全 文 ：文章编号　1001-4675(2003)02-0148-04
白花柽柳 nrDNA 的 ITS 序列片段研究
华　丽 , 　潘伯荣
(中国科学院新疆生态与地理研究所 ,乌鲁木齐　830011 )
摘　要　运用 PCR直接测序法 , 对白花柽柳(Tamarix albif lonum M.T .Liu .)的 nrDNA 的 ITS 区(包括 ITS-l ,
5.8SrDNA 和 ITS-2)进行序列测定。结果表明 , 该植物的 ITS 序列和长穗柽柳(Tamari x elongata)的序列差别不
大:ITS-1 片段的长度都是 259bp;ITS-2 片段的长度同为 244bp;G+C 百分含量仅相差 1%;碱基差异共发生 18
处。由 ITS 及 5.8SrDNA 序列分子证据看 ,白花柽柳更可能是长穗柽柳的变异。
关键词:白花柽柳;ITS;变异
中图分类号:Q949.4　　文献标识码:A
　　白花柽柳(Tamarix albif lonum M .T .Liu .)
是由刘铭庭(1994)在塔里木盆地东部孔雀河下游和
静县大尤尔都斯盆地发现并命名的〔1〕 ,划分的主要
依据为花的各部全为白色 , 且白色性状稳定遗
传〔2〕 。因它的外部形态与长穗柽柳(Tamarix elon-
gata)相似 ,仅花色不同 ,对该种的确立一直存有争
议。对此曾有多方面的研究报道 ,如解剖学〔3～ 4〕 、
孢粉学〔5〕 、植物化学〔6〕、系统学〔7〕和生态学〔8～ 9〕等
方面。但都未从分子学证据对白花柽柳进行研究 。
ITS区(internal transcribed spacers)是 nrDNA 转录
单位的一个部分 ,位于 18S 和 5.8S 之间(ITS1)及
5.8S和 26S 之间(ITS2)的非编码转录间隔区 。因
ITS存在于高重复的核糖体中 ,进化速度快且具有
长度保守性和核苷酸序列的高度变异性 ,表明这些
间隔区的分子序列很容易在近缘类群间排序 ,而且
丰富的变异可在较低的分类阶元上 ,解决科内属间
及属下种间关系 , 包括近缘种关系(Yuan et al.,
1996;Sang et al., 1994;Baldw in , 1993;Rit landetal.,
1993;Soltis&Kuzoff , 1993)。笔者从 DNA 水平入
手 ,对白花柽柳和长穗柽柳的核糖体 DNA 内转录
间隔区(ITS)序列进行了比较 。
1　材料和方法
1.1　材料和试剂
实验材料 Tamarix.albi f lonum 和 Tamarix e-
longata 采自新疆吐鲁番沙漠植物园 ,用于 DNA 提
取的材料为硅胶干燥的当年生新鲜小枝 。PCR产
物回收试剂盒 、DNA maker、exTaq酶以及 PCR引
物均购自 Takara公司;测序试剂盒购自美国 PE 公
司 ,其它化学试剂为分析纯 。
1.2　总 DNA提取
总 DNA 提取方法为高盐 、低 pH 法(根据邹氏
等方法加以改进)〔10〕。主要步骤如下:实验材料+
液氮研磨 ※用 EDTA +PVP +巯基乙醇缓冲液
(pH5.4)※56℃摇床温育 30min ※离心后取出+
KAC溶液(pH4.5 )※低温超速离心 10min+等体
积的氯仿-异戊醇洗两次※上清液加入 1倍体积异
丙醇-20℃冷冻※70%酒精洗 3次。
1.3　引物设计及选择
I TS-1的扩增引物 P1 序列为 5′-AGA AGT
CGT AAC AAG GTT TCC GTA GG-3′;P2序列为
5′-GAT GCG AGA GCC GAG ATA TCC GTT G
-3′。 ITS-2 的扩增引物 P3 、P4 分别为 5′-GCA
TCG ATG AAG AAG GCA GC -3′,5′-TCC TCC
GCT TAT TGA TAT GC -3′两序列。
1.4　ITS的扩增和纯化
I TS 的扩增采取 P1+P4 进行整断扩增 ,或用 P1
+P 2 、P3+P 4分别扩增 I TS-1 和 I TS-2。P1 +P2
的程序如下:70℃, 4min ※94℃, 1min;60℃, 20s;
70℃, 50s;两个循环 ※94℃, 20s;60℃, 20s;70℃,
第 20卷　第 2期
2003年 6月 　　　　　　　　　　　　　　　　
干 旱 区 研 究
ARID　ZONE　RESEARCH　　　　　　　　　　　　　　　　
Vol.20　No.2
Jun.　2003
收稿日期:2002-10-15;　修订日期:2003-03-26
资助项目:中科院生物区系特支费项目及生地所创新项目(20029011)
作者简介:华丽(1997～ ),女 ,新疆奇台人 ,硕士生 ,主要从事遗传多样性研究.
DOI :10.13866/j.azr.2003.02.017
50s;38个循环※72℃,4min。P3 +P4 的程序如下:
70℃, 4min ※95℃, 5min;1 个循环 ※95℃, 30s;
52℃,30s;72℃,1min;35个循环※72℃, 10s。扩增
反应在PE 公司 9600型 PCR仪上进行 ,溶液配置方
法同汪小全和李振宇〔11〕 。PCR 产物经 Sephaglas
Bandprep Kit(Pharmacia Co.)或 Wizard PCR Preps
DNA Purif icat ion System(Promega)纯化后直接用于
测序反应 。
1.5　测序反应及检测
测序工作在 ABI377DNA 测序仪上进行。每个
物种的 ITS 均用 P1 、P2 、P3 、P4四个引物测定 ,即均
对正反链进行测定 ,以保证测序列的准确性。
1.6　Tamarix albiflonum和Tamarix elongata的序
列分析
I TS-1及 ITS-2的范围根据水稻 rDNA 的序
列确定 ,排列用 CLUSTAL A 软件(Higgins , 1994)
完成。结果用 PE公司 SeqEd v1.0.3软件和 DNA-
MAN 4.0 (Lynnon ,1998)对序列进行分析。
2　结 果
2.1　ITS片段长度及碱基百分含量
测定了 Tamarix albi f lonum 和 Tamarix elon-
gata的 ITS-1和 ITS-2 的完整序列及其5.8SrD-
NA的 3′端近 83 个碱基序列 。每个种的序列长度
及其G+C 含量见表 1 。
表 1　白花柽柳与长穗柽柳的 ITS-1 和 ITS-2 的成分比较
Tab.1　Comparison of the composition of ITS-1 and ITS-2 between Tamarix albif lonum and Tamarix elongata
Tamar ix albi f lon um Tamarix elongata
ITS-1
序列长度(bp) 259 259
序列组成 55A;83C;76G;44T;1N 57A;84C;76G;42T
百分含量 21%A;32%C;29%G;17%T 22%A;32%C;29%G;16%T
G+C百分含量(%) 61% 61%
分子比重(kDa) ssDNA:79.89;dsDNA:159.7 ssDNA:79.89;dsDNA:159.7
ITS-2
序列长度(bp) 244 244
序列组成 36A;74C;86G;48T 38A;72C;83G;51T;
百分含量 5%A;30%C;35%G;20%T 16%A;30%C;34%G;21%T ;
G+C百分含量(%) 65% 64%
分子比重(kDa) ssDNA:75.54;dsDNA:150.5 ssDNA:75.51;dsDNA:150.5
　　ITS 在 Tamarix albi f lonum 与 Tamarix elon-
gata 之间无长度差异 。 ITS -1 片段的长度都是
259bp , ITS-2 片段的长度同为 244bp。G+C 百分
含量(%)仅相差 1%。5.8SrDNA的 3′端近 83个碱
基序列在种间无长度差异 。
2.2　对所测的序列分析
Tamarix albi f lonum 和 Tamarix elongata 的
ITS-1 , 5.8SrDNA和 I TS -2的测序结果见表 2。
白花柽柳与长穗柽柳的 ITS-1一致性达 97.30%,
与长穗柽柳 I TS -2 一致性达 94.69%。碱基差异
共发生在 18个位点上 。5.8SrDNA 的 3′端近 83个
碱基序列无任何变化 。白花柽柳长穗柽柳的相对遗
传距离仅为 0.31%。
3　分析与讨论
3.1　ITS 及 5.8SrDNA序列分析在白花柽柳和长
穗柽柳研究中的价值
近年来 , ITS 序列分析已经广泛地应用于解决
科内不同等级的系统发育和分类问题〔12 ～ 14〕 。柽柳
属植物由于缺少明显而准确的分类依据 ,且种间极
易发生杂交而形成复杂的多型现象 ,致使该属成为
有花植物中分类最为混乱的属之一 。由于 ITS 及
5.8SrDNA序列分析资料在探讨种间关系以及各性
状在该属中的分类价值方面具有一定的参考价值 ,
所以 ,对柽柳属植物争议种的划分上 ,可提供分子生
1492 期　　　　　　　　　　　　　华丽等:白花柽柳 nrDNA 的 ITS 序列片段研究　　　　　　　　　　　　　
表 2　排列后的 ITS-1 , 5.8SrDNA的 3′端部分及 ITS-2 序列
Tab.2　The sequences of ITS-1 , 5.8SrDNA and ITS-2
150　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　干　旱　区　研　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　20 卷
物学证据 。
3.2　白花柽柳和长穗柽柳的关系
张元明〔4〕从种子及花粉形态角度探讨了白花
柽柳作为独立种的分类地位;魏岩〔3〕认为白花柽柳
与长穗柽柳相似 ,仅花色不同 ,从叶解剖结构特征将
白花柽柳作为长穗柽柳的变异处理较为合适;程争
鸣〔6〕从植物化学角度分析认为白花柽柳具某些独
特特性 ,是一个自然种。尽管白花柽柳现活模式存
在于吐鲁番沙生植物园 , 被收入植物模式标本名
录〔15〕。但从 ITS及 5.8SrDNA序列分子证据看 ,白
花柽柳更可能是长穗柽柳的变异。刘铭庭拟成立的
新种—白花柽柳(Tamarix albi f lonum M.T.Liu.)
还需结合其它证据分析。
参 考 文 献
〔1〕　刘铭庭.中国柽柳属植物种类及其地理分布〔J〕.新疆林业科
技 , 1994 ,(1):31～ 34.
〔2〕　刘铭庭.中国柽柳属植物综合研究及大面积推广应用〔M〕.兰
州:兰州大学出版社 , 1995:46.
〔3〕　魏岩 ,谭敦炎 ,尹林克.中国柽柳科植物叶解剖特征与分类关系
的探讨〔J〕.西北植物学报 , 1999 , 19(1):113～ 118.
〔4〕　张元明 ,潘伯荣 , 尹林克.中国干旱区柽柳科植物种子形态特
征及其系统学意义〔J〕.干旱区资源与环境 , 1998 , 7(2):22 ～
27.
〔5〕　张元明.从花粉形态探讨中国柽柳科植物系统分类的几个问题
〔A〕.中国植物学会 65周年学术报告及论文摘要汇编〔C〕.
1998:161.
〔6〕　程争鸣 ,潘惠霞 ,尹林克.柽柳属和水柏枝属植物化学分类的研
究〔J〕.西北植物学报 , 2000 , 20(2):275～ 282.
〔7〕　张道远 ,尹林克 ,潘伯荣.柽柳属(Tamarix L.)系统学研究及
现状〔J〕.干旱区研究 , 2002 , 19(2):41～ 46.
〔8〕　杨维康 ,张道远 ,尹林克.新疆柽柳属植物(Tamar ix L.)的分
布与群落相似型聚类分析〔J〕.干旱区研究 , 2002 , 19(3):6 ～
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〔9〕　尹林克.柽柳属植物的生态适应与引种〔J〕.干旱区研究 , 2002 ,
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〔10〕 邹喻萍 , 汪小全 , 雷一丁等.几种濒危植物及其近缘类群总
DNA的提取与鉴定〔J〕.植物学报 , 1994 , 36(7):528～ 533.
〔11〕 汪小全.李振宇.rDNA 片段的序列分析在苦苣苔亚科系统学
研究中的应用〔J〕.植物分类学报 , 1998 , 36(2):97～ 105.
〔12〕 朱惠芬 ,杨俊波等.应用 ITS序列分析探讨偏花报春的系统位
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〔13〕 高连明 ,杨俊波等.基于 ITS序列分析探讨杜鹃属映山红亚属
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〔14〕 宋葆华 ,陈之端 ,汪小全.中国苋属 rDNA 片段的 ITS序列分析
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〔15〕 冯缨 ,潘伯荣.XJBI 植物模式标本名录〔J〕.干旱区研究 , 2001 ,
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Study on the Sequence of nrDNA in ITS Area of Tamarix albif lonum M .T .Liu
HUA Li , 　PAN Bo-rong
(Xinj iang Inst itute of Ecology and Geography , Ch inese Academy of Sciences , Urumqi 830011 , Ch ina)
Abstract:　Tamarix albi f lonum M .T.Liu w as found and named by Liu Ming ting in the Large Youerdus at
the lower reaches of Kongque River in the eastern part of Tarim Basin , Xinjiang in 1994.The compartmental-
izing basis is mainly its complete-white flow ers , and the descendibli ty of thei r w hite property is stable.Many
studies on its anatomical , sporo-pollen , phytochemical , systematical and ecological properties have been carried
out , and yet , the molecular evidences of Tamarix albi f lonum are not researched.In this paper , the sequence of
nrDNA in ITS area(including ITS-1 , 5.8SrDNA and ITS-2)of Tamarix albi f lonum is measured.The re-
sults show that the dif ference of the sequence in I TS area betw een Tamarix albi f lonum and Tamarix elongata
is not obvious , the lengths of I TS-1 and ITS-2 are 259 and 244 bp respectively , the dif ference of G +C con-
tents is only 1%, and there are 18 different si tes between Tamarix albi f lonum and Tamarix elongata.Con-
sidering f rom the molecular evidences of the sequence of ITS and 5.8SrDNA , Tamarix albi f lonum is possibly a
variation of Tamarix elongata.
Key words:　Tamarix albi f lonum ;Tamarix elongata;I TS;variat ion.
1512 期　　　　　　　　　　　　　华丽等:白花柽柳 nrDNA 的 ITS 序列片段研究