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芫荽遗传多样性RAPD分析



全 文 :北方园艺2014(15):97~100 ·生物技术·
第一作者简介:李小梅(1982-),女,硕士研究生,农艺师,现主要从
事辣椒及芫荽栽培与育种等研究工作。E-mail:eileen828@
126.com.
责任作者:张景涛(1963-),男,硕士,研究员,现主要从事蔬菜育种
等研究工作。E-mail:chili@126.com.
收稿日期:2014-02-10
芫荽遗传多样性 RAPD 分析
李 小 梅,张 立 微,张 景 涛
(哈尔滨市农业科学院 蔬菜花卉分院,黑龙江 哈尔滨150029)
  摘 要:以96份芫荽为试材,采用RAPD分析方法,研究了芫荽种质资源遗传多样性。结果
表明:从300条随机引物中筛出23条扩增性强、清晰度高和稳定性好的引物,扩增出53条带,其
中34条为多态性带,多态性比例64.2%。通过聚类分析,生成96份芫荽亲缘关系树状图,在遗
传距离0.50处,试材划分为6类。RAPD分析揭示了芫荽的遗传背景并为其分类提供了依据。
关键词:芫荽;RAPD;遗传多样性
中图分类号:S 573+.2 文献标识码:A 文章编号:1001-0009(2014)15-0097-04
  芫荽(Coriandrum sativum)属伞形科一二年生草本
绿叶蔬菜,耐寒,喜冷凉忌炎热,芫荽可四季栽培,春秋
两季栽培品质好,是重要的蔬菜和调味料[1]。芫荽叶、
根、茎、籽均可入药,可治麻疹,食物积滞,感冒风寒
等症[2-3]。
种质资源是遗传育种和品种改良的基础[4]。分子
标记是种质资源亲缘关系及检测其多样性的有效工
具[5]。遗传多样性是物种长期进化的结果,也是培育优
良品种的基础[6]。芫荽研究在我国集中在种植、成分分
离和功能验证方面,而在分子水平上研究芫荽遗传多样
性在国内外鲜见报道。Lo′pez等[7]利用AFLP分子标
记技术对芫荽进行了遗传多样性及聚类分析。DNA分
子标记的发展及应用,为种质资源遗传多样性的研究提
供了更多手段[8]。RAPD方法简便、灵敏、费用低,可以
检测到大量多态位点,已被广泛地用于遗传多样性分
析[9]。该研究利用RAPD分子标记对芫荽遗传多样性
进行分析,确定其亲缘关系,以期为品种选育、生产加
工、资源研究及保护提供理论依据[10]。
1 材料与方法
1.1 试验材料
以2009、2010年在哈尔滨市农业科学院试验基地
种植的96份芫荽为试验材料,材料名称及来源详见
表1。
供试仪器:PCR 仪(Eppendorf公司),离心机
(Eppendorf公司Centrifuge 5804R),紫外分光光度计(日
本岛津公司 UV-2550),电泳仪(北京六一厂DYY-11
型),凝胶成像分析系统(北京赛智创业科技有限公司
ChampGel 6000),水浴锅,超低温冰箱,Eppendorf微量移
液器。
供试药剂:dNTP购自天泽基因工程有限公司,
Bufer(10×PCR Bufer)、Taq DNA聚合酶购自北京鼎
国昌盛生物技术有限责任公司;RNaseA、DNA Marker
DL 2000购自宝生物公司;随机引物购自上海生工;
CTAB、EDTA、Tris、HCl、NaCl、PVP、β?巯基乙醇、无水乙
醇、氯仿、异戊醇等均为国产分析纯试剂。
1.2 试验方法
1.2.1 基因组DNA的提取 采用CTAB法提取芫荽
总DNA。
1.2.2 引物的筛选 从300条随机引物中筛选出多态
性高的引物做3次重复。
1.2.3 基因组DNA的扩增和电泳检测 扩增体系为:
总体积20μL,模板DNA浓度1.0ng/μL,dNTP浓度

    
dinucleotide,trinucleotide and tetranucleotide repeat motifs,and the total ratio was 83.3%.The proportion of pentanucle-
otide and hexanucleotide was low,with the ratio of 16.7%.The average lengths of dinucleotide to hexanucleotide repeat
motifs were 21,15,14,16,20bp respectively.The PCR products can be amplified by 81of total 82designed self designed
SSR primers successfuly,and the maximal polymorphism was 48.1%.The results showed that the distribution of SSR in
melon genome was relative stable,and it is helpful for future work in SSR and ISSR.
Key words:melon;genome;SSR;distribution;polymorphism
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·生物技术· 北方园艺2014(15):97~100
  表1 材料名称及来源
  Table 1 Names and origin of materials
种质代号
Germplasm code
名称
Name
来源
Origin
种质代号
Germplasm code
名称
Name
来源
Origin
1 Ames18563 法国 49 Cori286 阿塞拜疆
2 Ames18565 德国 50 Cori289 俄国
3 Ames18568 意大利 51 Cori29 亚美尼亚
4 Ames18594 英国 52 Cori292 荷兰
5 Ames18595 罗马尼亚 53 Cori293 荷兰
6 Ames20047 亚美尼亚 54 Cori313 阿塞拜疆
7 Ames21655 俄国 55 Cori316 乌兹别克斯坦
8 Ames24907 保加利亚 56 Cori317 哈萨克斯坦
9 Ames24909 保加利亚 57 Cori318 哈萨克斯坦
10 Ames24915 美国 58 Cori322 乌兹别克斯坦
11 Ames24927 前苏联 59 Cori349 前苏联
12 Ames25696 叙利亚 60 Cori365 阿塞拜疆
13 Cori139 叙利亚 61 Cori37 格鲁吉亚
14 Cori138 叙利亚 62 Cori377 俄国
15 Cori82 叙利亚 63 Cori386 乌兹别克斯坦
16 Cori87 叙利亚 64 Cori387 乌兹别克斯坦
17 Cori86 叙利亚 65 Cori389 越南
18 Cori136 叙利亚 66 Cori401 亚美尼亚
19 Cori140 叙利亚 67 Cori406 泰国
20 Cori356 美国 68 Cori247 荷兰
21 Cori147 伊朗 69 Cori246 日本
22 Cori115A 苏丹 70 Cori245 日本
23 Cori85 叙利亚 71 Cori244 日本
24 Cori71 格鲁吉亚 72 Cori237 荷兰
25 Cori70 格鲁吉亚 73 Cori236 荷兰
26 Cori68 格鲁吉亚 74 Cori23 俄国
27 Cori66 亚美尼亚 75 Cori222 亚美尼亚
28 Cori64 格鲁吉亚 76 Cori220 俄国
29 Cori57 塔吉克斯坦 77 Cori217 格鲁吉亚
30 Cori54 格鲁吉亚 78 Cori192 荷兰
31 Cori455 前苏联 79 Cori174 叙利亚
32 Cori45 格鲁吉亚 80 Cori161 亚美尼亚
33 Cori446 阿塞拜疆 81 Cori160 哈萨克斯坦
34 Cori44 格鲁吉亚 82 Cori158 哈萨克斯坦
35 Cori429 亚美尼亚 83 Cori157 哈萨克斯坦
36 Cori425 格鲁吉亚 84 Cori152 格鲁吉亚
37 Cori422 格鲁吉亚 85 Cori151 格鲁吉亚
38 Cori42 格鲁吉亚 86 Cori148 埃塞俄比亚
39 Cori41 格鲁吉亚 87 Cori146 格鲁吉亚
40 Cori409 泰国 88 Cori143 埃塞俄比亚
41 Cori408 泰国 89 Cori142 埃塞俄比亚
42 Cori407 泰国 90 Cori134 叙利亚
43 Cori248 荷兰 91 Cori112 塔吉克斯坦
44 Cori250 前苏联 92 Cori108 格鲁吉亚
45 Cori257 荷兰 93 Cori106 格鲁吉亚
46 Cori272 阿塞拜疆 94 Cori104 格鲁吉亚
47 Cori281 叙利亚 95 Cori102 格鲁吉亚
48 Cori285 亚美尼亚 96 Cori101 格鲁吉亚
0.45mmol/L,随机引物浓度1.3μmol/L,Taq 酶浓度
0.6U,Mg2+浓度2.0mmol/L。热循环程序:94℃预变
性4min,40个循环(94℃变性30s,39℃退火30s,72℃
延伸90s),72℃延伸10min,在4℃终止反应。产物在
1.5%琼脂糖凝胶上电泳,EB染色,拍照。
1.3 数据分析
RAPD电泳结果采取0/1赋值记带,在相同迁移位
置,有谱带记为1,无谱带记为0,-1表示数据缺失或
无记录,形成0/1矩阵图,用NeiLi公式计算遗传相似
系数及遗传距离,采用离差平方和、Ward法进行聚类
分析。
2 结果与分析
2.1 PCR扩增结果
在300条随机引物中筛选出23条扩增性强、清晰
和稳定的引物(表2),共扩增53条带,其中34条为多态
性条带,多态性比例为64.2%。如引物S509扩增图谱
(图1)。
表2 RAPD引物及序列
  Table 2 RAPD primers and sequence
引物
Primer
序列
Sequence
引物
Primer
序列
Sequence
S1 GTTTCGCTCC  S183 CAGAGGTCCC
S21 CAGGCCCTTC  S507 ACTGGCCTGA
S24 AATCGGGCTG  S509 TGAGCACGAG
S29 GGGTAACGCC  S1260 ACATCAGCCC
S30 GTGATCGCAG  S2003 GTGCGAGAAC
S31 CAATCGCCGT  S2006 GGACGACCGT
S43 GTCGCCGTCA  S2007 GGGTCGCATC
S45 TGAGCGGACA  S2008 CCACAGCCGA
S52 CACCGTATCC  S2020 GAGCGCTACC
S167 CAGCGACAAG  S2025 GGGCCGAACA
S169 TGGAGAGCAG  S2029 AGGCCGGTCA
S177 GGTGGTGATG
2.2 聚类分析
相似系数越高,种质间的遗传变异越低,亲缘关系
越近;反之,亲缘关系越远。采用NeiLi公式计算相似系
数和遗传距离,结果表明,96份芫荽相似系数在0.32~
0.90之间,平均为0.62;遗传距离在0.10~0.71之间,
平均为0.38。其中Cori101和Cori41的相似系数0.32,
亲缘关系远;Cori115A和Cori54相似系数0.90,亲缘关
系近。96份材料具有丰富的遗传多样性。
通过遗传距离、离差平方和、Ward法进行聚类分
析,生成芫荽亲缘关系树状图(图2)。在遗传距离
0.50处,供试材料被分为6个类群。最有特点的为第Ⅰ
类群:3~15片叶,平均叶长10~20cm,分枝少,果实千
粒重6.0~12.0g,适于果用;第Ⅳ类群:生育期长,基生
叶片数20~45片,最长基生叶长25~40cm,叶形为两
回或多回羽状复叶,叶丛匍匐,分枝多,适合于叶用。
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北方园艺2014(15):97~100 ·生物技术·
图1 引物S509扩增结果
M:DNA分子量标准DL 2 000。品种编号见表1。
Fig.1 The amplification result of primer S509
M:DL 2 000DNA marker.The materials No.as in table 1.
3 讨论与结论
遗传资源保存和品种资源目录的建立都依赖对其
遗传多样性及亲缘关系的掌握[11]。该研究选用筛选的
23条RAPD引物对96份芫荽种质进行检测,共扩增53
条带,其中34条为多态性条带,多态性比例为64.2%,
通过严格控制反应体系和条件,得到重复性好的扩增结
果,明确了芫荽种质间的遗传距离,RAPD分子标记可
以有效的揭示芫荽种质资源的遗传多样性,并为芫荽育
种提供准确的遗传信息。
物种遗传多样性越高,对环境变化的适应能力就越
强,进化的潜能就越大[12],该研究中选用的96份芫荽种
质资源具有丰富的遗传多样性与宽广的遗传基础,可以
利用其优良变异类型,创造新的变异,选育优良品种。
该研究在遗传距离0.50处,将96份芫荽分为6个
类群,分类与来源地不具有一定的相关性,说明种质资
源间的亲缘关系与来源地之间的关系不密切,这可能与
种质资源的交换和广泛的遗传变异有关。
参考文献
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·生物技术· 北方园艺2014(15):97~100
图2 96份芫荽品种的Nei’s遗传距离矩阵聚类图
Fig.2 Dendrogram of cluster analysis for 96coriander germplasm based on Nei’s distance
[11]Bendhifi M,Baraket G,Zourgui L,et al.Assessment of genetic diversity
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RAPD Analysis of Genetic Diversity for Coriander
LI Xiao-mei,ZHANG Li-wei,ZHANG Jing-tao
(Vegetables and Flowers Research Institute,Harbin Academy of Agricultural Sciences,Harbin,Heilongjiang 150029)
Abstract:Taking 96coriander samples as materials,using the RAPD analysis method,the genetic diversity of germplasm
resources of coriander was studied.The results showed that 23random primers were screened from 300primers that were
amplification of strong,high resolution and good stability.34bands were polymorphic among 53bands identified.The
percentage of polymorphic loci was 64.2%.Al the germplasm could be divided into six categories at the genetic distance
0.50by cluster analysis.RAPD analysis reflected the complex genetic background and provided the supporting to the
identification and classiflcation of coriander.
Key words:Coriandrum sativum;RAPD;genetic diversity
001