全 文 ：进行筛选 ,挑选出反向接合子 E .coli C600 (pSDRA3)、E.coli
C600(pSDRA4),并提取质粒验证(图 3)。由图 3可见 ,从反向
接合子中提取的质粒分别与从正向接合的供体菌 E.coli
SM109 中提取的质粒相同 , 从而证明重组质粒 pSDRA3 、pS-
DRA4 确实已经导入喜温硫杆菌中。
图 3　质粒提取电泳图
Fig.3　Agrose gel elect rophoresis of plasmids from donor and transconjugant
strains
Lane 1:E.coli C600(pSDRA4);Lane 2:E.coli SM109(pSDRA4);Lane 3:
E.coli C600(pSDRA3);Lane 4:E.coli SM109(pSDRA3);Lane 5:λDNA
Hind III marker.
2.3　质粒的稳定性
构建的基因工程菌 T.caldus(pSDRA3)和 T.caldus(pS-
DRA4)在不含有亚砷酸钠的培养基中连续传代约 50 代后 , 分
别有 81%和 76%的菌体细胞仍保持亚砷酸钠抗性。表明重组
质粒 pSDRA3 和 pSDRA4 在喜温硫杆菌中具有良好的稳定性。
2.4　重组质粒抗砷基因的表达
首先检测了重组质粒上的抗砷基因在大肠杆菌中的表
达 ,图 4 显示了分别含有重组抗砷质粒 pSDRA3 、 pSDRA4 和载
体质粒 pMMB24的 E.coli JM109 在不同浓度的亚砷酸钠液体
培养基中的生长情况。
图 4　不同亚砷酸钠浓度下各菌株的最大生长浓度曲线
Fig.4　Growth curve of E.coli harboring different plasmids in different con-
centration of NaAsO2
由图可以看出含有重组质粒 pSDRA3、pSDRA4 的大肠杆菌
JM109 的抗砷能力远远高出只含有载体质粒 pMMB24 的大肠
杆菌 JM109 ,因此抗砷质粒 pSDRA3 、pSDRA4 的构建是成功的。
另外 ,由于 pSDRA3上抗砷基因的表达受调节基因 lacIq 的诱
导 ,需要加入 IPTG 作为诱导剂才可获得高效表达 , 这在实际
生产中是不可行的 , 所以 , 又构建了组成型表达的抗砷质粒
pSDRA4。从图 4 中也可以看出 E.coli JM109(pSDRA4)的抗砷
性能比 E.coli JM109(pSDRA3)高。
为了验证重组菌的抗砷性能 , 将野生型 T.caldus以及构
建的工程菌 T.caldus (pSDRA3)和 T.caldus(pSDRA4)分别涂
布含有 5mmol L、10mmol L亚砷酸钠的 Starky-Na2S2O3 固体平
板 , 40℃静止培养 7 ～ 10d , 野生型喜温硫杆菌在含有 5mmol L
亚砷酸钠的 Starky-Na2S2O3 固体平板上都不生长 , 而两个基
因工程菌在含有 10mmol L亚砷酸钠的Starky-Na2S2O3 固体平
板都生长良好 , 说明构建的工程菌的抗砷性能明显提高。
3　讨论
喜温硫杆菌(Thiobacillus caldus)是 1994 年命名的新菌种 ,
近年来发现它在细菌浸矿中具有十分重要的作用。 但是在实
际应用过程中 , 因为该菌生长缓慢 、细胞得率低以及对重金属
如砷 、汞 、银等缺乏抗性等弱点 , 限制了其应用范围 , 而且给实
验室的研究工作也带来许多不便。因此要想充分发挥其生物
冶金的功能 , 对喜温硫杆菌进行遗传改造势在必行。
喜温硫杆菌自从 1994 年首次报道以来 , 国外的大量工作
集中在它的生理学和在浸矿中的作用方面[ 5-7] ,未见有对其遗
传改造方面的报道 , 国内关于喜温硫杆菌的研究开展比较晚 ,
尚处于起步阶段[8] 。喜温硫杆菌遗传转移系统的研究在国内
外至今未见报道。喜温硫杆菌是专性自养极端嗜酸硫氧化细
菌 ,该属菌未发现有噬菌体存在 , 所以转导行不通;而转化的
方法对该属中的嗜酸菌都未见报道;因此建立一种有效的遗
传改造方法便转向了建立接合转移系统。但是由于喜温硫杆
菌与大肠杆菌生长条件差别巨大 ,接合转移也变得十分困难。
本试验摸索出了喜温硫杆菌与大肠杆菌能够共同生长的接合
培养条件。利用具有广泛寄主范围的 IncQ 质粒 pMMB24 为载
体 ,构建了含有 tac强启动子的抗砷质粒 pSDRA3、 pSDRA4 , 在
E.coli SM10染色体上的 tra 基因的带动下 ,与喜温硫杆菌进
行了接合转移研究 , 成功地将构建的抗砷质粒导入喜温硫杆
菌中并使抗砷基因获得了表达 , 构建了适于工业大生产的冶
金工程菌。本实验首次成功地建立了大肠杆菌与喜温硫杆
菌的遗传转移系统 , 为喜温硫杆菌其他性能的改造奠定了基
础。
参考文献:
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渗透胁迫下白花柽柳 cDNA文库的构建及 EST分析
蔡勤安1 ,王玉成2 ,张道远3 ,董玉芝1 , 2＊(1.新疆农业大学林学院 , 新疆 乌鲁木齐 830052;2.东北林业大学 , 黑龙江 哈尔滨 150040;
3.中国科学院新疆生态与地理研究所 , 新疆 乌鲁木齐 830011)
摘要:目的:寻找渗透胁迫相关基因 EST片断。方法:构建白花柽柳 cDNA文库 ,对文库阳性克隆随机测序 ,并进行网上比对
分析。结果:该 cDNA 文库克隆的重组率大于 95%, 插入片段主要集中在 250 ～ 1000bp之间 , 并获得了如脯氨酸丰富蛋白基因 , 钙
第 15卷第 3 期:21
2005 年 6 月 　　　　　　　　　　　　　　　　
生　物　技　术
BIOTECHNOLOGY
　　　　　　　　　　　　　　　　　Vol.15 , No.3:21
Jun.2005
DOI :10.16519/j.cnki.1004-311x.2005.03.009
依赖蛋白激酶基因 ,丝氨酸 苏氨酸激酶基因 ,过氧化氢酶基因 , 膜转运蛋白等基因。结论:渗透胁迫基因是多基因参与的系统调
控过程 ,它们涉及了植物细胞壁合成 、信号传递 、基因调控 、氧化物质清除 、渗透调节物质的转运等方面。
关键词:白花柽柳;渗透胁迫;cDNA 文库;表达序列标签
中图分类号:Q75;Q785　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2005)03-0021-05
Construction and Analysis of Tamarix albiflonumM .T.L iu .cDNA Library
under Osmosis Stress
CAI Qin-an1 ,WANG Yu-cheng2 ,ZHANG Dao-yuan3 ,DONG Yu-zhi1 ,2＊
(1.Xinjiang Agricultural University , Urumqi 830052 , P.R.China;2.Northeast Forestry University , Harbin 150040 , P.R.China;
3.Xinjiang Institute of Ecology and Geography Chinese Academy of Sciences , Urumqi 830011 ,P.R.China)
Abstract:Objective:To find the EST of Osmosis stress-associated genes.Method:a cDNA library was constructed from leaves of Tamarix albif-
lonum M.T.L iu.treated with osmosis stress.The picked positive clones of the library was randomly sequenced and analysed through BLASTX.
Results:The rate of recombination was above 95% and the size of most inserts were 250 ～ 1000bp in the library and some genes were identified
such as proline rich protein , calcium dependent protein kinase , serine threonine-protein kinase , Catalase , integral membrane transporter protein
etc.Conclusion:Osmosis stress-associated genes were multiple-gene that participated in systematic regulation process.The function of these
genes included cell wall synthesis , signal component , regulatory protein and antioxidant enzyme.
Key words:Tamarix albiflonum M.T.L iu.;osmosis stress;cDNA library;expressed sequence tags
收稿日期:2004-12-04;修回日期:2005-04-26
基金项目:中国科学院新疆生态与地理研究所创新领域前沿课题
(KZCX-XJ02-05)项目资助;本实验在黑龙江省重点实验室东北林
业大学林木遗传育种实验室完成
作者简介:蔡勤安(1975-),男 ,在读硕士生 ,专业方向:分子遗传学 , E
-mail:qinancai @ yahoo.com.cn;＊通讯作者:董玉芝 , E -mail:
dyz830052@126.com , Tel:0991-8762382。
　　柽柳属植物广泛分布于我国西北干旱地区 ,具抗旱 、耐盐
碱 、耐水湿 、耐沙埋及耐贫瘠的特性 , 在干旱 、半干旱地区始终
保持着优势种和建群种的地位[1] 。它不仅是水土保持树种和
盐碱地重要的绿化造林树种 ,同时还是优良的防风固沙植物。
王霞 、侯平等人研究了不同种柽柳受到水分胁迫时体内膜保
护酶 SOD、POD活性变化及膜脂过氧化的情况[ 2] , 干旱胁迫下
不同柽柳体内脯氨酸 、可溶性糖的积累及变化规律[3] ,土壤缓
慢水分胁迫下多花柽柳和长穗柽柳内源激素 ABA、IAA、GA 的
变化[ 4] 。但目前 , 对柽柳的抗旱研究都集中于对几项生理指
标的测试 ,而在分子水平上罕见报道。白花柽柳(Tamarix albi-
flonum M.T.L iu.)由刘铭庭(1994)发现并命名[5] , 其划分的
主要依据为花的各部全为白色 , 且白色性状稳定遗传 ,是一个
自然的种。以新发现的白花柽柳为材料进行相关的研究 , 不
仅可以得到抗旱相关基因 , 而且为以后高等植物转基因得到
相关的材料和理论上的依据。Saori Miyazaki等人研究表明 , 在
胁迫条件下 , 胁迫基因集中表达的范围在 1h-24h , 而一些胁
迫调节基因 ,如蔗糖合成酶 、磷酸激酶等基因主要集中在 1 ～
12h[6] 。我们用 PEG6000 渗透胁迫处理白花柽柳 6h , 取其嫩
叶 ,构建 cDNA 文库 ,以期得到一些抗旱相关基因。
cDNA文库广泛应用于表达序列标签(EST),基因的筛选 、
分离及基因芯片等方面的研究 ,还可以与 RACE技术结合克隆
新的基因[ 7] 。构建 cDNA 文库是分离目的基因的最有效途径
之一 , cDNA文库往往富集了特定时期特异组织内表达的基
因 ,并先天去除了内含子 ,便于在细菌中研究表达 ,以及进行
基因测序和氨基酸序列推测。因此 ,构建 cDNA文库是分子生
物学中很重要的研究手段。
1　材料和方法
1.1　材料
白花柽柳(Tamarix albiflonum M.T.L iu.)插条取自新疆
吐鲁番沙生植物园。将插条扦插在沙:泥炭为 2∶1 的花盆中 ,
待扦插苗长至50cm 左右 , 将枝条剪下来 , 放在盛有 1×Hoag-
land培养液的容器中培养 2d , 每天更换一次培养液。将培养
液内加入 30%PEG6000 对柽柳枝条进行渗透胁迫处理 6h 后 ,
迅速取其嫩叶 ,放置-70℃冰箱保存。
1.2　试剂和仪器
大肠杆菌 JM109 为本实验室保存。反转录用 BD SMARTTM
RACE cDNA Amplification Kit(BD Biosciences 公司)试剂盒。mR-
NA分离用 PolyA Ttract ★R mRNA Isolation System Ⅳ(Promega);
RNase抑制剂 、DNase I(Promega 产品)。克隆载体 pMD18-T、
RNase A(Sigma);Taq DNA 聚合酶(宝生物工程(大连)有限公
司);DNA回收试剂盒(上海华舜生物工程公司);IPTG(TaKa-
Ra);X-gal(TaKaRa)Amp(Amresco);Tris(Sigma);EDTA(Sigma 产
品);Tris 饱和酚(Ding Guo);琼脂糖(Bioweat);Yeast Extract(Ox-
oid)。其它试剂为国产分析纯。测序仪为 Amersham Pharmacia
公司的 MegaBACE(tm)1000 DNA序列分析仪。
1.3　方法
1.3.1　总 RNA的提取
取冰冻的柽柳叶 , 加液态氮快速研磨至白色 ,在 1.5ml Ep-
pendorf管中加入 650μl SDS RNA 提取缓冲液 , 100μl的 β-巯基
乙醇 , 350μl Tris 酚 , 350μl 氯仿 , 震荡 30min , 13000r min 离心
5min。取上清 , 加 350μl Tris酚 , 350μl氯仿 , 震荡 10min , 13000r
min ,离心 5min。取上清 ,加 350μl乙醇 , 350μl LiCl(4mol L)冰浴
10min , 4℃, 10000r min 离心 10min , 弃上清。用 75%乙醇洗涤 2
次沉淀物 , 溶于 40μl DEPC处理的超纯水中待用。
1.3.2　RNA反转录及 PCR扩增
取 1.8μl白花柽柳总 RNA(1μg)作为合成第一链的模版 ,
反转录引物为 5′CDS(序列见试剂盒), 具体反应体系为:总
RNA 1μg , 5′CDS 1μmol L , SMARTⅡ寡核苷酸引物 1μmol L , dNTP
1mmol L ,逆转录酶 1μl ,反应体系 10μl。 42℃1h , 反转录完成后
用 TE buffer稀释至 100μl ,用作 PCR扩增的模板。
以第一链 cDNA产物为模版(引物同上), 以 UPM 引物和
5′CDS 引物为 PCR扩增引物 , 进行 PCR扩增。 PCR体系为:反
转录产物 2μl , UPM 引物和 5′CDS 引物各 1μmol L , dNTP
250μmol L , Taq 1.5U , 10×PCR buffer 2μl , 反应体积 20μl。 PCR
反应条件为:94℃预变性 1min , 94℃ 30s , 66℃30s , 72℃3min , 30
个循环 , 最后 72℃延伸 30min。反应结束后 ,在 1%的琼脂糖电
泳上检测 PCR扩增结果。
1.3.3　PCR扩增片断的回收
PCR扩增后的产物经琼脂糖凝胶电泳 , 在长紫外灯下切
下 0.5kb～ 1kb 和 1kb ～ 2kb 的扩增条带。扩增片段的回收纯
化参照上海华舜生物工程有限公司的小量胶回收试剂盒说
明。
1.3.4　连接与转化
将纯化的 PCR产物1μl , ddH2O 3μl , pMD18-T 载体1μl , So-
lution I 5μl , 反应体积 10μl轻轻混匀 , 16℃过夜 , 进行连接反应。
将连接好的质粒转入 E.coil JM 109受体菌中 ,取 200μl转化菌
液涂在含 X-Gal、IPTG、Amp 的琼脂培养基平板上。每 100ml
LB 固体培养基中加入 200μl X-Gal(20 mg ml)、50μl IPTG(50
mg ml)和 120μl的 Amp(50mg ml)。待菌液被完全吸收后 ,用封
口膜封好 ,倒置于 37℃温箱中过夜培养。 根据蓝白斑的数目
来判断重组率并且选挑白色阳性克隆。
22　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　生　物　技　术　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 15 卷第 3期
1.3.5　质粒检测
利用 pMD18-T 载体测序引物进行 PCR检测鉴定插入片
段长度 , 扩增质粒的反应体系为 10×PCR Buffer 2μl , 引物 M13
-47 和 RV-M 各 1 μl(20μmol L), dNTP 0.2μl(10mmol L), Taq
DNA聚合酶 0.13μl(1 U),质粒 1μl , 加纯水至终体积 20μl。反
应条件为:94℃预变性 3min , 94℃30s , 56℃ 30s , 72℃120s , 30 个
循环 , 72℃10min。
2　结果
2.1　总 RNA的完整性
图 1　总 RNA 电泳结果泳道 1 , 2均为柽柳总 RNA
Fig.1　Totle RNA electrophoresis of Tamarix albif lonum M.T.Liu
Lane 1～ 2:Tot le RNA of Tamarix albif lonum M.T.Liu.
图 2　第一次及第二次PCR产物电泳图
泳道 1～ 3为第一次 PCR产物 , 4～ 6 为第二次 PCR产物 ,M 为分子量
Marker DL 2000
Fig.2 The electrophoresis of the first and thesecond PCR products
Lane 1～ 3:The first PCR products;Lane 4～ 6:The second PCR products;M:
DL2000 marker.
SDS 试剂提取总 RNA 后 ,用紫外分光光度计测定 A260 A280
为1.9 , 琼脂糖凝胶电泳显示 28S 和18S 条带清晰 , 无拖尾且比
例接近 2∶1(见图 1)。说明 RNA 未降解 ,可以用于反转录。
2.2　cDNA 文库的构建
反转录后 , 经过 PCR合成双链 cNDA , 电泳结果显示双链
cDNA在 250bp 至 2kb 之间呈弥散带(见图 2)。胶回收 500bp～
1kb和 1kb ～ 2kb 之间的片断 ,转化至大肠杆菌 JM109 中。根据
平板篮白斑的比例确定重组率 , 重组率大于 95%。挑白色阳
性单菌落 , 提取质粒 , 进行 PCR检测鉴定插入片段长度 , 对挑
取的 15 个单菌落进行 PCR测定后 ,电泳结果显示插入片断在
要求范围之内。(见图 3)文库质量符合要求。
图 3　重组质粒的 PCR检测
泳道 1～ 3和 7～ 9为回收 1～ 2kb的重组质粒;4～ 6 , 10～ 12以及 13～
15为 500bp～ 1000bp的重组质粒;M为 DL2000
Fig.3　PCR examination of reconstructed plasmids
Lane 1～ 3 and 7～ 9:The reconstructed plasmids that the length f rom 1kb to
2kb;Lane 4～ 6 ,10～ 12 and 13～ 15:The reconstructed plasmids that the length
from 500bp to1000bp;M:DL2000 marker.
2.3　测序及结果比对
随机挑选 96 个阳性克隆菌斑 , 用 MegeBACE1000 型自动
测序仪测定所挑选克隆的序列。 将 DNA 测序结果进行 blastx
比较 , 进行同源性基因检索。挑选出与抗旱相关的基因序列 ,
共获得 5 个抗旱相关的基因序列 ,序列及比对结果如下。
表 1　渗透胁迫相关基因 EST序列
Table 1　The EST of Osmosis stress-associated genes
3　讨论
实验获得 5 个与抗旱相关的基因片段 , 它们包括:细胞壁
合成相关基因如脯氨酸丰富蛋白(PRP);编码信号传递和转录
232005 年 6 月　　　　　　　　　　　渗透胁迫下白花柽柳 cDNA 文库的构建及 EST分析　　　　　　　　　　　　　　　　
调控蛋白的基因如钙依赖蛋白激酶(CDPKs)和丝氨酸 苏氨酸
蛋白激酶(STPK);与细胞抗氧化防御相关的基因如过氧化氢
酶(CAT);与物质交流和信息传递的如质膜转运蛋白(IMTP)
等。
表 2　白花柽柳抗渗透胁迫相关基因
Table 2　Osmosis stress-associated genes of
Tamarix albif lonum M.T.L iu
基因序列 BALST 结果 E值 同源物种
1 proline rich protein 0.003 Santalum album
2 seed calcium dependent protein kinase 3e-27 Glycine max
3 serine threonine kinase 0.11 Sorghum bicolor
4 Catalase 5e-05 Capsicum annuum
5 integral membrane transporter protein 3e-07 Homo sapiens
3.1　脯氨酸丰富蛋白
在柽柳 EST中发现了 proline-rich protein family等蛋白 ,它
们与细胞壁的合成相关。细胞壁是植物抵抗不良环境的第一
道屏障 , 其主要由多糖和蛋白质构成 ,其中脯氨酸蛋白 、富含
甘氨酸蛋白和富含羟脯氨酸蛋白 , 它们的表达受到环境因素
调控 ,其中富含脯氨酸蛋白的表达可以因逆境诱导而表达 , 与
抗逆直接相关 ,是一种与抗逆相关的蛋白[8] 。近年来 ,通过生
理生化和差异显示(Differential screening)技术 , 在拟南芥中以发
现该基因 ,并已清楚了解其功能。
3.2　钙依赖蛋白激酶和丝氨酸 苏氨酸蛋白激酶
环境胁迫能产生胞外信号 , 植物通过信号的传递来完成
对胁迫的应激响应。丝氨酸 苏氨酸蛋白激酶作为信号传递体
能与 Ca2+结合蛋白作用并将胁迫信号传递到细胞内 , 在植物
对逆境胁迫的响应过程中起重要作用[10] 。真核生物转录因子
是近十几年来发现的一类在真核基因转录时起调节作用的蛋
白质 ,能参与基因应答外界环境因素所诱导的转录[ 9 ,10] 。近年
来的研究表明 ,多种转录因子能接受胁迫信号 ,抑制或激活某
些基因的表达 , 而这些基因的产物能使植物免受胁迫的伤
害[ 11] ,例如钙依赖蛋白受干旱胁迫的诱导 , 并对抗旱基因的表
达进行调控。已有研究证明 , 植物受到干旱胁迫能引起细胞
质Ca2+浓度的变化 , 从而发出钙信号以传递所感受到的刺激
信号。钙信号的进一步传递则需经 Ca2+结合蛋白和钙依赖蛋
白激酶等才能完成。一个大的钙依赖蛋白激酶(CDPKs)基因
家族在植物的钙信号传递过程中起着重要作用。 CDPKs 是植
物和一些原生生物所特有的一类丝氨酸 苏氨酸型蛋白激酶 ,
它在胞内钙信号的放大并向下级联传递过程中起着十分重要
的作用。研究表明 , CDPKs参与到了植物环境胁迫反应 、病原
体的防御反应 、生长发育过程 、离子通道调节 、激素信号等诸
多信号传递过程[ 12] 。近年来 , 国内外学者对 CDPKs的研究十
分活跃 ,取得了许多重要成果。参与环境胁迫信号的转导是
CDPKs 的重要作用之一。Sari T等人研究钙在拟南芥(Arabi-
dop sisthaliana)的寒冷驯化和在 kin 基因诱导过程中的作用时
发现有 5个 CDPK cDNA受寒冷的调节机制是不同的。对驯化
不同阶段细胞 CDPKs 的全部范围进行放大 , 显示出不同的
CDPK蛋白带在驯化的不同阶段受寒冷的调节也不同。 Li W G
等人在水稻中发现一种 47ku CDPKs , 其活性在茎的胞质和膜
中都以严格的钙依赖方式被冷害诱导 ,同时也受到盐 、干旱和
ABA的诱导。 Saijo Y等人在转基因水稻中通过改变蛋白质水
平 ,对一个编码 CDPK的基因(OsCDPK7)在胁迫条件下过量表
达的研究时发现 ,这些植物对冷害 、盐和干旱胁迫的忍耐程度
与OsCDPK7的表达水平有很好的相关性 , 且与干旱相关的应
激基因能够增加OsCDPK7的过量表达 , 因而Saijo Y等人认为 ,
虽然引起冷害 、盐及干旱忍耐的信号途径的下游事件不相同 ,
但至少说明两个不同的信号途径共用同 1 个 CDPK , 通过翻译
后的调节机制而维持各自的信号特异性。
3.3　过氧化氢酶
渗透胁迫导致细胞内活性氧类物质大量增加 , 对细胞膜
和核酸造成伤害。 因此 , 通过抗氧化酶类的作用去除活性氧
等有害物质 , 增加膜结构的稳定性 , 是提高植物抗旱能力的关
键。在整个氧化防御系统中 , CAT是一个参与清除活性氧反
应的酶类[13] , 使细胞免受毒害。CAT广泛存于植物组织中 , 是
膜保护系统一种重要的酶 , 其活性与植物的代谢强度及抗逆
性有一定的联系 , 它是一种铁卟啉蛋白 ,能使体内某些氧化酶
毒性产物 H2O2 分解为 H2O和 O2 。清除体内过多的H2O2防止
其氧化位于膜上的磷脂分子中的高度不饱和脂肪酸 ,生成大
量过氧化物造成磷脂功能障碍损伤生物膜 , 从而维持细胞正
常的代谢循环 , 增强植物对逆境的适应能力。吕成群等人的
研究表明 , 在渗透胁迫下 , CAT 活性明显增高[ 15] , 汪炳良等人
的研究表明 , 在(30-35℃)高温胁迫下 , CAT 的含量明显上
升[16] 。
3.4　膜转运蛋白
膜转运蛋白是主要负责跨膜运输一种或一类物质 , 植物
受到渗透胁迫时 , ATPase(膜转运蛋白)起到建立和维持离子平
衡的作用 ,脂膜和液泡上的 H+-ATPase(膜转运蛋白)起到维
持细胞内 Na+、Cl-浓度的作用。这些基因正是柽柳在渗透胁
迫下建立和维持细胞内离子转运和离子平衡的重要基因[12] 。
许多报道认为植物耐逆性与膜上 ATP 酶活性显著相关 , 其原
因是渗透胁迫下位于质膜和液泡膜的 ATP酶 植物液泡膜 H+
-PPase参与 H+向液泡内的转运 ,负责调控胞质 pH 和焦磷酸
代谢。一般认为液泡膜 H +-PPase由单基因编码 , 它的过量
表达有可能增加质子驱动力 , 从而提高植物的耐盐性。的确 ,
异源表达拟南芥液泡膜 H+-PPase恢复了盐敏感酵母突变体
的耐盐性;过量表达拟南芥液泡膜 H+-PPaseAVP1 明显增加
了转基因植株跨液泡膜质子梯度 , 促进了 AtNHX1 所介导的
Na+ H +逆向转运活性 , 将 Na+区隔化至液泡 , 因而明显增加
了转基因植株耐盐性及抗旱性。王宝山[17] 等发现 NaCl胁迫
下高粱根和叶鞘液泡膜 ATP酶水解活性质子泵活性首先明显
增加 , 而后逐渐下降 ,叶片液泡膜 ATP酶水解活性和依赖 ATP
的质子泵活性随后增加并维持较高活性。由此得出短期非盐
生植物根和叶鞘的液泡在盐胁迫初期起到 Na+库作用 , 但长
期盐胁迫使根和叶鞘液泡的 Na+达饱和状态 , 过多 Na+运输
到功能叶片导致细胞质 Na+ K+值增加 , 使液泡膜 ATP酶活性
下降。刘志生[18]也指出盐胁迫后 ,根尖细胞质膜 ATP 酶活性
较高是强耐盐性小麦“鲁德 1 号”具有较高 K+选择性和较低
Na+ K+值的主要原因之一。
本研究结果充分说明 , 在渗透胁迫下 ,白花柽柳通过信号
传导 、基因表达调控 、氧化物质的清除 ,渗透调节物质的调剂
等多种途径增强抗旱能力。
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GB对低温胁迫黄瓜叶绿体及 SOD 、POD同工酶的影响
李芸瑛 ,梁广坚(肇庆学院生物学系 ,广东 肇庆 526061)
摘要:采用电镜观察和聚丙烯酰胺垂直板电泳法 , 研究了 GB对低温胁迫下黄瓜幼苗叶绿体超微结构和 SOD、POD 同工酶的
影响。结果表明 ,低温胁迫下 , GB 可使黄瓜幼苗叶绿体膜结构保持完好 ,而对照的叶绿体基粒破坏严重;与对照相比 , GB 处理对
SOD、POD同工酶谱带数目均无影响 , 但 POD同工酶的 P2(Rf 0.24)、P3(Rf 0.30)、P4(Rf 0.36)酶带的活性增加 , SOD 同工酶的 S1
(Rf 0.14)、S5(Rf 0.58)酶带活性较高 , 保持了黄瓜幼苗体内相对较高的抗氧化酶活性 。GB 可保护膜的完整性和稳定性 , 从而提
高黄瓜幼苗的抗冷性。
关键词:甜菜碱;黄瓜幼苗;叶绿体超微结构;超氧物歧化酶;过氧化物酶;同工酶;低温胁迫
中图分类号:Q554+.6;Q554+.9　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2005)03-0025-03
Effects of GB on the Chloroplast and Isozymes of SOD and POD of
Cucumber Seedlings under Cold Stress
LI Yun-ying ,LIANG Guang-jian(Department of Biology , Zhaoqing College ,Zhaoqing 526061, P.R.China)
Abstract:The effects of GB on the chloroplast ultrastructure and isozymes of SOD and POD of cucumber seedlings under cold stress were studied
by electron microscope and PAGE.The results showed that the chloroplast membrane structure of cucumber seedlings treated with GB was not
damaged , but that of the control was damaged.Compare with the control , the band numbers of SOD and POD isozymes were not changed by GB ,
but the activities of bands[ P2(Rf 0.24), P3(Rf 0.30), P4(Rf 0.36)] of POD isozyme and some bands of SOD isozyme were increased.It showed
that GB could protect the integrity and stability of the membrane , and enhance the cold resistance of cucumber seedling.
Key words:gly cine betaine;cucumber seedling;chloroplast ultra-structure;SOD;POD;isozyme;cold stress
收稿日期:2004-12-01;修回日期:2005-03-06
作者简介:李芸瑛(1964 -),女 , 硕士 ,讲师 ,从事植物生理生化的教
学及科研工作 ,发表论文 10多篇。
　　黄瓜属喜温植物 ,对低温敏感 ,早春露地栽培时幼苗常出
现低温冷害 ,影响黄瓜早产。因此 , 黄瓜的低温冷害问题受到
广泛关注。甜菜碱(Glycine betaine , GB)是高等植物中最常见
和最重要的渗透调节物质之一 , 在提高植物对低温 、盐渍等逆
境胁迫抗性方面具有较为重要的作用[1-3] 。 GB在黄瓜抗冷性
方面的应用尚未见报道 ,本文在前面试验的基础上[4] ,通过分
析合适浓度GB 处理对低温胁迫下 SOD、POD 同工酶的影响 ,
观测叶绿体超微结构的变化 ,进一步探讨 GB 提高黄瓜幼苗抗
冷性的机理。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　实验材料:黄瓜(Cucumis satrvus)品种为粤秀 2 号 , 购自
广东农业科学院蔬菜研究所。
1.1.2　试剂:GB 为 Sigma 公司产品 , 含量>99.0%。 丙烯酰
胺 、甲叉双丙烯酰胺 、四甲基乙二胺 、过硫酸铵 、联苯胺等均为
分析纯。NBT为进口分装。
1.1.3　仪器:电脑三恒多用电泳仪(DYY-Ⅲ12 型 , 北京六一
仪器厂), 透射电镜(日本 JEM-1010 型)。
1.2　方法
1.2.1　材料的培养:塑料杯每杯播已催芽的种子3 粒 , 置玻璃
温室中培养(PFD 为 150μmol·m -2 s -1 , 昼夜温度 26 22℃, RH
75%), 出苗后用 1 2 Hoagland 营养液培养 , 每 2d 更换一次 , 培
养至一叶一心时 , 选取生长一致的黄瓜幼苗 , 分别用含 0(对
照)、5.0mmol·L-1GB 的 1 2 Hoagland 培养 24h , 置低温培养箱中
(6±1℃, RH70%, PFD为 70μmol·m-2 s-1)低温胁迫 5d ,后移回
原温室恢复生长。
1.2.2　叶绿体超微结构的电镜观察:分别取处理 、低温对照组
于低温胁迫 5d 后的第一片真叶及对应的常温对照组的第一
片真叶 ,用刀片切成1×2mm 小块 , 放入 4%戊二醛固定 , 并抽
气使之下沉。再用 4%戊二醛+1%锇酸双固定 , 经乙醇梯度
脱水 , Ep812包埋。用超薄切片机切片 , 切片经醋酸双氧铀和
柠檬酸铅双染色 , 透射电镜上机观察及拍照。
1.2.3　酶液的提取:取黄瓜叶片 0.5g , 加入预冷含 1%PVPP
的 50mmol L pH7.8 的磷酸缓冲液 , 冰浴研磨 , 4℃下 15000×g
冷冻离心 20min ,上清液为粗酶提取液 ,贮于 4℃冰箱备用。
1.2.4　SOD 聚丙烯酰胺垂直板电泳:分离胶浓度为 7.5%, 浓
缩胶浓度为 2.5%, 每孔进样 40μl。 初始电流为 15mA , 待样品
进入浓缩胶后电流改为 20mA , 电泳时间 2h40min。 SOD活性染
色参照罗广华等[ 5]的方法。
1.2.5　POD聚丙烯酰胺垂直板电泳:分离胶浓度为 7.5%, 浓
缩胶浓度为 2.5%, 每孔进样 40μl。 初始电流为 15mA , 待样品
进入浓缩胶后电流改为 20mA , 电泳时间 2h50min。 POD活性染
色采用改良联苯胺染色法[ 6] 。
2　结果
2.1　GB 处理对低温胁迫下黄瓜幼苗叶绿体超微结构的影响
从图 1 看到 ,常温对照的叶绿体基粒片层垛叠较厚 , 排列
整齐 , 结构完整;低温对照的叶绿体基粒松散 ,片层排列紊乱 ,
基粒片层解体;低温GB 处理的叶绿体基粒结构较完整 , 片层
排列较整齐。低温胁迫后叶绿体淀粉粒明显增多 , 这可能与
低温阻碍了淀粉的水解和向外运输有关。光合作用积累于叶
绿体中的淀粉将被水解和运出叶绿体 , 但遇上低温这种水解
和运输将减少 , 导致淀粉粒积累。
2.2　GB 处理对低温胁迫下 SOD同工酶的影响
图 2 表明 ,对照在低温胁迫前(CK0), SOD 同工酶的酶带
第 15卷第 3 期:25
2005 年 6 月 　　　　　　　　　　　　　　　　
生　物　技　术
BIOTECHNOLOGY
　　　　　　　　　　　　　　　　　Vol.15 , No.3:25
Jun.2005