全 文 ：半边旗中抗肿瘤成分６Ｆ的分离纯化
龚先玲，梁念慈，邓亦峰
（广东医学院 天然药物研究与开发重点实验室，广东 湛江５２４０２３）
摘　要：目的：分离纯化半边旗中抗肿瘤活性成分６Ｆ（即７β，９－二羟基－１５－氧－对映－贝壳杉烷－１６－烯－１９，
６β－内酯）。方法：采用二氧化碳超临界萃取、结晶与重结晶、硅胶柱层析方法进行分离、纯化６Ｆ；采用
ＨＰＬＣ－ＭＳ、ＨＰＬＣ和ＴＬＣ检测６Ｆ的纯度。结果：经 ＨＰＬＣ和ＴＬＣ检测，可以得到６Ｆ的纯化合物。
结论：采用结晶与重结晶、硅胶柱层析方法，可有效纯化半边旗中抗肿瘤成分６Ｆ。
关键词：半边旗；６Ｆ；６Ｆ纯化
中图分类号：Ｒ２８４　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：１６７３－２１９７（２０１２）０９－００２９－０２
收稿日期：２０１２－０６－１５
基金项目：广东省中医药局科研课题（２００９２３５）
作者简介：龚先玲（１９７５－），女，硕士，广东医学院副教授，研究方向为中药抗肿瘤活性成分的筛选。
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎ　Ａｃｔｉｖｅ　Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ　Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　６ＦｆｒｏｍＰｔｅｒｉｓ　ｓｅｍｉｐｉｎｎａｔａ　Ｌ．
Ｇｏｎｇ　Ｘｉａｎｌｉｎｇ，Ｌｉａｎｇ　Ｎｉａｎｃｉ，Ｄｅｎｇ　Ｙｉｆｅｎｇ
（Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｆｏｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｄｒｕｇｓ，
Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｅｇｅ，Ｚｈａｎｊｉａｎｇ　５２４０２３，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｏｂｔａｉｎ　ａｎ　ａｃｔｉｖｅ　ａｎｔｉｔｕｍｏｒ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ　６Ｆ （７β，９－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ－１５－ｏｘｏ－ｅｎｔ－ｋａｕｒ－１６－－ｅｎ－１９，６β－ｏｌｉｄｅ）ｆｒｏｍ
Ｐｔｅｒｉｓ　ｓｅｍｉｐｉｎｎａｔａ　Ｌ．．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ　ｃａｒｂｏｎ　ｄｉｏｘｉｄｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ｃｒｙｓｔａｌｉｚａｔｉｏｎ，ｒｅｃｒｙｓｔａｌｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｏｌｕｍｎ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａ－
ｐｈｙ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｉｓｏｌａｔｅ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｙ　ｔｈｅ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ　６Ｆ．Ｔｈｅ　ｐｕｒｉｔｙ　ｏｆ　６Ｆｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ＨＰＬＣ－ＭＳ，ＨＰＬＣ　ａｎｄ　ＴＬＣ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ
ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ　６Ｆｗａｓ　ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ　ｂｙ　ＨＰＬＣ　ａｎｄ　ＴＬＣ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅ　ａｎｔｉｔｕｍｏｒ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ　６Ｆｉｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ
ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｕｓｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｂｏｖｅ．
Ｋｅｙ　Ｗｏｒｄｓ：Ｐｔｅｒｉｓ　ｓｅｍｉｐｉｎｎａｔａ　Ｌ．；７β，９－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ－１５－ｏｘｏ－ｅｎｔ－ｋａｕｒ－１６－ｅｎ－１９，６β－ｏｌｉｄｅ（６Ｆ）；Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
　　半边旗（Ｐｔｅｒｉｓ　ｓｅｍｉｐｉｎｎａｔａ　Ｌ．）为凤尾蕨科凤尾蕨属
植物［１］，广泛分布于长江以南和四川等诸省区［２］，产于台湾、
福建、江西、广东、广西、湖南、贵州、四川和云南等地［１］，味
苦、辛，性凉，具有清热、解毒、消肿等功效［２］，为南方民间常
用的生药之一。半边旗中含有贝壳杉烷类二萜化合物［３－４］，
如１１－Ｈｙｄｒｏｘｙ－１５－ｏｘｏ－ｅｎｔ－ｋａｕｒａｎ－１９－ｏｉｃ　ａｃｉｄ（即４Ｆ）、１１β－
ｈｙｄｒｏｘｙ－１５－ｏｘｏ－ｅｎｔ－ｋａｕｒ－１６－ｅｎ－１９－ｏｉｃ　ａｃｉｄ（即５Ｆ）、７β，９－ｄｉ－
ｈｙｄｒｏｘｙ－１５－ｏｘｏ－ｅｎｔ－ｋａｕｒ－１６－ｅｎ－１９，６β－ｏｌｉｄｅ（即６Ｆ）。其中，
４Ｆ抗癌活性差，５Ｆ和６Ｆ均能明显抑制多种肿瘤细胞增殖，
且６Ｆ抑制肿瘤细胞的作用明显强于５Ｆ。但由于这几种化
合物结构比较相似，分离纯化时易互相干扰，制备６Ｆ比５Ｆ
相对困难，因此抗肿瘤作用明显强于５Ｆ。目前，对其抗肿瘤
机理只进行了初步研究［５］，对其药效学研究几乎未开展。
本文通过分离纯化来制备６Ｆ，为进一步研究６Ｆ的抗肿瘤作
用并开发成抗肿瘤药物奠定基础。
图１　半边旗中的贝壳杉烷类二萜化合物的结构
１　仪器与试药
旋转蒸发仪由上海申生科技有限公司生产；岛津
ＨＰＬＣ－ＭＳ　８０００α型高效液相色谱－质谱联用仪；Ａｇｌｉｅｎｔ
１２００高效液相色谱。柱层析用硅胶（２００～３００目），ＨＦ２５４
薄层层析硅胶板，由青岛海洋化工厂生产；石油醚（ｂ．ｐ．６０
～９０℃）、丙酮、氯仿、甲醇、乙醇、浓硫酸均为分析纯，乙腈
为色谱纯；半边旗采于广东省广州市郊区，由广东医学院苟
占平教授鉴定，标本保存于广东天然药物研究与开发重点
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实验室。
２　方法与结果
２．１　６Ｆ的提取与分离
取半边旗地上部分，洗净、晾干，粉碎成４０目粗粉，按
照文献［６］方法进行二氧化碳超临界萃取，萃取液经过适当
浓缩，于４℃冰箱放置一段时间，分为黒膏层、黄色结晶层和
溶液层。溶液层放于４℃冰箱，分成两层，取上层；将上层液
体再放于４℃冰箱，析出固体物，过滤，得６Ｆ的提取物。６Ｆ
的提取物用少量丙酮溶解、拌硅胶、晾干，用硅胶柱进行分
离，石油醚∶丙酮∶乙酸＝７∶２∶０．０４洗脱，分段收集，
ＨＦ２５４薄层层析硅胶板检测、合并相同的部分，减压浓缩至
干得固体。将第四部分固体物溶于适量丙酮，加水至刚好
出现浑浊为止，放于４℃冰箱，析出６Ｆ的晶体。
２．２　各部分的检测分析
２．２．１　６Ｆ的提取物 ＨＰＬＣ－ＭＳ检测
将６Ｆ的提取物溶于乙醇，配制成０．４ｍｇ·ｍＬ－１的样品
溶液，进样５μＬ。色谱条件：色谱柱 Ｌｉ－ｃｈｒｏｓｐｈｅｒ　Ｃ１８柱
（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ，５μｍ），流动相乙腈：２ｍｍｏｌ
－１乙酸铵＝３５
∶６５，流速１．０ｍＬ· ｍｉｎ－１，柱温为室温。质谱条件：ＡＰＣＩ
离子源，电极温度４００℃，电晕电压－４．０ｋＶ，离子传输电压＋
５５Ｖ，温度２５０℃，偏转电压－４０Ｖ，检测器电压１．６ｋＶ，喷雾
氮气流速２．５Ｌ·ｍｉｎ－１。以 ｍ／ｚ为３３１（５Ｆ）、３３３（４Ｆ）、３４５
（６Ｆ）、３４７作为选择离子峰监测峰，采用选择监测离子流
（ＭＩＣ）峰面积进行定量，以总离子流图（ＴＩＣ）峰面积鉴定化
合物的纯度，质量范围５０～７００，扫描间隔１ｓ。
２．２．２　薄层色谱鉴别
取一定量的６Ｆ晶体用丙酮溶解，制成１ｍｇ·ｍＬ－１的供
试品溶液。依照《中国药典》２０１０一部附录（ⅥＢ）试验薄层
层析法，吸取上述供试品溶液２μＬ，点于薄层层析板 ＨＦ２５４
上，分别用石油醚∶丙酮∶乙酸 ＝７∶３∶０．０５、氯仿∶甲
醇＝４９∶１两种展开剂展开，取出，晾干，喷１０％ Ｈ２ＳＯ４－乙
醇溶液，加热至１０５℃，显色。
２．２．３　ＨＰＬＣ检测
色谱柱为ＶＰ－ＯＤＳ　Ｃ１８柱 （２５０ｍｍ×４．６ｍｍ，５μｍ）；流
动相为乙腈∶２ｍｍｏｌ－１乙酸铵＝３５∶６５；流速１ｍＬ·ｍｉｎ－１；
进样５μＬ柱温；２５℃；紫外检测波长２５４ｎｍ。
图２　６Ｆ提取物的总离子流
２．３　检测结果
由图２可知，６Ｆ的提取物经 ＨＰＬＣ－ＭＳ检测，产生一个
主要的离子峰，该离子峰经选择性离子监测发现其离子主
要为质荷比３４５的化合物，除了３４５的峰之外，还有质荷比
为３４７的峰，在总离子流图中没见到３３１和３３３的离子峰，
说明易与６Ｆ混淆的４Ｆ和５Ｆ基本除掉。根据计算，６Ｆ在
６Ｆ的提取物中的纯度达到６１．３％。
图３　６Ｆ的ＨＰＬＣ色谱
由图３可知，６Ｆ的结晶，用 ＨＰＬＣ检测，只有一个主要
吸收峰，保留时间为６．０９ｍｉｎ。同时，６Ｆ的结晶用薄层层析
法鉴别，用两种不同溶剂系统的展开剂展开经显色后只有
一个斑点。这两种不同的检测结果说明：分离后得到的６Ｆ
结晶已达到纯化的目的。
３　讨论
半边旗药材经二氧化碳超临界萃取，得到半边旗提取
物，该提取物经过适当浓缩，放冰箱析出黄色结晶（中间
层），该黄色结晶经 ＨＰＬＣ－ＭＳ检测，主要以４Ｆ和５Ｆ为主，
基本不含６Ｆ；下层的黑膏经 ＨＰＬＣ－ＭＳ检测，含４Ｆ、５Ｆ和
６Ｆ，但这三种成分在黑膏的含量都不高；上层滤液中６Ｆ的
提取物经 ＨＰＬＣ－ＭＳ检测，６Ｆ含量较高，没见到易与６Ｆ混
淆的４Ｆ和５Ｆ；因此本实验选定滤液中６Ｆ的提取物来进行
进一步的分离。经过分离纯化，得到的结晶用 ＨＰＬＣ检测，
出峰时间为６．０９ｍｉｎ，与 ＨＰＬＣ－ＭＳ检测６Ｆ的出峰时间一
致，证明该化合物是６Ｆ。在ＴＬＣ鉴别实验中，该结晶分别
用两种展开系统展开，喷１０％硫酸－乙醇显色剂，加热，只显
示一个黄色斑点，表明该结晶为单一成分的化合物。综合
分析这两种检测方法，可知该结晶为６Ｆ的纯化合物。
参考文献：
［１］　中国科学院中国植物志编辑委员会．中国植物志：第三卷（第
一分册）［Ｍ］．北京：科学出版社，１９９０：４６－４８．
［２］　丁恒山．中国药用孢子植物［Ｍ］．上海：上海科技出版社，
１９８２：１０４－１０５．
［３］　张晓，崔燎，田中信寿，等．半边旗有效成分及抗肿瘤活性研
究［Ｊ］．中国药学杂志，１９９７，３２（１）：３７－３８．
［４］　张晓，李金华，何承伟，等．半边旗二萜类化合物的植化及抗
肿瘤活性初步［Ｊ］．中国药学杂志，１９９９，３４（８）：５１２－５１４．
［５］　何承伟，梁念慈，莫丽儿，等．半边旗抗肿瘤有效成分６Ｆ对
ＨＬ－６０细胞周期的影响及体外增效作用［Ｊ］．癌症，１９９８，１７
（３）：１９１－１９３．
［６］　邓亦峰，梁念慈．半边旗中二萜类化合物的二氧化碳超临界
萃取及ＬＣ－ＭＳ分析［Ｊ］．中草药，２００４，３５（２）：１４５－１４７．
［７］　李金华，梁念慈，莫立儿，等．半边旗５种成分体外细胞毒活
性比较及构效关系分析［Ｊ］．药学学报，１９９８：３３（９）：６４１－６４４．
［８］　邓亦峰，兰柳波，梁念慈．液质联用对半边旗二萜类活性成分
分离富集方法的研究［Ｊ］．分析测试学报，２００４，２３（３）：９７－９９．
（责任编辑：姜付平）
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