全 文 ：J TCVM
年第 2 期2012
Determination of citric acid in Jianwei San by RP-HPLC
JIN Lu-sheng，LI Shu-gang，WANG Deng-lin，SHI Zi-xuan，ZHANG Hong，ZHANG Lei，
WU Sheng-ping，ZHANG Xu
（Gansu Institute of Veterinary Drug and Feed Inspection，Lanzhou Gansu 730030，China）
Abstract：To establish a RP-HPLC method for determination of citric acid in Jianwei San，a reverse-
phase C18 column was used，the mobile phase was 0.5 mol/L ammonium biphosphate solution（adjusted
the pH value to 3.0 with phosphoric acid）and the determination wave length was 210 nm. The results
showed that the linear range of citric acid was 1.0-15.0 μg，the linear equation was Y=67.88X+1.577
（r=0.999 9，n=6），and the average recovery was 97.75% with RSD of 1.62% （n=6）. The method was
simple, fast and suitable for the determination of citric acid in Jianwei San.
Key words：Jianwei San；citric acid；RP-HPLC
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
中药羊踯躅对钉螺浸杀作用及其机理研究
杜小华，赵红梅
（长江大学动物科学学院，湖北荆州 434025）
摘 要：中药羊踯躅有杀虫作用，用羊踯躅进行钉螺浸杀试验，研究其杀螺效果。将水提取
物和乙醇提取物配制成不同浓度的羊踯躅溶液作浸杀钉螺试验，观察钉螺死亡率及羊踯躅对
钉螺软组织中总蛋白和糖原含量的影响，并检测羊踯躅提取液对鱼类的毒性。结果表明，羊踯
躅有较强的杀螺作用，而且对鱼类的毒性不明显。
关键词：羊踯躅；钉螺；机制
中图分类号：S853.74 文献标识码：A 文章编号：1000- 6354（2012）02- 0044- 03
收稿日期：2011-11-21
基金项目：长江大学全国大学生创新性实验基金项目（091048
926）资助
作者简介：杜小华，男，本科在读，动物医学专业。
通讯作者：赵红梅（1965-），博士，教授，主要从事应用分子细胞
生物学研究。
血吸虫病是由日本血吸虫引起的人畜共患寄
生虫病，该病不仅严重危害人类健康，还影响畜牧
业发展。钉螺是血吸虫病传播的唯一中间宿主，消
灭钉螺是控制和阻断吸虫病传播的有效途径，是
防止血吸虫感染的最有效措施之一。目前，化学灭
螺药物对公共卫生造成严重危害，植物灭螺药物
的开发越来越受到人们的关注。2010年 5-8月，笔
者等在血吸虫病重流行区湖北省荆州区太湖港进
行了羊踯躅、蛇床子、苦楝子等药物的灭螺试验。
1 材料及方法
1.1 试验材料
钉螺，采自湖北荆州市太湖港草滩，挑选活力
强、螺龄相仿的成螺备用。鲫鱼，购于荆州水产研
究所，挑选体长约 5 cm健康鲫鱼鱼苗。羊踯躅购
自沙市宏伟药店。
1.2 方法
1.2.1 羊踯躅水煎液制备 称取生药羊踯躅 5 g，
加水 100 mL，浸泡 24 h 后，加热煎煮 3 次，每次
30 min，经绸布过滤，合并煎煮液，离心去沉淀，用
蒸馏水定容至药液浓度为 50 g/L。并做梯度稀释
实
验
技
术
据对 4批样品的测定结果，可将本品含量限度定为
每 1 g含枸橼酸（C6H8O7）不得少于 12.0 mg。
3.3 试验结果表明，该法操作简便、快速、重现性
好，可用于健胃散中枸橼酸的含量测定。
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DOI:10.13823/j.cnki.jtcvm.2012.02.003
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为 2 500、1 250、625、312.5 mg/L 药液，备用。
1.2.2 羊踯躅乙醇提取物制备 分别称取生药羊
踯躅 3份，各 5 g，分别加 30%、50%、70%乙醇适
量, 浸泡提取 48 h，过滤同法连续浸泡提取 3 次，
合并 3 次滤液，常压下用水浴锅 80 ℃蒸馏，分离
出提取液中的有效成分羊踯躅素。用蒸馏水定容
至药液浓度为 50 g/L，备用。
1.2.3 钉螺浸杀试验 在（25±1）℃下，取各试验
组和对照组（疫水）药液 100 mL，分别置于烧杯中
混匀，投放 30 只钉螺于烧杯中，在药液面下 1 cm
处盖上纱网，防止钉螺爬出水面 ,浸泡 48 h，后倾
去药液，用清水冲洗数次，将水吸干，复苏 24 h
后，用清水饲养 2 h。检查钉螺存活情况，并计数。
1.2.4 羊踯躅提取物对鲫鱼鱼苗毒性检测 选取
约 5 cm 的鲫鱼鱼苗 100 尾，随机分为 5 组，每组
20尾。即水提取物组（430 mg/L）、30%（630 mg/L）、
50%（420 mg/L）、70%乙醇提取物组（380 mg/L）、
空白对照组。作用 24、28、96 h 后，分别记录各组
鱼苗死亡数，并计算死亡率。
1.2.5 羊踯躅提取物对钉螺糖原与蛋白质含量
的影响 钉螺随机分为 5 组，每组 20 只，分别用
水提取物组、30%、50%、70%乙醇提取物浸泡
2 d，后取出整个软体组织，称量湿重，烘箱常温烘
干，再称量干重，磨粉，对照组为正常饲养螺。
1.2.6 糖原测定样品制备及测定 取钉螺软体
组织干粉 15 mg，在 10%三氯乙酸溶液中匀浆并定
容至 4 mL，静置过夜，然后以 3 000 r/min 离心
15 min，取上清液 1 mL，加 95%乙醇 5 mL，以
3 000 r/min 离心 20 min。去除上清液，将离心管
倒置 30 min，用 1 mL 双蒸水溶解沉淀物，以此作
为整体糖原制备物。采用蒽酮显色法测定总糖含
量。反应呈现绿色时，用 722分光光度计在 620 nm
处比色，读取光密度值。用葡萄糖作标准曲线。实验
重复 3次，取其平均值。
1.2.7 蛋白质测定样品制备及测定 蛋白质样
品制备与糖原测试样品相同。测试采用 KND-04全
自动凯氏定氮仪，上样量 30 mg。按蛋白质含
量＝6.25×氮含量计算。实验重复 3次，取其平均值。
2 结果
2.1 羊踯躅提取物杀灭钉螺试验结果
羊踯躅水提取物和乙醇提取物杀灭钉螺结果
见表 1、2；对鲫鱼苗毒性试验结果见表 3。
表 1 羊踯躅纯水提取液浸杀钉螺试验结果
Tab.1 Efficacy of Rhododendron molle extracted
by water against Oncomelania
表 2 羊踯躅乙醇提取液浸杀钉螺试验结果
Tab.1 Efficacy of Rhododendron molle extracted
by alcohol against Oncomelania
表 3 不同样品对鲫鱼鱼苗的毒性试验结果
Tab.3 Toxicity of Rhododendron molle on fish
2.2 羊踯躅提取物对钉螺糖原与蛋白质含量影响
钉螺经羊踯躅提取物样品处理 2 d 后，糖原
含量变化见表 4，蛋白质含量变化见表 5。
表 4 羊踯躅处理后钉螺软体组织的糖原含量
Tab.4 Glycogen contents in soft tissue of Onco-
melania soaked with Rhododendron molle
浸杀钉螺死亡率/%
1 2 3 平均
药液浓度/
mg·L-1
2 500
1 250
625
312.5
疫水对照
30
30
30
30
30
100
95
76
48
0
100
86
67
38
0
100
89
71
35
3.3
100
87
69
38
1.1
观察螺
数/只
不同浓度乙醇提取物浸杀钉螺死亡率/%
30 50 70
药液浓
度/mg·L-1
2 500
1 250
625
312.5
对照
30
30
30
30
30
3.3
7.6
0
0
0
3.3
3.3
0
0
4.7
1.1
8.9
00
6.7
0
0
观察螺
数/只
6.7
3.3
0
6.7
00
3.3
0
0
0.3
00
6.7
3.3
6.7
00
5.6
1.1
8.9
0.1
00
3.3
3.3
3.3
00
3.3
6.7
6.7
0.3
100
90
70
43.3
0
100
92.2
73.3
44.4
1.1
累计死亡率/%
24 h 48 h 96 h
样品
水提取液
30%乙醇
50%乙醇
70%乙醇
清水对照
430
630
420
380
--
20
20
20
20
20
0
0
0
0
0
0
0
10
20
0
10
10
30
30
0
样品浓度
/mg·L-1
观察数
/尾
实
验
技
术
羊踯躅提取物 水提取 30%乙醇 50%乙醇 70%乙醇 对照
干粉含量 /%
处理后减少率 /%
11.55
24.16
11.98
21.34
11.17
26.66
10.47
31.25
15.23
- -
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表 5 羊踯躅处理后钉螺软体组织总蛋白含量
Tab.5 Total protein contents in soft tissue of
Oncomelania soaked with Rhododendron molle
3 讨论
由见表 1、2 结果可计算出羊踯躅水提取液杀
灭 钉 螺 的 LC50 =433.33 mg/L，95% 可 信 限 为
360.11-521.39 mg/L，羊踯躅 30%乙醇提取液杀
灭钉螺的 LC50=627.5 mg/L，95%可信限为 507.55-
775.75 mg/L，羊踯躅 50%乙醇提取液杀灭钉螺的
LC50 =425.96 mg/L，95% 可 信 限 为 354.03 -
512.58 mg/L，羊踯躅 70%乙醇提取液杀灭钉螺的
LC50=381.2 mg/L，95%可信限为 320.45-455.66 mg/L。
由该结果可以看出羊踯躅提取液对钉螺有较强的
杀灭作用，其中以 70%乙醇提取物杀灭钉螺的效
果最佳。
由表 4、5 可知，钉螺软组织中的糖原含量显
著降低，水提取液作用钉螺后糖原含量减少率为
24.16%，30%、50%、70%乙醇提取液作用后钉螺
糖原含量减少率分别为 21.34%，26.66%、31.25%，
两者对钉螺的能量代谢都有一定影响，可抑制其
生长。钉螺软组织蛋白质含量也减少，但未发现
蛋白质含量降低率与灭螺活性之间的相关性。
研究结果表明，中药羊踯躅提取液对钉螺有
较强的杀灭作用，以 70%乙醇提取液效果最佳，其
半数致死浓度为 381.2 mg/L。不同样品的羊踯躅
提取液对鲫鱼苗的毒性均不明显，证明羊踯躅对
鱼类无明显危害。
参考文献：
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total coumarins offructus Cnidii on skeleton of
ovariectomized rats[J].Acta Phrmacologica Sinica，
1994，15（6）：528.
羊踯躅提取物 水提取 30%乙醇 50%乙醇 70%乙醇 对照
干粉含量 /%
处理后减少率 /%
40.66
11.53
40.11
12.73
39.43
14.21
40.83
11.16
45.96
- -
Study on the killing efficacy and mechanism of Rhododendron molle on Oncomelania
DU Xiao-hua, ZHAO Hong-mei
（College of Animal Science，Yangtze River University，Jingzhou Hubei 434025，China）
Abstract：The killing efficacy and mechanism of traditional Chinese medicine Rhododendron molle on
Oncomelania was studied. Oncomelania was soaked by different concentration of Rhododendron molle
extracted with water and ethyl alcohol，then the mortality rate and the contents of total protein and
glycogen in soft tissue of Oncomelania were determined，also the toxicity of Rhododendron molle extract
to fish was tested. The results indicated Rhododendron molle could effectively kills Oncomelania and had
no remarkable toxicity to fish.
Key words: Rhododendron molle；Oncomelania；killing efficacy；mechanism
实
验
技
术
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