全 文 ：半边旗中二萜类化合物 6F对肝癌细胞 SPC-A-1
细胞周期及细胞 DNA、 RNA和蛋白质合成的影响*
李金华* * 　梁念慈　莫丽儿 1　何承伟　张　晓
(广东医学院医用生化研究所、1化学教研室 ,湛江　 524023)
1998-09-18收稿 , 1998-11-10修回
* 广东省科委重点科技攻关项目资助课题 , No 9622007-002
* * E-mai l address: gdmcsh@ g dmc. ed u. cn
作者简介:李金华 ,女 , 29岁 ,硕士 ;
梁念慈 ,男 ,广东医学院院长 ,生化教授 ,博士生导师 ,主要
从事生化药理学的研究
中国图书分类号　 R 734. 2; R 284. 1; R 979. 1
文献标识码 A　 文章编号 1001-1978( 1999) 01-0049-03
摘要　目的　研究半边旗中二萜类有效成分之一 6F对肺癌
细胞细胞周期及细胞中 DNA、 RN A和蛋白质合成的影响。
方法　采用体外培养的人癌细胞株—— 肺腺癌上皮细胞
SPC-A-1作实验对象 ,以噻唑蓝 ( M TT )法测定细胞存活率 ;
用细胞光度术 ( FCM )测定 6F对 SPC-A-1细胞周期的影响
[3 H]-TdR、 [3H ]-UT R和 [3 H]-Leu参入的方法观察 6F对
SPC-A-1细胞 DN A、 RN A和蛋白质合成的影响。 结果　化
合物 6F可强烈抑制 S PC-A-1细胞的生长 , 24 h的半数抑制
浓度 IC50为 2. 34μmol· L- 1;细胞周期分析显示 6F作用细
胞 24 h后 ,均能使细胞的 G2 /M期细胞比例升高 ,同时 G0 /
G1期比例下降 ,并呈一定的剂量效应关系 , 6F对 [3 H]-Td R、
[3H ]-UTP和 [3 H]-Leu参入作用在培养 24 h后均有明显抑
制作用 ,且呈剂量依赖关系。 结论　化合物 6F明显抑制
SPC-A-1细胞的生长 ,阻断细胞于 G2 /M 期 ,抑制细胞
DN A、 RNA和蛋白质的合成。
关键词　半边旗 ;二萜 ;细胞周期 ;细胞毒活性 ;肺腺癌细胞
株
　　半边旗 ( Pteris Semipinnata L , PsL )为凤尾蕨
科植物 ,广泛分布于我国南方 ,民间用于治疗菌痢、
肝炎、肠炎、结膜炎等〔 1〕。我们在筛选抗肿瘤化合物
时发现 ,半边旗的乙醇提取物显示显著的体内外抗
肿瘤活性〔2, 3〕。进一步分离纯化后得到一系列化合
物 ,其中二萜类化合物能够强烈抑制人白血病细胞
HL-60、 K562等多种人癌细胞株的生长 ,二萜类化
合物之一 F-A对 HL-60细胞的 G2 /M期有阻断作
用〔 4〕。本文应用流式细胞光度术 ( FCM )及 [3H]-
TdR、 [3 H]-U T P和 [3 H]-Leu参入的方法研究半边
旗有效抗肿瘤化合物 6F对肺癌 SPC-A-1细胞周
期、细胞 DNA、 RNA和蛋白质合成的影响。
1　材料与方法
1. 1　仪器　酶标仪用 Bio-Bad公司 Model 450型 ;
流式细胞仪用 Coulter公司 Epics X2型 ;液体闪烁
计数仪用 Beckman公司 IS-6000型。
1. 2　药品与试剂　半边旗有效成分 6F由我所药
物化学室分离提纯鉴定 , [3H]胸腺嘧啶脱氧胸苷
( [
3
H]-TdR,比放射性 1. 18× 1015 Bq· mo l- 1 ) ,
[
3
H]尿嘧啶核苷 ( [3 H]-U TP,比放射性 5. 55× 1014
Bq· mol- 1 )和 [3 H]亮氨酸 ( [3H ]-Leu,比放射性
1. 52× 1015 Bq· mo l- 1 ) ,均为上海原子核研究所产
品 , RPM I-1640培养基购于 Gibco 公司 ; RPM I-
1640缺陷培养基和碘化丙啶 ( PI)购于 Sigma公司 ,
其余试剂均为分析纯。
Fig 1　 The structure of compound 6F
1. 3　方法
1. 3. 1　细胞及细胞培养　肺腺癌细胞 SPC-A-1购
自中山医科大学实验动物中心 ,生长于体积分数为
15%灭活小牛血清、 1× 105 U· L- 1青霉素和 100
mg· L- 1链霉素的 RPM I-1640培养基中 ,置 37℃ ,
0. 05 CO2饱和湿度孵箱中培养 ,每 2 d传代 1次。细
胞经 2. 5 g· L- 1胰酶分散传代和收获 ,取对数生长
期细胞进行实验。
1. 3. 2　抑制癌细胞生长实验　 MT T 法参照
Hansen等〔 5〕的方法。将对数生长期的 SPC-A-1细
胞以 5× 108· L- 1浓度加入 96孔板中 ,待细胞完全
贴壁后 ,用药组分别加入 10μl不同浓度的药物 ,每
个浓度重复 4孔 ,细胞培养 24 h后 ,加 M TT试剂
及溶解液 ,用酶标仪测吸光度 ,按改良 Karber公式
计数 IC50。
1. 3. 3　流式细胞光度术分析细胞周期分布　药物
处理细胞 24 h后 ,收集对照组及给药组细胞 , 1 000
×g离心 5 min,细胞团用 PBS洗涤 2次 ,迅速注入
冷的体积分数为 70%乙醇中 , 4℃固定 24 h以上 ,
1 000× g离心 5 min,去除乙醇 , PBS洗涤 1次 ,细
·49·中国药理学通报　Chinese Pharmacological Bulletin　 1999 Feb; 15( 1): 49～ 51
胞团悬浮于 0. 3 ml PBS中 ,加 0. 7 ml碘化丙啶 (内
含 0. 05 mg· L- 1 RNase ) ,避光染色 30 min,用
Coulter EPTCSX L-31240流式细胞仪测定细胞
DNA含量并分析细胞周期。
1. 3. 4　 [3H]-TdR、 [3 H]-U TP和 [3H]-Leu参入分
别测定细胞 DNA、 RNA和蛋白质合成　药物处理
细胞 24 h后 ,收集对照组及给药组细胞 ,每组收集 2
份 ,每份 5× 105细胞 ,用预冷的 PBS洗涤 ,各组重新
悬浮在 1 ml含 [3H]-TdR(终浓度为 3. 7× 107 Bq·
L
- 1 )、 [3H]-U TP(终浓度为 3. 7× 107 Bq· L- 1 )的
RPM I-1640培养基和含 [3H]-Leu(终浓度为 3. 7×
10
7
Bq· L- 1 )的 RPM I-1640缺陷型培养基中 ,于
37℃孵育 2 h,用质量浓度为 100 g· L- 1三氯醋酸
沉淀细胞。用多头细胞收集仪收集细胞于 Wha tman
玻璃纤维滤膜上 ,多次洗涤后 ,烘干滤膜 ,加闪烁液 ,
于 Beckman液体闪烁计数仪上计数测量 cpm ,扣除
本底 cpm ,以 cpm /5× 105细胞为计数单位 ,计算参
入抑制率。
参入抑制率 (% )= (对照组 cpm-实验组 cpm)对照组 cpm × 100%
2　结果
2. 1　化合物 6F对 SPC-A-1细胞生长的抑制作用
　不同浓度 6F作用 SPC-A-1细胞 24 h后 ,可显著
抑制细胞的生长 ,呈剂量依赖关系 ,如图 2所示 ,其
对细胞的 IC50值为 ( 2. 34± 0. 07)μmo l· L- 1。
Fig 2　Eff ect of compound 6F on the growth of SPC-A-1
cells after 24 h treatment (x-± s , n= 3～ 5)
2. 2　化合物 6F对 SPC-A-1细胞周期分布的影响
　化合物 6F对 SPC-A-1细胞作用 24 h后对细胞
周期各时相 DNA含量的影响见表 1。 不同浓度 6F
作用 SPC-A-1细胞 24 h,可使 G2 /M期细胞比例明
显升高 ,而 G0 /G1期细胞比例下降。与对照组细胞
相比 , 1. 16和 2. 32μmo l· L- 1的 6F使 G2 /M期细
胞由 10. 4%分别上升到 20. 6%和 28. 2% ,而 G0 /G1
期细胞比例则从 61. 2%下降到 51. 2%和 45. 8% ,
6F对 S期细胞没有影响。
Tab 1　 Effect of compound 6F on the cell cycle
of SPC-A-1 cel ls after 24 h treatment
6F
/μmol· L- 1 G1 /G0 S G2 /M
　　 0. 0 61. 2± 2. 33 28. 6± 1. 48 10. 2± 3. 25
0. 578 60. 3± 5. 32 28. 3± 3. 92 11. 4± 2. 66
1. 16 51. 1± 3. 38 28. 3± 5. 38 20. 6± 6. 18
2. 32 45. 7± 0. 92 26. 1± 6. 30 28. 2± 2. 40
4. 64 47. 6± 4. 52 23. 9± 4. 13 28. 5± 2. 70
9. 28 40. 5± 0. 21 34. 2± 0. 14 25. 3± 0. 28
2. 3　 6F对 SPC-A-1细胞 DNA、 RNA和蛋白质合
成的影响　采用 [3H]-TdR、 [3H]-U TP和 [3H]-Leu
参入的方法测定 6F对 SPC-A-1细胞 DNA、 RNA
和蛋白质合成的影响。结果如图 3和表 2所示: 6F
作用于细胞 24 h后 ,对 [ 3H]-TdR、 [ 3H]-U T P和
[3 H]-Leu参入有显著抑制作用 ,三者均呈明显的剂
量依赖关系 ,说明 6F不同程度地抑制细胞 DNA、
RNA和蛋白质的合成 ,但对 RNA抑制程度大于
DNA。
Tab 2　 Effect of compound 6F on [3H ]-TdR、 [ 3H ]-UTP
and [ 3H ]-Leu incorporation into DNA, RNA and
protein of SPC-A-1 cel ls af ter 24 h treatment ( x-± s, n= 3)
6F
/μmol· L- 1
cpm /5× 105 cell
DNA RN A Protein
　　 0. 00 　 5588± 98 　 33117± 2834 　 11410± 1687
1. 16 3950± 16* 23161± 5427 9166± 1828*
2. 32 3845± 173* 19829± 257* 8380± 2370
4. 46 3493± 573* 18056± 2473* 7285± 1802*
6. 96 2613± 434* 3986± 494* 7164± 1200*
　　 Com pared w i th con trol , * P < 0. 05
Fig 3　 Effect of compound 6F on [ 3H ]-TdR、 [3H ]-UTP
and [ 3H ]-Leu incorporation into DNA, RNA and protein of
SPC-A-1 cel ls after 24 h treatment
▲—▲: DN A; ■—■: RN A; ○—○: Protein
3　讨论
大多数的植物类抗肿瘤药物为细胞周期特异性
药物 ,主要杀伤处于增殖期的细胞 ,特别是 S期和
M期细胞对其最为敏感〔6〕。 主要作用于 M期细胞
·50· 中国药理学通报　Chinese Pharmacological B ulletin　 1999 Feb; 15( 1)
的〔 7〕 ,如长春新碱、秋水仙碱等能干扰微管蛋白的装
配 ,阻断纺缍丝的形成 ,使恶性细胞处于分裂中期而
不能继续增殖 ;而 V p-16阻断细胞于 G2 /M期 ,使
细胞向 G1 /G0期移行受阻 ,细胞不能继续增殖。我
们的实验结果显示化合物 6F主要阻断细胞于 G2 /
M期 ,可能使细胞向 G1期的移行受阻 ,从而抑制了
细胞的生长。
　　而药物抑制细胞 DNA合成是药物抑制肿瘤细
胞增殖的主要原因。 我们的实验结果表明: 6F可以
抑制 SPC-A-1细胞 DNA的合成同时也抑制 RNA
和蛋白质的合成 ,且其对 RNA合成的抑制程度最
强。 6F抑制 DNA、 RNA和蛋白质合成的剂量正是
其杀伤细胞的剂量。提示药物对细胞 DNA、 RNA和
蛋白质合成的抑制与药物对细胞的杀伤作用是一致
的。文献报道:冬凌草甲素可迅速抑制 DNA的合成
同时也能抑制 RNA和蛋白质的合成 ,但对 DNA的
抑制达到峰值的时间先于 RNA和蛋白质 ,而对后
两者的抑制程度则大于 DNA,其对 DNA合成的抑
制可能是抑制了 DNA聚合酶α的活性 ,阻断了脱
氧核甘酸底物聚合形成 DNA的过程〔8〕。 6F与冬凌
草甲素的结构很相似 ,都含有可与巯基酶结合的 α-
亚甲基环戊酮结构 ,而 SH基团是维持 DNA聚合酶
α活性所必需的 ,冬凌草正是通过对 DNA聚合酶
SH基团的作用抑制了该酶活性〔 9〕。 6F有可能也因
抑制了 DNA聚合酶从而抑制了 DNA的合成。而我
们的实验发现 , 6F可抑制 DNA TO POⅠ 、 TO POⅡ
的活性 ,因此我们认为 6F可能是通过抑制 DNA合
成过程中所需的 DNA拓扑异构酶和 DNA聚合酶
的活性 ,干扰 DNA的复制 ,抑制 DNA的合成最终
抑制肿瘤细胞的生长 ,但更具体的机制还有待于进
一步的研究。
参考文献
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中国药理学报 , 1988; 9( 5): 465～ 7
The ef fect of compoud 6F isolated from Pteris
Semipinnata L on cell cycle and synthesis of DNA,
RNA and protein of lung adenocarcinoma cell
*
LI Jin-Hua
* * , L IAN G Nian-Ci, MO Li-Er, HE Cheng-Wei , ZHANG Xiao
( Inst itute of Medical B iochemistry , Guangdong
Medical Col lege, Zhanjiang　 524023)
ABSTRACT　 AIM　 To study the ef fects of com-
pound 6F, one of the diterpenoids f rom Pteris
Semipinnata L on cell cycle and the synthesis of
DN A, RN A and protein of lung adenoca rcinoma
cell line SPC-A-1. METHODS　 Cell viabi li ty wa s
determined by using 3-( 4, 5-Dimethyl-2-thiazoly l) -
2, 5-dipheny l-2H-tet ra zolium bromide ( M T T )
test, the cell cycle wa s analysed by flow cy tometry
( FCM ) and the synthesis of DN A, RN A and pro-
tein w as observ ed by the [3H ]-TdR、 [3H ]-U TP
and [
3
H]-Leu inco rpo ra tion. RESULTS　 Com-
pound 6F st rongly inhibi ted the grow th o f SPC-A-
1 cell , the IC50 value w as 2. 34μmol· L- 1 after 24
h trea tment. FCM analysis rev ealed that 6F could
increase the percentag e of cell s in G2 /M phase and
decrease those in G0 /G1 phase af ter 24 h trea t-
ment, and in a dose-dependent manner, w hi le
tho se in S phase changed a li t tle. The assays of
[
3
H]-TdR、 [3H]-U T P and [3 H]-Leu incorporation
into DN A, RN A and pro tein respectiv ely showed
obvious inhibi tion dose-dependent ly af ter expo sure
to 6F fo r 24 h. CONCLUSION　 Compound 6F re-
markbly inhibi ted SPC-A-1 cell line pro li feration,
arrested SPC-A-1 cel l in G2 /M phase and inhibi ted
the synthesis o f DN A, RN A and pro tein.
KEY WORDS　Pteris Semipinnata L; di terpenoid;
cell cycle; cy to to xici ty; human lung adenocarino-
ma cells
* This w ork w as supported by the Key Research Project Foundation
of Guangdong.
* * Corresponding author, E-mai l gdmcsh@ gdmc. edu. cn
·51·中国药理学通报　Chinese Pharmacological B ulletin　 1999 Feb; 15( 1)