全 文 ：收稿日期:2005-05-11。
作者简介:毛堂芬(1970～ ),女 ,助理研究员;主要从事植物细胞和组织
培养方面的研究工作。
少花桂愈伤组织诱导的初步研究
毛堂芬 黄先群
(贵州省农业科学院生物技术研究所 贵阳 550006)
摘要:以 MS为基本培养基 , 利用少花桂未成熟种胚作外植体 ,
研究了外植体大小 、不同培养方式及激素配比对少花桂愈伤组
织的诱导。结果表明:大于 5mm的种胚较易获得愈伤组织;诱
导愈伤组织的较佳培养基为 MS+2mg/L2, 4-D+2%蔗糖 +
5g/L活性炭 , 在黑暗条件下采用液体悬浮培养 ,其最高诱导率
达 64.3%, 得到黄色的愈伤组织 ,质地好。
关键词 少花桂 未成熟种胚 愈伤组织诱导
少花桂(Cinnamomumpauciflorum)属樟科樟属多
年生常绿小乔木 ,又名岩桂 、香桂 、三条筋等。主要分
布在我国湖南 、湖北 、四川 、云南 、贵州 、广西及广东等
地 。其枝叶的黄樟油素 (safrole)含量达鲜质量的
3.5%,是合成洋茉莉醛等多种香料的前体 ,主要用于
食品 、香烟 、化妆品及电镀工业;制药工业上常用来合
成黄连素 、多巴胺 、肾上腺素 、欧必宁和柯拔西等药物。
同时 ,少花桂树皮和根还可以入药 ,用作官桂皮 ,具有
开胃健脾 、通气散热之功效 ,还可治肠胃病和腹痛 [ 1] 。
黄樟油素自 1827年开发利用以来 ,一直呈供不应求的
趋势。近 20年来 ,价格增长了 10余倍。过去是从黄
樟等植物的根提取黄樟油素 ,由于这类植物生长周期
长 ,黄樟油素含量低 ,挖根又意味着伐树 ,产量受到限
制 。目前 ,少花桂已是猴樟和黄樟等植物根提取黄樟
油素的理想替代品 [ 2] 。由少花桂枝叶提取的香桂油
中黄樟油素纯度可高达 95%[ 1] ,可作为黄樟精油直接
用于出口。少花桂树势强 、生长快 、适应性强 ,可以仅
收叶 、不毁树 ,对植树造林 、绿化荒山 、防止水土流失 、
保护生态环境具有重要意义 。少花桂通常用扦插繁
殖 , 2 ～ 3年生枝条的成活率可达 66%左右 , 1年生和 4
年生的插枝成活率低 ,这就大大限制了少花桂的发展。
为了提供大规模生产栽培用种苗 ,我们已采用成熟种
子作外植体进行组培成苗研究 ,但繁殖系数偏低 [ 3] 。
应用植物细胞大量培养技术生产黄樟油素不受资源 、
地区 、季节等自然条件的限制 ,且周期短 ,便于工业化
生产。愈伤组织的诱导是快速繁殖和利用细胞大量培
养生产黄樟油素的基础。本文拟利用未成熟种胚作外
植体 ,进行了愈伤组织的诱导研究 ,为进一步分化成丛
生芽或进行高产黄樟油素细胞株选育 ,细胞悬浮培养
生产黄樟油素提供材料 ,为生产黄樟油素开辟一条新
的途径 。目前尚未见这方面的报道。
1 材料与方法
1.1 供试材料
少花桂未成熟种子种胚。采集的少花桂未成熟种
子用保鲜袋封装好 ,置 4℃冰箱保存 4 ～ 7d。
1.2 试验方法
1.2.1 诱导培养基
以 MS为基本培养基 , 附加 2%蔗糖 , 0.7%琼脂
粉 , 5g/L活性炭及不同种类和浓度的植物激素 ,
pH5.8。液体悬浮培养不加琼脂粉。培养基分装到
100ml三角瓶中 ,每瓶 40ml,高温高压灭菌 ,冷却后备
用 。
1.2.2 外植体处理和接种
取出保存在 4℃冰箱中的未成熟种子 ,先用清水
冲洗干净 ,沥干水分 ,装入 250ml三角瓶中 。在超净
工作台上 ,倒入 75%的乙醇溶液振荡灭菌 30s,然后用
10%的次氯酸钠消毒灭菌 25min,再用无菌水反复洗 4
次 ,在无菌滤纸上吸干水分。用无菌的解剖刀纵切开
种皮 ,用灭菌后的镊子取出里面的未成熟胚 ,接种于配
制好的培养基上 。每处理接种 15瓶 ,每瓶接种 5个外
植体。培养 20d后统计出愈率。出愈率(%)=(产生
愈伤组织的外植体数 /接种的外植体总数)×100。
1.2.3 培养条件
固体培养:培养室温度(25±2)℃,光照强度 2 000
lx,光照时间为 14h/d;
液体悬浮培养:暗培养温度(25 ±2)℃,转速 110
r/min。
2 结果与分析
2.1 外植体大小对愈伤组织诱导的影响
未成熟种胚的大小对诱导愈伤组织的效果存在较
大差异 。从表 1可以看出 ,接种在固体培养基上的外
植体大于 5mm的未成熟种胚 ,可以诱导出愈伤组织 ,
·75·
第 24卷第 8期 2005年 8月 种 子 (Seed) Vol.24No.8 Aug. 2005
DOI :10.16590/j.cnki.1001-4705.2005.08.071
但诱导出的淡黄色愈伤组织呈疏松水渍状 ,随后逐渐
褐化死亡。将这种愈伤组织在未褐化前转接到新的培
养基上仍不能正常生长而死亡。小于 5mm的种胚未
能诱导出愈伤组织 ,培养一段时间后渐渐死亡 。
表 1 未成熟种胚大小对愈伤组织诱导的影响
外植体 接种数(个) 污染数(瓶) 成愈数(个) 成愈率(%) 愈伤组织产生情况
>5mm 65 2 40 61.5 淡黄色 、质地疏松 、水渍状
<5mm 60 3 0 0 死亡
2.2 培养方式对愈伤组织诱导的影响
未成熟的种胚接种在固体培养基和液体培养基
上 ,在 7d后子叶明显膨大 ,以后均有愈伤组织产生
(表 2)。但用固体培养基时主要在子叶的边缘形成淡
黄色愈伤组织 ,呈疏松水渍状 ,不能增生和分化不定
芽;而液体悬浮培养产生的愈伤组织呈黄色颗粒状 ,质
地好 ,分散在培养基里 ,这有利于细胞大量培养 。 25d
后将其转接到不加激素的 MS固体培养基 , 20d后愈
伤组织增殖形成较大的黄色细胞团 ,获得较佳的愈伤
组织。
表 2 不同培养方式对愈伤组织的诱导
培养方式 接种数(个) 污染数(瓶)成愈数(个)成愈率(%) 愈伤组织产生情况
固体培养 75 0 50 66.7 淡黄色 、质地疏松水渍状
液体悬浮培养 70 1 45 64.3 黄色 、颗粒状 ,质地好
表 3 不同激素组合对愈伤组织诱导的影响
2, 4-D
(mg/L)
NAA
(mg/L)
接种数
(个)
出愈数
(个)
出愈率
(%)
愈伤组织
生长量
1 0.1 75 40 53.3 少量
1 0.2 75 43 57.3 少量
1 0.5 75 45 60.0 少量
2 0.1 75 50 66.7 少量
2 0.2 75 70 93.3 较多
2 0.5 75 60 80.0 较多
4 0.1 75 50 66.7 少量
4 0.2 75 50 66.7 少量
4 0.5 75 45 60.0 少量
1 0 75 50 66.7 较多
2 0 75 65 86.7 大量
4 0 75 55 73.3 较多
2.3 激素配比对愈伤组织诱导的影响
激素对愈伤组织的诱导起着重要作用 ,适当的激
素配比可以促进愈伤组织的产生(表 3)。接种在固体
培养基上的材料培养 7d后开始膨大 ,随后陆续产生
愈伤组织;培养 20d时产生的愈伤组织最多 ,但多呈
淡黄色疏松水渍状 ,随着培养时间的延长 ,愈伤组织逐
渐褐化死亡 。当激素配比为 2, 4-D2mg/L+NAA
0.2mg/L时 ,每个外植体上都产生较多的愈伤组织。
仅添加 1.0 ～ 2.0mg/L2, 4-D的培养基也能产生较多
的愈伤组织 ,这表明 2, 4-D是诱导少花桂未成熟种胚
产生愈伤组织的主导因素 。若将愈伤组织转接到无激
素的培养基则不能继续生长。
3 讨论
3.1 少花桂未成熟种胚在固体培养基上诱导产生淡
黄色 、疏松 、水渍状的愈伤组织;而在黑暗条件下 ,采用
液体悬浮培养时形成黄色质地好的愈伤组织。证明暗
培养和液体悬浮培养有利于较好愈伤组织的诱导 ,但
培养时间过长 ,易导致死亡 ,这可能与木本香料植物本
身所含物质和添加活性炭吸收了培养基部分营养有
关 。
3.2 外植体在相同的培养基上诱导产生愈伤组织能
力存在差异 ,这可能与外植体本身所含的内源激素浓
度水平差异和对外源激素的反应灵敏性不同有关。
3.3 本试验曾用刚采集的种胚接种培养 ,褐化比较严
重 。在培养基中添加了活性炭 ,并将外植体进行低温
预处理以及黑暗培养 ,有效地抑制和降低了材料的褐
化 。
3.4 在植物组织培养中 ,外植体愈伤组织的形成与外
源激素的作用密不可分 。本实验中 , 2, 4-D是少花桂
愈伤组织诱导的主导因素 ,但过高的浓度对愈伤组织
的诱导存在一定的负效应 。
3.5 光照条件下的固体培养不利于少花桂的愈伤组
织诱导形成 ,可以通过利用未成熟种胚接种于 MS液
体培养基 ,进行暗培养获得较理想的愈伤组织。但该
愈伤组织进一步分化成丛生芽或进行高产黄樟油素细
胞株的选育有待进一步研究。
参考文献
1 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志 [ M] .北
京:科学出版社 , 1980, (31):191 ～ 194.
2 林正奎 ,华映芳.香桂精油成分的研究.植物学报 , 1980, 22
(3):252 ～ 256.
3 黄先群 ,毛堂芬 , 先静缄等.少花桂组织培养离体繁殖初步
研究.贵州农业科学 , 2000, 28(6):50 ～ 51.
4 曹孜义 ,刘国民.实用植物组织培养技术教程 [ M] .兰州:甘
肃科学技术出版社 , 1999.
5 李浚明.植物组织培养教程 [ M] .北京:中国农业大学出版
社 , 2002.
·76·
第 24卷第 8期 2005年 8月 种 子 (Seed) Vol.24No.8 Aug. 2005