousre-
lease.
KEYWORDS:Humanserumalbumin;Injectableimplant;Poly(lactide-glycolideacid);Invitrorelease
　　随着生物技术的高速发展 ,多肽 、蛋白类药物不
断涌现 ,在临床上应用前景广阔并已取得了良好的
效果。此类药物生物活性强 、剂量小 ,但口服生物利
用度低 ,稳定性差 ,所以生物大分子药物的剂型基本
是冻干粉针 ,因半衰期短需频繁给药 ,这就增加了患
者的肉体痛苦和经济负担 。
目前多肽 、蛋白类药物缓释给药系统成为研究
的热点 ,主要集中在埋植剂和注射用微球。埋植剂
需经手术途径植入体内 ,非生物降解型的骨架材料
释药完毕后还需手术取出。注射用微球的技术工艺
复杂 ,难于大规模的生产 ,储存和注射时也存在着问
题 ,用于人体后一旦发生不良反应难以从体内清除。
本课题拟研究一种可注射的生物降解型皮下植
入剂 ,该剂型的特点是体外呈溶液态 ,注射入体内后
[ 4] 　HamakawaH, TakemuraM, SatoM, etal.Clinicalsignificanceof
MMP-3 inpatientswithrheumatoidarthritis:comparisonwithother
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[ 5] 　HegemannN, WondimuA, UlrichK, etal.SynovialMMP-3 and
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[ 7] 　ConstantinA, Lauwers-CancesV, NavauxF, etal.Stromelysin1
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aprospectivestudy[J].ArthritisRheum, 2002, 46(7):1754
(收稿日期:2006-06-19;修回日期:2006-07-10)
(本文编辑　梁爱君)
·356· 　解放军药学学报　第 22卷第 5期　　人血清白蛋白可注射用植入剂的制备及体外释放研究　　　　　尹东锋　　
① 作者简介:尹东锋(1976-),男 ,山东曲阜人 ,硕士 ,主管药师。研究方向:基因给药。 E-mail:yin/dongfeng@yahoo.com.cn