全 文 ：豹皮樟总黄酮对大鼠佐剂性关节炎的作用及部分机制研究
王婷玉 ,李　俊 ,葛金芳 ,程文明 ,金　涌 ,吕雄文 ,姜　辉 ,赵　斌
(安徽医科大学药学院 ,安徽 合肥　230032)
收稿日期:2007-08-07,修回日期:2007-09-21
基金项目:安徽省科技攻关计划资助项目(No06013134B);安徽省
高等学校省级自然科学研究重点项目(No2006kj095A);
安徽省高等学校青年教师科研项目(No2005jq1095)
作者简介:王婷玉(1982-), 女 ,博士生 , 研究方向:抗炎免疫药理
学 , Tel:0551-5161115, E-mail:wangty1982@sohu.com;
李　俊(1960-),男 ,教授 ,博士 ,博士生导师 ,研究方向:
抗炎免疫药理学 、临床药理学 , 通讯作者 , Tel:0551-
5161001, Fax:0551-5161001, E-mail:lijun@ahmu.edu.cn
中国图书分类号:R-332;R284.1;R392.12;R 684.302.2;
R684.305.31;R977.3;R977.6
文献标识码:A 文章编号:1001-1978(2007)12-1618-06
摘要:目的　研究豹皮樟总黄酮 (totalflavonoidsofLitsea
coreanaLeve, TFLC)对佐剂性关节炎的治疗作用及其机制。
方法　采用福氏完全佐剂诱导大鼠佐剂性关节炎(adjuvant-
inducedarthritis, AA)模型 , 观察 TFLC的抗炎作用;放免法测
定 AA大鼠腹腔巨噬细胞(peritonealmacrophages, PMΥ)中
肿瘤坏死因子 α(tumornecrosisfactor-α, TNF-α)、白细胞介
素 6(interleukin-6, IL-6)的含量;MTT法检测 AA大鼠脾淋巴
细胞增殖反应;HE染色法观察 AA大鼠膝关节病理组织学
变化;免疫组化法观察 AA大鼠膝关节滑膜细胞中基质金属
蛋白酶 9(matrixmetaloproteinases, MMP-9)蛋白表达情况。
结果 TFLC(50、100、200 mg· kg-1)对 AA大鼠的原发性 、继
发性炎症具有明显的抑制作用 , 降低多发性关节炎评分;
TFLC(50、100、200mg· kg-1)可提高 AA大鼠低下的脾淋巴
细胞增殖反应;TFLC(50、100、200 mg· kg-1)有效降低 AA
大鼠 PMΥ产生的 TNF-α、IL-6水平;TFLC(50、100、200mg·
kg-1)改善 AA大鼠膝关节病理损伤;TFLC(50、100、 200 mg
· kg-1)能明显降低 AA大鼠膝关节滑膜细胞中 MMP-9的
蛋白表达。结论　TFLC(50、100、200 mg· kg-1)对 AA大鼠
具有明显的治疗作用 ,抗炎机制可能与调节免疫功能 、减少
细胞因子的生成以及抑制基质金属蛋白酶的蛋白表达有关。
关键词:豹皮樟;黄酮;关节炎
　　豹皮樟(LitseacoreanaLeve),又称老鹰茶 、“白
茶 ”,属樟科 、木姜子属。广泛分布于安徽皖南山区
以及浙江 、河南等地 [ 1] ,是我国南方各民族民间长
期饮用的一种植物代用茶 ,对人体机能 、健康和疾病
治疗有重要作用 [ 2] 。
目前已从豹皮樟中分离出 10多种有效成分 ,其
中主要成分是黄酮类 ,包括山柰酚 、山柰酚-3-O-β-
D-葡萄糖苷及槲皮素 -3-O-β -D-葡萄糖苷 [ 4] 。药理
学实验表明其黄酮类成分具有抗氧化作用 [ 5] 。我
们经过前期研究证明豹皮樟总黄酮是豹皮樟发挥抗
炎作用的有效部位 ,其对二甲苯诱导的小鼠耳肿胀 、
角叉菜胶诱导的大鼠足爪肿胀 、棉球诱导的大鼠肉
芽肿和大鼠佐剂性关节炎具有抑制作用[ 6] ,表明豹
皮樟总黄酮对炎症具有良好的治疗作用 。本文在此
基础上 ,对豹皮樟总黄酮提取方法进行改进 ,以 AA
为模型 ,研究豹皮樟总黄酮对佐剂性关节炎的治疗
作用 ,并对其机制进行探讨。
1　材料
1.1　药物及试剂　豹皮樟总黄酮 , 由安徽医科大
学药学院天然药物化学室研制 。取豹皮樟干燥叶 ,
乙醇提取 ,减压浓缩 ,水溶(调 pH至 2),乙醚萃取 ,
有机相精制浓缩 、水相大孔树脂吸附 ,二者混合得总
黄酮含量 >75%。萘普生(naproxen, Nap),广东何
济公药厂生产 ,批号 20050426。来氟米特(lefluno-
mide, Lef),美国欣凯公司上海代表处提供 ,批号
20040402。羧甲基纤维素钠 ,上海三浦化工有限公
司生产 ,批号 20050311。 (上述药物使用前均研细
后用 0.5%羧甲基纤维素钠制成混悬液 。)卡介苗
(baciluscalmeteguein, BCG),卫生部上海生物制
品研究所产品 ,批号 050601。新生小牛血清 ,杭州
四季青生物 工程材料有限公司提供 , 批号:
20050908,用前 56℃ 30 min灭活 。RPMI1640粉 ,
Sigma公司产品(应用液另加 25mmol·L-1 HEPES,
1 mmol· L-1丙酮酸钠 , 2 mmol· L-1谷氨酰胺 , 50
μmol·L-1 β -巯基乙醇 , 105 IU· L-1青霉素 , 100 mg
·L-1链霉素 , 10%小牛血清 , pH调至 7.2,过滤分
装后置 -20℃冰箱保存备用)。刀豆蛋白 A(con-
canavalinA, ConA)、脂多糖 (lipopolysaccharide,
LPS),美国 Sigma公司产品 , 用生理盐水或 RPMI
1640培养液配制应用浓度 ,经 0.22 μm微孔滤膜过
滤除菌 ,置 -20℃冰箱保存备用。 MTT(3, 4, 5-dim-
ethylthiazo-2-yl-2, 5-diphenyltetrazoliumbromide)粉 ,
美国 Sigma公司产品 ,用 PBS配制成 5 g· L-1的储
备液 ,过滤除菌 , 4℃避光保存 。肿瘤坏死因子 α
(tumornecrosisfactor-α, TNF-α)、白细胞介素 6(in-
terleukin-6, IL-6)放射免疫分析试剂盒由解放军总
·1618· 中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBuletin　2007 Dec;23(12):1618 ～ 23
医院科技开发中心放免所生产。基质金属蛋白酶 9
(matrixmetaloproteinases, MMP-9)一抗由 Santacruz
公司提供 ,免疫组化染色试剂盒购自北京中杉金桥
生物技术有限公司。
1.2　仪器与设备　酶标仪 MK3,荷兰雷勃公司产
品 。电热恒温水浴锅 GSY-8,北京市医疗设备厂意
成公司产品 。冷冻离心机 TGL-18R,珠海黑马医学
仪器有限公司产品 。水套式 CO2 培养箱 shal-
ab2323,广州南方生化医学仪器有限公司产品 。多
功能显微镜 , 日本 OLYMPUS产品 。洁净工作台
SW-CJ-IF,江苏苏净集团苏州安泰空气技术有限公
司产品 。足趾容积测量仪 YLS-TA,山东省医学科学
院设备站产品。
1.3　动物 　Spague-Dawlay(SD)大鼠 , ♂, 体重
(180±20)g,皖医实动准第 02号 ,由安徽医科大学
动物实验中心提供 ,清洁级 。
2　方法
2.1　大鼠佐剂性关节炎模型的建立 [ 7] 　将同一批
号的卡介苗 80℃水浴 1 h灭活 ,用灭菌液体石蜡配
成 10 g·L-1的乳剂 ,充分研磨混匀即成福氏完全佐
剂(Freund′scompleteadjuvant, FCA)。放置 4℃冰
箱保存备用 ,使用前摇匀。用 Volumemeter测定致
炎前大鼠左后 、右后踝关节以下容积 (ml),然后于
每鼠左后足趾皮内注射 0.1 mlFCA致炎 ,正常对照
组注射 0.1mlPBS。
2.2　分组及给药方法　SD大鼠 60只 ,随机分为正
常组 、模型组 、TFLC用药组 (50, 100, 200 mg·
kg-1)及阳性对照组(萘普生 , 20 mg· kg-1),每组
10只 ,致炎前连续 ig3 d,分别于致炎前 ,致炎后 6、
12、18 h及 24 h,用足趾仪检测致炎前 、后大鼠致炎
侧足肿胀 ,以观察 AA大鼠原发性病变。
　　另取 SD大鼠 60只 ,随机分为正常组 、模型组 、
TFLC用药组(50、100、200mg· kg-1)及阳性对照组
(Lef, 6mg· kg-1),每组 10只 ,按 AA大鼠原发性病
变方法致炎 ,致炎后 d12开始 ig给药 10 d,并检测
非致炎侧足肿胀 ,每 4天 1次 ,以致炎前后足容积差
为肿胀度 ,观察 AA大鼠继发性病变。同时进行多
发性关节炎评分 。以下检测指标均在此模型上进
行 。
2.3　病理形态学　于造模后 d28,股动脉放血处死
动物。取各组大鼠膝关节置于 10%福尔马林中固
定 ,足爪组织脱钙 ,脱水 ,常规石蜡包埋切片 , HE染
色 ,在光学显微镜下观察病理组织学变化并摄片。
2.4　ConA、LPS诱导 AA大鼠脾淋巴细胞增殖反
应 [ 8] 　于造模后 d28股动脉放血处死大鼠 ,无菌分
离脾脏 ,按常规制备脾细胞悬液 ,用含 10%新生小
牛血清的 RPMI1640液调大鼠脾细胞浓度为 1 ×
10
10· L-1。于 96孔培养板上 ,每孔加入 100 μl细
胞悬液(终浓度为 5 ×109 · L-1), 100 μl含 ConA
(终浓度为 3 mg· L-1)或 LPS(终浓度为 6 mg·
L-1)的 RPMI1640液 ,终容积为 200μl,各设 3个复
孔 ,置 37℃、5% CO2培养箱培养 48 h,于终止培养
前 6 h,每孔加入 5g· L-1的 MTT10 μl,继续孵育 6
h,取出 ,每孔加 100 μl0.04 mol· L-1盐酸异丙醇 ,
充分溶解甲瓒颗粒 ,于酶标仪上测得 570 nm处 OD
值。
2.5　PMΥ中 TNF-α、IL-6含量的测定 [ 9] 　致炎后
d28,股动脉放血处死大鼠 , RPMI1640制备 AA大
鼠腹腔巨噬细胞悬液(2×109· L-1),加入 24孔培
养板 ,每孔 1ml,置 37℃、5% CO2培养箱培养 2 h,
弃去上清液 ,并用 D-Hanks液洗 3遍 ,除去非粘附细
胞 ,获单层巨噬细胞 。然后每孔加入含 LPS(终浓度
为 6 mg·L-1)的 RPMI1640培养液 1 ml,置 37℃、
5% CO2培养箱培养 48 h, 收集上清放免法测定
TNF-α、IL-6含量。
2.6　关节滑膜中 MMP-9的表达　采用免疫组织
化学方法测定 MMP-9[即明胶酶 B(gelatinaseB)]
的表达。造模后 d28,股动脉放血处死大鼠 ,剪下非
致炎侧(右侧)膝关节 , 10%甲醛固定 ,常规石蜡包
埋 , 4 μm厚连续切片 ,常规脱蜡 、水化 。 3% H2O2
室温作用 10 min, PBS(pH7.4)洗涤 3次 , 每次 5
min,然后用非免疫血清封闭 10 min。甩去余液 ,直
接滴加 MMP-9抗体(1 ∶150稀释), 4℃过夜。 PBS
漂洗 3次 ,每次 5 min。甩去多余 PBS液 ,滴加生物
素标记的兔抗山羊 IgG二抗工作液 , 37℃, 15 min。
PBS漂洗 3次 ,每次 5 min。甩去多余 PBS液 ,滴加
辣根酶标记链霉卵白素工作液 , 37℃, 15 min,甩去
多余 PBS液 , DAB显色 。自来水冲洗 ,苏木素复染。
脱水 ,透明 ,中性树胶封片 。以上试验用 PBS代替
一抗作阴性对照。染色结果按阳性细胞百分数计
算[ 10] :每张切片选取 5个高倍视野(400×),计算滑
膜衬里层和衬里下层中阳性细胞占总细胞数的百分
比 ,取其均值作为该张切片积分 , 对滑膜组织中
MMP-9的表达进行评分。
2.7　统计学处理　结果以 x±s表示 ,组间比较采
用方差分析。
3　结果
3.1　TFLC对 AA大鼠原发性炎症的影响　结果
见Tab1 , 与正常组相比 , AA模型组大鼠足爪明显
·1619·中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBuletin　2007 Dec;23(12)
Tab1　Anti-inflammatoryefectofTFLConprimaryinflammatoryreactioninAArats( x±s, n=10)
Group Dose/mg· kg-1 Volumeofpawswelling/■ml
6h 12h 18h 24h
Normal - 0.18±0.10 0.19±0.11 0.15±0.12 0.12±0.08
Control - 1.27±0.37■■ 1.18±0.26■■ 1.04±0.312■■ 1.29±0.42■■
TFLC 50 0.77±0.11＊＊ 0.83±0.19＊＊ 0.68±0.15＊＊ 0.83±0.14＊＊
TFLC 100 0.85±0.30＊ 0.84±0.12＊＊ 0.75±0.14＊ 0.88±0.24＊
TFLC 200 0.68±0.30＊＊ 0.77±0.24＊＊ 0.71±0.19＊ 0.77±0.30＊＊
Nap 20 0.78±0.22＊＊ 0.70±0.25＊＊ 0.54±0.14＊＊ 0.78±0.22＊＊
　　■■P<0.01vsnormalgroup;＊P<0.05, ＊＊P<0.01vscontrolgroup
Tab2　Anti-inflammatoryefectofTFLConsecondaryinflammatoryreactioninAArats( x±s, n=10)
Group Dose/mg· kg-1 Volumeofpawswelling/■ml
16d 20d 24d 28d
Normal - 0.13±0.09 0.14±0.12 0.15±0.13 0.13±0.11
Control - 0.54±0.33■■ 0.64±0.39■■ 0.65±0.37■■ 0.52±0.28■■
TFLC 50 0.19±0.07＊＊ 0.22±0.10＊＊ 0.22±0.09＊＊ 0.21±0.08＊＊
TFLC 100 0.23±0.14＊ 0.28±0.16＊ 0.30±0.17＊ 0.25±0.16＊
TFLC 200 0.17±0.07＊＊ 0.26±0.13＊＊ 0.31±0.18＊ 0.23±0.09＊＊
Lef 6 0.17±0.12＊＊ 0.16±0.10＊＊ 0.19±0.11＊＊ 0.14±0.04＊＊
　　■■P<0.01vsnormalgroup;＊P<0.05, ＊＊P<0.01vscontrolgroup
Tab3　EffectofTFLConpolyarthritisindexinAArats( x±s, n=10)
Group Dose/mg· kg-1 Polyarthritisindex
16d 20d 24d 28d
Normal - 0.50±0.53 1.10±0.57 1.80±1.14 1.00±0.67
Control - 7.60±0.84■■ 8.40±1.26■■ 9.10±1.45■■ 8.70±1.06■■
TFLC 50 6.60±0.70＊＊ 7.20±0.79＊＊ 7.90±0.99＊＊ 6.80±0.92＊＊
TFLC 100 6.20±1.03＊＊ 7.10±1.10＊＊ 7.60±1.65＊＊ 6.30±0.95＊＊
TFLC 200 5.40±0.97＊＊ 6.70±1.16＊＊ 7.40±0.84＊＊ 6.20±1.48＊＊
Lef 6 5.50±1.35＊＊ 6.50±0.85＊＊ 6.60±1.43＊＊ 6.30±1.34＊＊
　　■■P<0.01vsnormalgroup;＊＊P<0.01vscontrolgroup
肿胀。 TFLC从致炎后 6 h开始发挥疗效 , TFLC
(50、100、200 mg· kg-1)ig给药可明显减轻 AA大
鼠原发性足肿胀 。
3.2　TFLC对 AA大鼠继发性炎症的影响　结果
如 Tab2、3所示 ,与 AA模型组相比 , TFLC(50、100、
200mg· kg-1)ig给药可抑制 AA大鼠继发性足肿
胀 ,并减少其多发性关节炎积分 。
3.3　TFLC对 ConA、LPS诱导 AA大鼠脾淋巴细
胞增殖反应的影响　结果如 Tab4所示 , ConA、LPS
诱导的 AA大鼠脾淋巴细胞增殖反应明显低于正常
对照组(P<0.01), TFLC(50、100、200 mg· kg-1)ig
给药对 ConA、LPS诱导的 AA大鼠低下的脾淋巴细
胞增殖反应有明显的增强作用 。
3.4　TFLC对 AA大鼠腹腔巨噬细胞生成 TNF-α、
IL-6的影响　结果见 Tab5, AA大鼠腹腔巨噬细胞
产生 TNF-α、IL-6水平明显高于正常对照组 , TFLC
(50、100、200 mg· kg-1)ig给药可抑制 AA大鼠腹
腔巨噬细胞生成的 TNF-α、IL-6。
Tab4　EffectofTFLConsplenocyte
proliferationinAArats( x±s, n=5)
Group Dose/mg· kg-1 ConA/OD570 LPS/OD570
Normal - 0.58±0.13 0.59±0.11
Control - 0.30±0.01■■ 0.31±0.01■■
TFLC 50 0.39±0.06＊＊ 0.41±0.04＊＊
TFLC 100 0.48±0.10＊＊ 0.43±0.01＊＊
TFLC 200 0.54±0.11＊＊ 0.46±0.11＊＊
Lef 6 0.35±0.17 0.30±0.04
　　■■P<0.01vsnormalgroup;＊＊P<0.01vscontrolgroup
3.5　TFLC对 AA大鼠膝关节病理的影响　由膝
关节组织病理切片(Fig1)可见:AA模型组非致炎
侧膝关节滑膜组织呈乳突状增生 ,滑膜囊内有大量
炎细胞浸润 ,以淋巴细胞 、单核细胞为主 ,并可见少
量多核巨细胞 、中性粒细胞。滑膜上皮细胞增生且
变成梭形 ,新血管生成 ,关节软骨破坏。 TFLC(50、
100、200mg·kg-1)ig给药可使 AA大鼠非致炎侧
膝关节滑膜增生减轻 ,炎细胞(以单核细胞为主)浸
润减少 ,血供减少 ,血管翳形成减少 ,关节软骨破坏
·1620· 中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBuletin　2007 Dec;23(12)
逆转 。以上结果提示:TFLC(50、 100、 200 mg·
kg-1)对 AA大鼠关节炎症有明显的治疗作用 。
Tab5　EffectofTFLConTNF-αandIL-6formation
inperitonealmacrophageofAArats( x±s, n=5)
Group Dose/mg· kg-1 TNF-α/ng· L-1 IL-6/ng· L-1
Normal - 15.40±2.42 77.30±24.50
Control - 22.53±3.17■■ 113.39±23.13■
TFLC 50 20.33±4.48 84.82±10.96＊
TFLC 100 17.33±3.43＊ 79.40±7.94＊
TFLC 200 17.27±2.25＊ 82.00±6.36＊
Lef 6 14.40±3.02＊＊ 82.54±9.09＊
　　■P<0.05, ■■P<0.01vsnormalgroup;＊P<0.05, ＊＊P<0.01
vscontrolgroup
Fig1　EfectofTFLConkneejoint
histopathologyinAArats(HEstain, ×200)
　　A:Normalkneejointhistopathologyofrats;B:Histopathological
findingsfromthekneejointinAArats;C:Histopathologicalfindingsfrom
thekneejointinAAratstreatedwithTFLC(50mg· kg-1 , ig);D:His-
topathologicalfindingsfromthekneejointinAAratstreatedwithTFLC
(100mg· kg-1 , ig);E:Histopathologicalfindingsfromthekneejoint
inAAratstreatedwithTFLC(200mg· kg-1 , ig);F:Histopathological
findingsfromthekneejointinAAratstreatedwithLef(6mg· kg-1 , ig)
3.6　TFLC对 AA大鼠膝关节滑膜 MMP-9蛋白表
达的影响　免疫组化染色检测 TFLC对 AA大鼠膝
关节滑膜表达 MMP-9的影响 。MMP-9阳性信号为
清晰棕黄色颗粒 ,主要定位于滑膜上皮细胞细胞膜
和(或)细胞质。结果见 Fig2,正常组未见阳性细
胞 , AA模型组大鼠膝关节滑膜上皮细胞 MMP-9表
达的面积增大 ,染色深度增强 , TFLC(50、100、200
mg· kg-1)ig给药对于 AA大鼠膝关节滑膜上皮细
胞 MMP-9的强表达具有抑制作用 ,使阳性细胞百分
数明显减少。具体结果见 Tab6和 Fig2。
Fig2　EffectofTFLContheproteinexpressionofMMP-9onknee
jointsynoviocytesofAArats(Immunohistochemistrystain, ×200)
　　A:ProteinexpressionofMMP-9onkneejointsynoviocytesofnormal
rats;B:ProteinexpressionofMMP-9 onkneejointsynoviocytesofAA
rats;C:ProteinexpressionofMMP-9onkneejointsynoviocytesofAArats
withTFLC(50mg· kg-1 , ig);D:ProteinexpressionofMMP-9onknee
jointsynoviocytesofAAratswithTFLC(100mg· kg-1 , ig);E:Protein
expressionofMMP-9 onkneejointsynoviocytesofAAratswithTFLC
(200mg· kg-1 , ig);F:ProteinexpressionofMMP-9onkneejointsyno-
viocytesofAAratswithLef(6mg· kg-1 , ig)
Tab6　EfectofTFLConscoresofMMP-9expression
onkneejointssynoviocytesofAArats( x±s, n=5)
Group Dose/mg· kg-1 ImmunohistochemistryscoresofMMP-9expression
Normal - 19.26±3.53
Control - 66.85±6.74■■
TFLC 50 51.83±6.05＊＊
TFLC 100 41.91±1.59＊＊
TFLC 200 34.52±6.16＊＊
Lef 6 26.50±1.77＊＊
　　■■P<0.01vsnormalgroup;＊＊P<0.01vscontrolgroup
4　讨论
大鼠 AA模型是一种以细胞免疫功能紊乱为主
·1621·中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBuletin　2007 Dec;23(12)
的免疫性炎症模型 ,其多关节炎症 、关节畸形及组织
学变化与人类类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis,
RA)非常相似 ,是研究类风湿性关节炎的理想动物
模型。 AA原发性病变表现为早期致炎局部的急性
炎症反应 ,一般于致炎后 24 h内足肿胀达峰值 ,持
续 3 d后逐渐消退。继发性病变一般出现于致炎后
d10 ～ 16,表现为双侧足肿胀进行性加重 ,活动受
限 ,是以多发性关节炎为特征病变的全身性迟发性
超敏反应[ 11] 。继发性病变时组织学特点为滑膜增
生 ,单核 /巨噬细胞浸润 ,血管翳形成 ,关节软骨和骨
组织进行性破坏 。本实验结果表明 TFLC对佐剂性
关节炎具有明显的治疗作用 ,与前期研究中使用的
TFLC(醇提物)对 AA的作用一致 。在此基础上 ,我
们对 TFLC治疗 AA的机制进行了初探 。
淋巴细胞是体内重要的免疫活性细胞 ,检测其
增殖水平对评价细胞免疫功能具有重要意义。本研
究结果显示 TFLC对 AA大鼠低下的脾淋巴细胞增
殖反应有正向调节作用 , TFLC对 AA大鼠的治疗作
用可能与其改善 AA大鼠异常的细胞免疫功能有
关 。
许多前炎性细胞因子如 TNF-α、IL-6表达于关
节炎症部位 ,形成复杂的细胞因子网络 ,参与滑膜炎
的形成和骨与软骨的破坏 。RA患者滑液和滑膜组
织中均可检测到 TNF-α,它能调节白细胞和滑膜细
胞的功能 ,诱导滑膜细胞增生 ,刺激金属蛋白酶和其
他前炎性细胞因子产生[ 12] 。 IL-6主要由巨噬细胞 、
T细胞和 B细胞等多种细胞产生 ,具有调节免疫应
答 ,参与机体炎症反应和抗感染防御的作用 。鉴于
细胞因子在 AA病变进程中的重要作用 ,我们的实
验结果表明 , TFLC(50、100、200 mg· kg-1)可明显
降低 AA大鼠腹腔巨噬细胞内 TNF-α、IL-6的水平 。
由此推测降低 AA大鼠腹腔巨噬细胞内细胞因子
(TNF-α、IL-6)的水平 ,可能是 TFLC治疗 AA的机
制之一 。
MMP-9又称明胶酶 B。在关节中 , MMP-9表达
于滑膜衬里层的巨噬细胞 、血管内皮细胞 ,白细胞 、
软骨细胞以及破骨细胞 ,还可表达于培养的纤维母
细胞和活化的纤维母细胞 [ 13] 。 MMP-9可由炎症性
细胞因子如 TNF-α、IL-1诱导产生 ,以非活性酶原的
形式(与 TIMP形成复合物)分泌 ,然后在体内被纤
维蛋白溶酶活化 ,作用于明胶 、弹性蛋白 、胶原蛋白
Ⅱ 、Ⅳ、Ⅴ ,降解胶原原纤维 、基底膜成分以及细胞外
间质 ,而这些成分也是关节软骨的重要组成成分 ,
所以推测 MMP-9可能与 RA关节骨及软骨的破坏
关系密切 [ 14] 。MMP-9至少以两种方式破坏 RA的
关节 ,首先 MMP-9能直接降解软骨和骨。 RA患者
通过单核 、巨噬细胞高表达 CD147, 促进已升高的
MMP-9的分泌 、细胞侵袭和亲环蛋白 A介导的细胞
移动 ,从而导致关节软骨及骨的破坏;另外 , MMP-9
在血管再生的过程中起很重要的作用。血管再生是
RA的突出特征 ,血管再生时 ,内皮细胞必须分解至
少两种特殊障碍 ,即微血管基底膜和间质 ,而 MMP-
9在这些过程中起决定性作用 。大量的临床和实验
证实 RA血液及关节滑液中的 MMP-9明显增高 ,关
节滑膜 MMP-9的表达也明显增高[ 15] 。本文采用免
疫组化法检测 TFLC对 AA大鼠膝关节滑膜表达
MMP-9的影响 。结果表明 , AA模型组大鼠膝关节
滑膜上皮细胞 MMP-9表达明显增强 , TFLC(50、
100、200mg·kg-1)ig给药明显抑制其表达。据此 ,
我们认为 TFLC治疗 AA可能与其降低膝关节滑膜
上皮细胞中 MMP-9蛋白的表达有关 ,其详细机制有
待于进一步研究。
综上所述 ,作为豹皮樟的抗炎有效部位 , TFLC
(50、100、200 mg· kg-1)对 AA大鼠关节炎症有明
显的治疗作用 ,其机制可能与调节免疫功能 、减少细
胞因子的生成及抑制基质金属蛋白酶的蛋白表达有
关。
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EffectoftotalflavonoidsfromLitseacoreanaLeve.on
adjuvant-inducedarthritisanditsmechanism
WANGTing-yu, LIJun, GEJing-fang, CHENGWen-ming, JINYong, L Xiong-wen, JIANGHui, ZHAOBin
(CollegeofPharmacy, AnhuiMedicalUniversity, Hefei　230032, China)
Abstract:Aim　Toinvestigatetheefectoftotalfla-
vonoidsofLitseacoreanaLeve.(TFLC)onadjuvant-in-
ducedarthritis(AA)anditsmechanism.Method　
AAwasinducedwithFeund′scompleteadjuvant.The
degreeofpawswelingandpolyarthritisindexwerecal-
culated.TNF-αandinterleukin(IL-6)inperitoneal
macrophages(PMΥ)ofsecondaryarthritisratswere
measuredbyradioimmunoassay(RIA).ConAorLPS-
inducedsplenocyteproliferationonAAratswasas-
sayedwithMTTreagent.Parafinsectionsofkneejoint
stainedwithhematoxylinandeosin(HE)werepre-
paredforhistologicalanalysistoassessjointdamage.
Proteinexpressionofmatrixmetaloproteinases(MMP-
9)onkneejointsynoviocytesofAAratswassurveyed
byimmunohistochemistry.Results　TFLC(50, 100,
200mg· kg-1)significantlyinhibitedtheprimaryand
secondarypawsweling, anddecreasedpolyarthritisin-
dex.Thespleniclymphocyteproliferationreactionof
AAratswasincreasedbythetreatmentwithTFLC
(50 , 100, 200mg· kg-1).TFLC(50, 100, 200mg
·kg-1)markedlyreducedTNF-αandIL-6 levelin
PMΥofAArats.Thepathologicaldamageofknee
jointwasreversedbyTFLC(50 , 100, 200 mg·
kg-1).TFLC(50, 100, 200 mg·kg-1)significantly
inhibitedtheexpressionofproteinMMP-9onkneejoint
synoviocytesofAArats.Conclusion　TFLC(50,
100, 200 mg· kg-1)hasmarkedtherapeuticefecton
AArats, whichisrelatedtoregulatingtheimmune
function, reducingtheproductionofcytokinesandin-
hibitingtheexpressionofproteinMMP-9.
Keywords:LitseacoreanaLeve.;flavonoid;arthritis
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