全 文 :天竺桂叶精油抗氧化活性的体外评价
黄建新1,黄晓冬2,蔡建秀2,刘永春2
摘要: 目的 测定评价天竺桂叶精油(CJO)的抗氧化活性。 方法 以水蒸汽蒸馏法提取CJO,采用还原铁
离子体系、二苯代苦肼自由基(DPPH·)体系、羟基自由基体系、抗脂质体过氧化体系等体外测定评价该精油的抗
氧化活性。 结果 较高浓度的天竺桂叶精油表现出一定的还原力,其清除DPPH·自由基、羟基自由基的半效
应浓度分别为23.29,1.45mg/mL;15mg/mL浓度时对卵磷脂质体过氧化的抑制率>50%。 结论 CJO有一
定的抗氧化活性。
关键词: 油类,挥发;植物;氧;自由基
中图分类号: R282.71;R977.6;R852.15 文献标识码: A 文章编号: 1672-4194(2013)01-0029-05
收稿日期:2012-06-11
基金项目:福建省科技厅高校专项资助课题(JK2009042)
作者单位:1.福建医科大学 附属第二医院骨科,泉州 362000;
2.泉州师范学院,泉州 362000
作者简介:黄建新(1971-),男,副主任医师.Email:fuzhoufulin@
163.com
自由基又称游离基,是指外层轨道含有不成对
电子的原子、原子团或特殊状态的分子。机体内,
自由基可通过内源途径即一些代谢途径自发产生,
也可在外源因素如电离辐射、紫外照射、污染物等
作用下诱发产生,过多的自由基会自动地形成链式
反应,从而造成生物大分子的氧化损伤,改变细胞
器的生物学特征,引起细胞衰老,造成免疫失调、恶
性肿瘤等多种疾病[1]。为了保护细胞免受或减缓自
由基引发的氧化损伤,一些外源性抗氧化剂如2,6-
二叔丁基对甲酚(BHT)、没食子酸丙酯(PG)被广
泛应用于食品与药品以清除体内过剩的自由基,但
自20世纪70年代以来,人工合成的抗氧化剂陆续
被发现具有一定的毒性、致畸与致癌作用,因而,从
动植物等生物资源中寻找与开发高效、无毒、安全
的天然抗氧化剂成为研究的热点[2-5]。
天竺桂(Cinnamomum japonicumSibe)为樟科
樟属的常绿乔木,在我国分布广泛,全株含精油,叶
精油含量约为0.25%~0.6%,主要含有冰片、匙叶
桉油烯醇等多种化学成分[6-7]。已有研究发现,该精
油具有明显的抑菌作用、抗炎活性与杀蚊效果[6-9]。
本研究运用多种化学模型体系检测天竺桂叶精油
(CJO)的抗氧化活性,为开发CJO作为天然抗氧化
剂提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 精油制备 天竺桂叶于2011年3月采自福建
省泉州市区,洗净后阴干,磨成粉末,过80目(孔径
180μm)筛。以水蒸汽蒸馏法充分提取CJO,配成
质量浓度100mg/mL母液(以甲醇助溶)备用。
1.2 方法
1.2.1 还原铁离子能力的测定 参照文献[10-11]
的方法略有修改。取0.25mL不同浓度的天竺桂
精油样液,加入2.5mL 0.2mol/L pH 6.6的磷酸
盐缓冲液和2.5mL 1% K3Fe(CN)6,混匀后50℃
水浴反应20min。冰浴冷却后,加入2.5mL 10%
的三氯乙酸(TCA),4 800r/min离心10min,取上
清液5mL,加入5mL去离子水和1mL 0.1%
FeCl3,混匀静置反应,反应时间以反应体系吸光度
达到最高时为准,测定700nm处的吸光度。同时
以维生素C(VitC)、BHT、PG和槲皮素(Qu)为阳性
对照,以蒸馏水作参比。平行样均为3个,以吸收度
大小表示还原能力的大小,吸收度越高表明还原物
质越多,还原力越强。
1.2.2 DPPH·自由基清除能力的测定 参照文
献[12]等的方法略加修改。分别取200μL各浓度
测试 样 液 与 4 mL 浓 度 为 6×10-5 mol/L 的
DPPH·甲醇液混合摇匀静置,反应时间以反应体
系吸光度稳定为准,于波长517nm处测定吸光度
As;以200μL甲醇代替样液测空白对照 A0;考虑样
液本身的颜色,测样液本底值 Ab。以 VitC、BHT、
PG及Qu为阳性对照,以甲醇为参比。平行样为3
个。DPPH·自由基清除率计算方法:
D/%=[1-(As-Ab)/A0]×100%
1.2.3 羟基自由基清除能力的测定 参照文献
[13]的方法略加修改。在一系列10mL具塞比色
管中分别加入2×10-5 mol/L结晶紫溶液1.4mL、
5×10-3 mol/L FeSO4溶液1.0mL、1% H2O2溶液
0.4mL、pH 5.5的Tris-HCl溶液1.0mL,用重蒸
水定容到10mL并摇匀,放置5min后,在波长588
92
福建医科大学学报
J Fujian Med Univ 2013February
,Vol 47No 1
nm处测定吸光度 A0,同时测定不加 H2O2时588
nm处的吸光度A,则羟基自由基的产生量用ΔA=
A-A0表示。在反应总体积为10mL的体系中,加入
2.0mL各浓度测试样液后,测得测试样吸光度As;
以BHT、PG为阳性对照。平行样均为3个。
羟基自由基清除率:
D/%=(As-A0)/(A-A0)×100%
1.2.4 抗脂质体过氧化作用的测定 参照文献
[14-15]方法略加修改。取300mg卵磷脂溶解于
30mL 0.01mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲液PBS,
冰浴磁力搅拌数分钟,形成脂质体 PBS分散系
(LLS),冰浴保存备用,依次取 LLS、样品、0.4×
10-3 mol/L FeSO4 溶液各0.2mL,并用0.01mol/L
pH 7.4的磷酸盐缓冲液PBS补足至3mL,混匀后
避光37 ℃水浴60min;再加入2mL三氯乙酸
(TCA)-硫代巴比妥酸(TBA)-盐酸(HCl)混合液
(15g TCA、0.375g TBA与2.1mL浓盐酸依序放
入100mL重蒸水中),100℃水浴15min,冰浴急
速冷却,用重蒸水补足至5mL后以4 000r/min离
心10min,取上清液在波长532nm处测样品管吸
光度As;空白管以0.2mL重蒸水代替样品,操作方
法同样品管,测得空白管吸光值 A0;同时考虑样液
的颜色,测样液本底值 Ab,以 Qu,BHT为阳性对
照。平行样3个。
脂质过氧化抑制率计算:
I/%=[A0-(As-Ab)]/A0×100%
1.3 统计学处理 数据采用 Excel 2007、SPSS
Statistics V17.0等软件进行统计分析与处理。
2 结 果
2.1 还原铁离子的能力 质量浓度为15mg/mL
的CJO样液在还原铁离子反应体系中反应稳定约
历时50min,此时吸光值处于高峰,可表征出该精
油的最大还原力;同法确定出 BHT、PG、Qu与
VitC的最佳反应时间分别为30,10,25,30min
(图1)。
CJO与阳性对照BHT、PG、Qu、VitC的还原铁
离子能力均随着浓度的增加而增强,且量效关系存
在明 显 的 线 性 相 关,其 中 CJO 在 质 量 浓 度
15mg/mL时的吸光度为1.323,30mg/mL时吸光
度为2.301,在实测浓度(5~30mg/mL)时量效关
系拟合线性方程为y=0.070 3x+0.184 4(R2
=0.991 9,P<0.01),由此计算欲达到吸光度为
1.500所需的CJO浓度为18.71mg/mL,与阳性对
照BHT的1.22mg/mL、PG 的0.42mg/mL、Qu
的0.44mg/mL和 VitC的0.60mg/mL相当(图
2,3)。
图1 天竺桂叶精油(CJO)还原铁离子的反应动力学曲线
Fig 1 Reaction kinetics curve of reduced iron of CJO
图2天竺桂叶精油的还原力
Fig 2 Reducing power of CJO
图3 没食子酸丙酯(PG)、2,6-二叔丁基对甲酚
(BHT)、槲皮素(Qu)与维生素C(VitC)的
还原力
Fig 3 Reducing power of PG,BHT,Qu and VitC
2.2 清除DPPH·自由基清除的能力 反应动力
学研究发现,相比于 Qu,VitC,BHT,PG等阳性对
照,质量浓度为40mg/mL的CJO对DPPH·自由
基的清除相对较为温和,反应时程较长,在120min
时反应趋于稳定(图4)。
实验测得不同质量浓度的CJO静置反应120
min后对DPPH·自由基清除率表明,CJO的清除
率随样品质量浓度的增加而增大,在50mg/mL样
液浓度时,清除率可达92.22%,量效关系满足线性
03 福建医科大学学报 2013年2月 第47卷第1期
回归方程y=1.414x+17.07(R2=0.980,P<0.01,
线性范围为5~50mg/mL)。若以清除50%DPPH·
自由基所需样品浓度EC50(半效应浓度)定义评价
精油的抗氧化水平,CJO 的EC50为23.29mg/mL
(图5)。
图4 天竺桂叶精油(CJO)、没食子酸丙酯(PG)、2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)、槲皮素
(Qu)与维生素C(VitC)清除二苯代苦肼自由基DPPH·自由基的反应动力学曲线
Fig 4 Reaction kinetics curve of DPPH·scavenging of CJO,PG,BHT,Qu and VitC
图5 天竺桂叶精油 (CJO)对二苯代苦肼自由基
DPPH·自由基的清除作用
Fig 5 Scavenging effects on DPPH·radical of CJO
2.3 清除羟基自由基的能力 CJO对羟基自由基
的清除作用随样液浓度的增加而增强,量效关系具
有明显的线性相关。在质量浓度2.2mg/mL时,对
羟基自由基的清除率可达94.36%,其半效应浓度
EC50为1.45mg/mL,相当于0.59mg/mL BHT与
0.86mg/mL PG的抗氧化功效(图6)。
2.4 抗脂质体过氧化的作用 CJO对卵磷脂质体
过氧化的抑制率随着CJO浓度增加而增加,在质量
浓度15mg/mL时抑制率>50%,25mg/mL时抑
制率达到71%(表1)。
表1 CJO与BHT的抗卵磷脂质体过氧化作用
Tab 1 Inhibitory effects on lipid peroxidation of CJO
and BHT
试样 ρ样液质量浓度/(mg·mL-1) 抑制率/%
CJO 5 12.64±3.20
10 43.41±2.10
15 57.50±5.64
20 63.30±1.59
25 71.19±2.24
BHT 0.006 35.70±0.75
0.012 60.69±0.58
0.025 75.04±1.03
0.05 87.67±0.46
CJO:天竺桂叶精油;BHT:2,6-二叔丁基对甲酚.
图6 天竺桂叶精油(CJO)、2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)、没食子酸丙酯(PG)对羟基
自由基的清除作用
Fig 6 Scavenging effects on hydroxyl radical of CJO,BHT and PG
13黄建新等:天竺桂叶精油抗氧化活性的体外评价
3 讨 论
3.1 天竺桂叶精油的抗氧化能力评价 检测与评
价某种物质的抗氧化活性主要涵盖抑制脂质的氧
化降解、清除自由基、抑制促氧化剂(如螯合过渡金
属)和还原能力等几方面[16]。这说明了抗氧化反
应的多样性和复杂性,因而,没有一种单一的方法
足以全面评价一种物质的抗氧化性能[4]。本实验采
用还原铁离子能力、DPPH·自由基清除法、结晶紫
分光光度法测定羟基自由基清除能力与抗卵磷脂
脂质体过氧化法等化学模型体系体外评价CJO的
抗氧化活性。
还原力是表征抗氧化活性的常用指标,还原力
越大,其抗氧化性越强[17]。本实验发现,CJO具有
一定的还原能力,在质量浓度18.71mg/mL时,其
还原铁离子能力与1.22mg/mL的强抗氧化剂
BHT、0.42mg/mL的PG、0.44mg/mL的 Qu与
0.60mg/mL的Vitc相当。
DPPH·自由基是一种人工合成的、稳定的、可
以长时间保存的含氮自由基,当有抗氧化剂存在
时,DPPH·的特征紫色会褪色,其褪色程度表征出
抗氧化剂的清除自由基能力。由于DPPH·自由基
反应体系具有简便、快速、重复性好等特点,因而广
泛应用于自由基清除剂的筛选与测定纯抗氧化剂
或植物提取物的体外抗氧化活性[18]。本实验测得
CJO清除DPPH·自由基EC50为23.29mg/mL,较
强于大叶石龙尾叶精油(EC50为29.98mg/mL)[19],
与本实验所测得质量浓度为0.05mg/mL的 VitC,
0.04mg/mL的Qu,0.1mg/mL的BHT,0.02mg/
mL的PG等已知抗氧化剂的DPPH·自由基清除
效应相当。实验还发现CJO清除DPPH·自由基
的反应过程较慢,由于与DPPH·自由基的反应能
力与速度取决于物质提供质子的能力,CJO的EC50
与反应时间说明了该精油成分提供质子的机制较
为复杂。
羟基自由基是氧化过程中间反应产生的不稳
定的自由基,也是生物体内危害最大、活性最强的
自由基,因而,羟自由基清除率是反映测试样抗氧
化作用的重要指标[13]。由于结晶紫的高电子云密
度的-C=C-基团会与羟基自由基发生亲电加成反
应,从而使结晶紫褪色,因而,观测反应体系的颜色
变化可以表征样品的羟基自由基清除能力,该测定
方法具有简便,反应迅速等特点。本实验发现,CJO
具有较强的羟基自由基清除能力,EC50为1.45
mg/mL。
脂质过氧化反应是由于自由基与生物膜的磷
脂、酶和膜受体相关的多不饱和脂肪酸的侧链及核
酸等大分子物质发生作用而产生,反应所形成的脂
质过氧化产物会影响细胞膜的流动性和通透性,导
致细胞病变。因而,脂质体过氧化反应的抑制率同
样可用于评价样品的自由基清除能力与抗氧化活
性。在抗卵磷脂质体过氧化反应体系中,脂质过氧
化反应抑制率随CJO浓度的提高而增大,呈现一定
的量效关系,在质量浓度15mg/mL时的脂质过氧
化反应抑制效应与0.01mg/mL BHT相当,而醇溶
性的BHT是脂质体系中公认的强抗氧化剂[12],提
示较高浓度的 CJO 具有较强的抗脂质体过氧化
作用。
3.2 天竺桂叶精油的抗氧化效能分析与成分推测
由于植物精油是不同化学成分的混合体,各种成
分的抗氧化作用往往表现不一,其中一些没有抗氧
化活性的成分甚至是促氧化成分会干扰或减弱精
油的总抗氧化功效。研究指出,精油中的β-石竹烯、
异石竹烯等倍半烯类具有一定的自由基清除能力,
但反应速度缓慢;酚羟基组分比醛类和醇类羟基组
分具有更强的自由基清除能力,一些组分如橙花叔
醇、芳樟醇等表现出一定的促氧化性质[12]。结合有
关CJO化学成分组成的研究报道[6-7],本研究初步
推测该精油较高含量的冰片、匙叶桉油烯醇、石竹
烯等是其可能的抗氧化组分,但同时CJO中也存在
着一些氧化成分如橙花叔醇等。这也是相比于单
体型的抗氧化剂,CJO往往需要较高浓度时才体现
较强的抗氧化活性的原因。但单体型抗氧化剂对
各种自由基的敏感性往往有所差异,即对一些自由
基清除有效,对另一些自由基可能没有清除效果,
而CJO的复合性、具有多种抗氧化成分使其在还原
铁离子体系、DPPH·自由基体系、羟基自由基体
系、抗脂质体过氧化体系中均表现较强的抗氧化
性,提示其抗氧化效能较为全面。
由于天竺桂叶资源丰富,精油含量高且提取方
便,后续的研究有待将CJO进行组分改造,并与其
它化合物或天然抗氧化剂配伍组合,提高其高效性
与安全性,从而开发出新型的天然复合型抗氧化剂。
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In vitro Evaluation of Antioxidant Activities of the Essential
Oil from the Leaves of Cinnamomum japonicum
HUANG Jianxin1,HUANG Xiaodong2,CAI Jingxiu2,LIU Yongchun2
1.Dapartment of Orthopedics,The Second Afiliated Hospital of Fujian Medical University,Quanzhou 362000,China;
2.Quanzhou Normal Colege,Quanzhou 362000,China
ABSTRACT: Objective To determinate and evaluate the antioxidant activities of the essential oil
fromCinnamomum japonicumleaves(CJO). Methods CJO was extracted by steam distilation,and its
antioxidant activities were investigated by the methods in vitro of reducing power systems,1,1-diphenyl-2-
picrylhydrazyl(DPPH )radical scavenging systems,hydroxyl radical scavenging systems,lipid peroxida-
tion inhibiting systems. Results The higher concentration CJO showed stronger reducing power and an-
tioxidant potencies,its semi-effective concentration(EC50)of DPPH and hydroxyl radicals scavenging were
about 23.29mg/mL,1.45mg/mL respectively,and at 15mg/mL the inhibition rate of anti-lipid peroxida-
tion was above 50%. Conclusion CJO had some antioxidant activity.
KEY WORDS: oils,volatile;plants;oxygen;free radicals
(编辑:常志卫)
33黄建新等:天竺桂叶精油抗氧化活性的体外评价