全 文 ：植物生理与生物技术
富含多糖的强旱生植物半日花基因组 DNA提取方法
白沙如拉，庞 磊，史树德，魏 磊
(内蒙古农业大学 农学院，内蒙古 呼和浩特 010019)
摘 要：半日花（Helianthemum soongoricum）属强旱生植物，其组织富含多糖和多酚等次生代谢物质，采用常规 CTAB和 SDS等
方法提取的半日花基因组 DNA由于含有多糖等杂质，无法进行 PCR扩增和限制性酶切等试验，为此，在 CTAB法的基础上进
行了改进。第 1步通过向植物组织 CTAB提取液中添加高盐和乙醇来沉淀部分多糖，第 2步将获得的 DNA粗提液，经过 CTAB
分离溶液沉淀、NaCl溶解、乙醇沉淀等方法，可有效去除半日花组织中的残余多糖等杂质，提取 DNA的质量和纯度经凝胶电泳
条带清晰、无降解、无多糖等杂质。PCR扩增和限制性内切酶的结果表明，通过改进的方法所获得的 DNA，可以进行 PCR扩增
试验，扩增条带清晰，基因组 DNA能被限制性内切酶完全酶切，该方法为后续半日花分子生物学研究奠定了重要基础。
关键词：强旱生植物；半日花；基因组 DNA；多糖；改进 CTAB 法
中图分类号：Q943.2 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006－6500.2014.03.001
Genomic DNA Isolation from Polysaccharides-rich Helianthemum soongoricum
BAI Sharula, PANG Lei, SHI Shu-de, WEI Lei
(College of Agronomy，Inner Mongolia Agriculture University，Hohhot，Inner Mongolia 010019，China)
Abstract: Helianthemum soongoricum is a strong xerophils with rich secondary metabolites material including polysaccharide,
polyphenol and pectin etc..It is difficult to obtain the genomic DNA for next molecular experiments using the traditional methods i.e.
CTAB and SDS. In this paper, a modified extracting genomic DNA method based on the classical CTAB method were carried out,
which can remove polysaccharide, polyphenols and pectin effectively through added 5 mol·L-1 NaCl and absolute ethanol in CTAB
lysed plant tissue, following the rough DNA solution precipitated by 2%CTAB separating solution and precipitated DNA redissolved by
1 mol·L -1 NaCl. Finally, the DNA was precipitated by 95% ethanol. The result showed that the extracted DNA is purified as gel
electrophoresis show clear and whole band, indicating there was no significant DNA degradation in the extraction process and
eliminating the interference of polysaccharide and polyphenols basically. The DNA obtained can be amplified by PCR, and digested by
restriction enzyme EcoR I, which laid an important foundation for subsequent molecular study research on Helianthemum plants.
Key words: strong xerophils; Helianthemum soongoricum; polysaccharides; genomic DNA extraction; improved CTAB method
2014，20（3）：1-4天津农业科学 Tianjin Agricultural Sciences
收稿日期：2013-11-29；修订日期：2014-01-14
基金项目：国家自然科学基金（31060048）
作者简介：白沙如拉（1987—），女，内蒙古通辽人，在读硕士生，主要从事植物系统发育方向研究 。 通讯作者为魏磊。
近年来，随着分子生物学技术的发展，以
DNA 为主要研究对象的保护遗传学在珍惜濒危
植物的保护和利用上得到了广泛应用 [1-2]。相关研
究结果证明，保护遗传学在濒危物种的保护方面
起到了十分积极的作用 [1-4]。而要开展珍惜濒危植
物的保护遗传学研究，获得高质量基因组 DNA 是
关键的第一步。对于植物 DNA 提取，目前已有很
多经典和成功方法 [5-8]，然而，多数濒危植物由于
生境特殊（干旱、低温及盐碱等），其体内常含有
较多的多糖和多酚等物质，若方法不当，会使所提
基因组 DNA 沉淀含有多糖等粘稠胶状物而难于
溶解，严重影响所提取 DNA 的质量，以至于无法
进行 PCR 扩增和酶切等反应。虽然已有一些富
含多糖多酚类物质植物的基因组 DNA 提取方法
的报道[5-11]，但这些方法并不适用于所有极端生境
下的植物，照搬这些方法提取的基因组 DNA 常常
无法进行下游试验。为此，对于一些极端环境下的
珍稀濒危植物基因组 DNA 的提取仍需摸索其最
佳提取条件。变色硅胶能有效、快速干燥植物叶
片，用植物干叶片提取 DNA 以及用此样品进行酶
第 20卷天津农业科学
切和扩增的成功很有意义，为解决野外采样以及
保存和运输上的困难提供了很大的方便，使得研
究人员可以在居群水平对濒危植物进行保护遗传
学研究 [1 -3]。为了评价超旱生濒危植物半日花
（Helianthemum soongoricum）的遗传多样性，笔者
尝试了上述多种去多糖多酚类植物基因组 DNA
的提取方法，用于提取半日花基因组 DNA，但所
提取的基因组 DNA 仍含有多糖等粘稠胶状物而
难于溶解，无法进行酶切和 PCR 扩增试验，而商
业化的植物基因组 DNA 提取试剂盒由于价格较
高以及 DNA产率低，不适合于大样本量的群体遗
传分析，为此，本研究基于 CTAB 法提取植物
DNA 的原理，以硅胶干燥的叶片为材料，通过改
进多糖的分离和去除，摸索出一种更适合半日花
DNA 提取的方法，为进一步开展半日花的保护遗
传学研究奠定了基础。
1 材料和方法
1.1 材 料
1.1.1 试验材料 本试验所用的植物材料半日花
采自于内蒙古乌海市千里沟居群。
1.1.2 主要试剂 2% CTAB 提取缓冲液：100
mmol·L -1 Tris-HCl，pH 值 8.0；1.4 mol·L -1 NaCl；
20 mmol·L-1 EDTA；2% (W/V) CTAB。使用前加入
0.25% β-巯基乙醇 (V/V)和 0.25% PVP (聚乙烯
基吡咯烷酮) (W/V)。2% CTAB 分离缓冲液: 100
mmol·L -1 Tris -HCl，pH 值 8.0；20 mmol·L -1 ED－
TA；2% (W/V) CTAB。使用前加入 0.25% β-巯基
乙醇 (V/V) 和 0.25% PVP (W/V)。其他试剂：5
mol·L-1 NaCl、无水乙醇、氯仿/异戊醇溶液（24:1，
V/V）、RNAase A（10 mg·mL-1）存于-25 ℃备用、
10 ×TE (Tris -EDTA) 缓 冲 液 ，pH 值 8.0（10
mmol·L-1 Tris-HCl，1 mmol·L-1 EDTA）。
1.2 方 法
1.2.1 基因组 DNA 提取方法 改进 CTAB 法，参
考 Doyle和 Doyle[8]基因组 DNA提取方法。
（1） 取硅胶干燥的半日花叶片 1 g，加少许
PVP粉于研钵中迅速研磨成很细的粉末，将粉末
分成 10份，在 5 mL离心管中预先加入 2 mL预热
的 2%CTAB 提取液，逐份加入研磨好的粉末混
匀，直至溶液变粘稠，停止加入粉末，差减法计算
加入的粉末量，多次重复后得出加入 0.02 g 干燥
叶片的粉末为最佳，此时裂解液不粘稠，为稀溶液
状，多糖与 DNA容易分离。
（2）5 mL 离心管中，加 0.45 mL 的 5 mol·L-1
NaCl和 0.35 mL 无水乙醇（边混匀边逐滴加入，若
有沉淀，可在 65 ℃水浴过程中溶解）混匀，65 ℃
水浴 1 h，前 30 min 不时颠倒离心管，稍冷后加，
颠倒混匀，10 000 r·min-1离心 15 min，取上清。
（3）将上一步所得上清液加等体积氯仿/异戊
醇混合液抽提 10 min，10 000 r·min -1 离心 15
min，取上清，重复 2次该步骤。
（4） 上一步所得上清液加 2 倍体积预冷的
95%乙醇，颠倒混匀，出现白色絮状沉淀，用无菌
移液器吸头挑出放入新的离心管中，若无絮状沉
淀可放入-30 ℃冰箱中，2 h 后 10 000 r·min-1 离
心 10 min收集沉淀。
（5）沉淀用 70%乙醇水洗 2次，无水乙醇洗涤
2次，风干，加 1 mol·L-1 NaCl溶解沉淀。
（6）向溶解了的沉淀中加入 2 mL 2%CTAB 分
离液摇匀放置 25 min，10 000 r·min -1 离心 15
min，弃上清液保留沉淀，向沉淀中加入 1 mol·L-1
NaCl 使沉淀溶解, 再加入 2 倍体积的无水乙醇使
沉淀析出。
（7）析出沉淀用 70%乙醇和无水乙醇各洗涤
两次，去乙醇，风干，待风干后用 0.5～1 mL（视沉
淀量而定）1×TE(已加入 RNA酶)溶解 DNA沉淀。
（8）若需除去 RNA 酶，可对消化后的 DNA 溶
液进行氯仿/异戊醇混合液抽提，如步骤（3），在抽
提后溶液中加入预冷无水乙醇沉淀 DNA，再加入
1×TE溶解即可。
1.2.2 PCR 扩增检测 以改进 CTAB 法所提取
的 DNA 为模板在 TC-96 型 PCR 扩增仪（杭州
博日） 中进行扩增反应，25 μL 反应体系：12.5
μL 2×Taq Master Mix、2 μL ISSR 引物（UBC No.
845）0.5 μL DNA（25 ng）模版。反应程序 : 95 ℃
预变性 5 min 后，按 94 ℃ 30 s、52 ℃ 45 s、72 ℃
1.5 min，程序循环 30 次，最后 72 ℃延伸 10
min，4 ℃保存。然后取 5 μL 扩增产物在 2%琼脂
糖（含 0.5 μg·mL-1 溴化乙锭 )凝胶中，加入 0.5×
TBE 缓冲液电泳分离，最后紫外灯下检测多态
性，照相。
1.2.3 限制性内切酶检测 取约 0.5 μg DNA 进
行限制性内切酶试验，反应体系（20 μL）：2 μL
10×NEB buffer、1 μL EcoR I，37 ℃恒温静置 2 h
·2·
第 3期
后，用 0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测并拍照。
2 结果与分析
2.1 基因组 DNA含量和吸光度值检测
所提取基因组 DNA 含量为 275～345 mg·g -1
（干质量），OD260/280值在 1.76～1.90 之间（表 1），表
明所含杂质很少，DNA纯度较高。
2.2 PCR扩增检测结果
以所提取的基因组 DNA 为模板，用 ISSR 引
物 845进行 PCR扩增。从图 1可以看出条带清晰
明亮，表明该方法获得的 DNA 适于以 PCR 为基
础的 DNA多态性研究。
2.3 酶切检测结果
图 2 可以看出，用改良 CTAB 法提取的半日
花能完全被 EcoR I 酶切，说明改进的 CTAB 法提
取的 DNA纯度较高，完全可以满足下游分子生物
学分析的要求。
3 结论与讨论
获得高质量基因组 DNA 是进行分子生物学
研究的前提之一。植物由于所处生境不同，所含多
糖多酚等次生代谢物质存在较大差异，有关这类
植物基因组 DNA提取的研究，针对不同材料特点
及试验要求进行方法改良的报道较多 [12-17 ]。但一
般都是在提取过程中添加抗氧化物质如巯基乙醇
和 PVP 等，去除多酚类物质的干扰，以及最后用
高浓度 NaCl 和无水乙醇沉淀 DNA 来达到去除多
糖等杂质的目的 [18-19]，也有通过特殊设备，如氯化
铯梯度超速离心法进行此类植物 DNA 提取的方
法，但限于其较昂贵的设备，这些方法在国内普通
实验室难以应用 [20]。本研究中，笔者尝试了常规
SDS法、CTAB法和各种去多糖方法以及一些商业
试剂盒法，但均只能得到几近白色透明的胶状物，
所得 DNA 无法进行下游试验。为此，在传统
CTAB 法的基础上提出了一种改进方法，该方法
较通常多糖类植物 DNA 提取方法具有更好的去
多糖效果，特别适合于半日花类强（超）旱生植物
基因组 DNA的提取。
在笔者的试验中，多酚和蛋白类物质可以通
过加入巯基乙醇和 PVP 以及氯仿、异戊醇抽提等
来有效地去除 [19-21]，但由于多糖类许多理化性质
与核酸相似，在植物细胞破碎时能与核酸作用形
成稳定的不可逆的复合物 [22]，因此，不能用酚仿抽
提、选择性沉淀等常规方法有效地去除多糖。为此
与常规 CTAB 法不同的是，笔者在进行细胞裂解
时，通过控制材料用量，避免提取液变粘稠而导致
多糖与 DNA 结合缠绕 [23]，从而利于后续 DNA 和
多糖的分离，为了在沉淀 DNA 前进行多糖分离，
加入了 5 mol·L-1 NaCl 和无水乙醇，这一步是为
了使大部分未与 DNA 结合的多糖进行沉淀，其中
5 mol·L-1 NaCl 和无水乙醇的用量要根据细胞裂
个体
编号
DNA 产率
/ (mg·g-1 )
吸光度值
（260/280）
1 275 1.76
2 278 1.81
3 298 1.80
4 314 1.90
5 345 1.82
6 320 1.78
7 312 1.83
8 299 1.91
9 285 1.80
10 319 1.79
注：泳道两边是 1 kb 分子量 Marker
图 1 用 ISSR 引物 845 进行的 PCR 扩增电泳图
Marker 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15Marker
表 1 10 个半日花材料的 DNA 产率和吸光度值
白沙如拉等：富含多糖的强旱生植物半日花基因组 DNA提取方法
图 2 半日花基因组 DNA 经 EcoRI 酶切电泳检测结果
·3·
第 20卷天津农业科学
解液体积进行优化，5 mol·L-1 NaCl一般控制在裂
解液体积的 1/4，无水乙醇控制在 1/10，过多的无
水乙醇容易使 DNA发生沉淀。此步骤需要混匀并
有 15～20 min 的静置时间，以保证能有效沉淀大
部分多糖，这与其他学者的研究略有不同 [21-23]。第
2 步不同之处是将获得的粗提 DNA 沉淀用 1
mol·L-1 NaCl 进行溶解，在 1 mol·L-1 NaCl 条件
下，有利于与 DNA 结合的那部分多糖的松弛分
离，并且在 CTAB 分离液加入后，多糖溶解在
CTAB溶液里，而 DNA 在 CTAB 下发生沉淀，从而
进一步起到了分离多糖和 DNA 的作用，最后通过
1 mol·L -1 NaCl 再溶解以及乙醇沉淀获得纯化
的 DNA。通过上述方法，笔者有效地去除了多糖
的干扰，获得了纯度较高的半日花基因组 DNA，
通过 PCR 扩增和限制性酶切试验，证明所提
DNA完全可以满足后续分子生物学实验要求。
本方法提供了一个通用、简单易行，成本低，
且安全地去除植物 DNA 提取过程中多糖等杂质
的方法，所提取 DNA 无降解并且纯度较高，采用
该方法所提 DNA 的纯度和浓度可以满足 PCR 扩
增和限制性内切酶消化的要求，这为后续以分子
标记和序列分析为基础的植物群体遗传学和保护
遗传学的研究奠定了重要的基础。
参考文献 :
[1] 邹喻苹, 汪小全, 雷一丁, 等.几种濒危植物及其近缘类
群总 DNA的提取与鉴定 [J]. 植物学报,1994, 36 (7):528-
533.
[2] Philip W, Hedrick P W. Conservation genetics: Where are
we now [J].Trends Ecol Evol,2001, 16(11):629-636.
[3] Gienapp P, Teplitsky C, Alho J S. Climate change and
evolution: Disentangling environmental and genetic responses
[J]. Mole Ecol,2008, 17(1):167-178.
[4] 时明芝, 肖宜安, 李晓红 . 保护遗传学及其在濒危植物
研究中的应用[J].世界林业研究, 2003, 16(4):13-16.
[5] Clark M S, 顾红雅, 瞿礼嘉. 植物分子生物学—手册实
验[M].北京:高等教育出版社, 1998:5-6.
[6] Dellaporta S L, Wood J, Hicks J B. A plant DNA mini -
preparation: VersionⅡ [J].Plant Mol Biol Rep,1983, 1 (4):19-
21.
[7] Pich U, Schubert I. Mini -preparation method for isolation
of DNA from plants with a high content of polyphenols[J]. Nu－
cl Acids Res,1993, 21(14): 3 328-3 332.
[8] Doyle J J, Doyle J L. A rapid DNA isolation procedure for
small quantities of fresh leaf tissue[J]. Phytochem Bullet,1987,
19: 11-15.
[9] 陈昆松, 李方, 徐昌杰, 等.改良 CTAB 法用于多年生植
物组织基因组 DNA 的大量提取[J].遗传，2004, 26(4):529-
531.
[10] Sue P L, Grant B, Bernard R. B. Modification of a CTAB
DNA extraction protocol for plants containing high polysaccha－
ride and polyphenol components [J]. Plant Mol Biol Rep,1997,
15(1): 8-15.
[11] Rether D, Laoued J. Isolation of polysaccharide -free
DNA from plants [J]. Plant Mol Biol Rep,1993, 11 (4):333-
337.
[12] 王关林 , 方宏筠 . 植物基因工程原理与技术[M].北京 :
科学出版社, 1998:579-605.
[13] 黄晓丹, 张云贵, 应铁进. 高质量植物基因组 DNA 的
提取[J].植物生理学通讯, 2006, 4(2):311-314.
[14] 马明, 杨克强, 郭起荣.改良 CTAB 法提取林木树种基
因组 DNA 的研究[J].生物技术, 2007, 17(3):36-38.
[15] 张鲁杰，夏秀英，徐娜，等 .高效提取越橘成熟组织基
因组 DNA的方法[J].华北农学报，2008（S2）：205-208.
[16] David E R, Jeffrey D V, Amy M E. High -throughput
species identification: From DNA isolation to bioinformatics[J].
Mole Ecol Notes, 2007（7）:199-207.
[17] Galice H, James A C, Wytze T S. A fast and inexpensive
DNA extraction/purification protocol for brown macroalgae [J].
Mole Ecol Notes, 2007（7）：191-193.
[18] Csaikl U M, Bastian H, Brettschneider R. Comparative
analysis of different DNA extraction protocols: a fast, universal
maxi-preparation of high quality plant DNA for genetic evalu－
ation and phylogenetic studies [J]. Plant Mol Biol Rep,1998,
16: 69-86.
[19] Fang G, Hammar S, Grumet R. A quick and inexpensive
method for removing polysaccharides from plant genomic DNA
[J]. Bio Techniques, 1992, 13: 52-56.
[20] Martin M P, Winka K. Alternative methods of extracting
and amplifying DNA from lichens [J].Lichenologist, 2000, 32
(2):189-196.
[21] Proberki S, Bailey L G, Baum R B. Modifi cation of a
CTAB DNA extraction protocol for plant containing high
polysaccharide and polyphenol components [J]. Plant Mol Biol
Rep, 1997, 12:8-15.
[22] Dabo S M, Mitchell E D. A method for the isolation of
nuclear DNA from cotton (Gossypium) leaves [J]. Annual
Biochem,1993, 210:34-38.
[23] Barnwell P, Blanchard A, Bryant J, et al. Isolation of
DNA from the highly mucilaginous succulent plant Sedum
telephium[J].Plant Mol Biol Rep, 1998, 16:133-138.
·4·