全 文 ：半边旗 5种成分体外细胞毒活性比较及构效关系分析
李金华　梁念慈　莫丽儿＊　张　晓　何承伟
(广东医学院医用生化研究所 , ＊化学教研室 , 湛江 524023)＊＊
摘要　用多种人癌细胞株以 M TT 试验 , 体外筛选半边旗抗肿瘤活性成分。结果显示:化合物 5F ,
6F , A及半边旗乙醇提取物 PSE对 5 种人癌细胞均有不同程度的杀伤作用 , 且呈明显的剂量依赖关系。
其中 6F 的活性最强 ,其次是 A , 5F , 而化合物 4F 和 B 对 5 种细胞均无细胞毒活性。分析它们的构效关系
可以推测 ,α-β-亚甲基环戊酮结构是其活性部位 , 结构中羟基数目和位置的不同可以影响化合物的活性强
度。
关键词　半边旗;二萜;细胞毒活性;构效关系
　　从中草药中开发新天然药物和生物活性物
质是当前药学研究的重要课题之一。半边旗
(Pteris semipinnata L.PsL)属凤尾蕨科植物 ,
广泛分布于我国南方各省 ,民间常用于治疗蛇
伤 、外伤出血 ,抗菌痢 、肠炎 、肝炎等[ 1] 。本课
题组在筛选抗肿瘤植物药时发现 ,半边旗的乙
醇及水提取物显示良好的体内外抗肿瘤活
性[ 2] ,进一步从醇提物中分离纯化后得到 5个
成分:4F ,5F ,6F ,A 及 B ,经结构鉴定 ,B是一个
倍半萜类化合物 , 其余 4 个均为二萜类化合
物[ 3] 。本文旨在用体外培养的多种人癌细胞
筛选活性化合物 ,并分析它们的构效关系 。
Fig 1　The structures of the diterpenoids and sesqui terpenoid f rom Pteris semipinnata L.
材 料 与 方 法
药品与试剂　半边旗提取物:4F ,5F ,6F ,A
和B(结构如图 1所示)由我所植化室分离纯
化 ,并鉴定结构 。用 DMSO配制成原液(6F 浓
收稿日期　1997-10-13
本文为广东省科委重点科技攻关项目资助(9622007-
002)课题
＊＊E-mail address:gdmcsh@gdmc.edu.cn
度为 10 g·L-1 , 4F , 5F , A 和 B 浓度均为 50
g·L-1 ,PE 浓度为 100 g·L-1),分装冻存 ,临用
前用生理盐水或培养基稀释成各所需浓度 。但
DMSO在处理细胞时的最终浓度小于或等于
0.1%。RPM I-1640培养基为 Gibco公司产品;
MTT(噻唑蓝四氮唑)为 Serva 公司产品;新生
小牛血清购于杭州四季青生物材料公司;5-氟
尿嘧啶购于广州化学工业公司试剂厂 。
细胞株和细胞培养 　人胃腺癌细胞
·641·药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 1998 , 33(9)∶641～ 644
DOI :10.16438/j.0513-4870.1998.09.001
(MGC-803)、人低分化鼻咽癌细胞(CNE-2Z)由
广东医学院病理研究所提供;人肺腺癌细胞
(SPC-A-1)、人肝癌细胞(BEL-7402)购于中山
医科大学动物实验中心;人肝癌细胞(HePG
II)购于中国科学院上海细胞所 。5株人癌细胞
培养于含 15%灭活小牛血清 、100 u·ml-1青霉
素和 100 μg·ml-1链霉素的 RPM I-1640完全培
养基中 , 置 37℃, 5%CO2 饱和湿度孵箱内培
养。细胞经 0.25%胰酶分散传代和收获 ,取对
数生长期细胞进行实验。
细胞毒活性实验 　MTT 法参照 Hansen
等[ 4]的方法。分别将对数生长期的5种癌细胞
以 0.5 ～ 1×105·ml-1个细胞浓度加入 96孔板
中 ,待细胞完全贴壁后 ,用药组分别加入 10 μl
不同浓度的药液至终浓度分别为:4F 和 B
(0.1 , 1.0 , 10 , 100 μg·ml-1), 5F(4.0 , 8.0 ,
16.0 ,32.0 , 64.0 μg·ml-1 , 6F(0.05 , 0.1 , 0.2 ,
0.4 ,0.8μg·ml-1), A(1.0 ,2.0 , 4.0 ,8.0 , 16.0
μg·ml-1), PSE(5.0 , 10.0 , 20.0 , 40.0 , 80.0
μg·ml-1)。阳性对照 5-Fu浓度为 1.25 , 2.5 ,
5.0 ,10.0 ,20.0μg·ml-1 。加药后细胞培养 72
h ,加 5 mg·ml-1 MTT 试剂 20 μl ,温孵 5 h ,再
加甲 溶解液 , 37℃保温 3 ～ 5 h后 ,用酶标仪
(Bio-Rad M450)测定吸收度(A)。按公式计算
细胞生长抑制率和 IC50[ 5](表 1)。
Tab 1　Cytotoxicity of the compounds isolated from Pteris Semipinnata L.
on several tumor cell l inesa
Compound
Cell lines/ IC50b , μg·ml-1
HePG II SPC-A-1 MGC-803 CNE-2Z BEL-7402
4F 　　>100 　　>100 　　>100 　　>100 　　>100
5F 10.1±0.67 12.8±2.55 14.5±2.98 14.4±0.30 24.6±0.30
6F 0.34±0.003＊＊ 0.12±0.02 0.60±0.03＊＊ 0.33±0.07＊＊ 0.22±0.06＊
A 5.4±0.36＊＊ 1.6±0.06 4.6±1.97＊＊ 4.0±0.63＊＊ 4.4±0.69＊＊
B >100 >100 >100 >100 >100
PSE 24.6±1.92 13.7±3.68 32.8±9.10 20.0±1.93 32.2±4.54
5-FU c 2.2±0.13 3.2±1.08 2.9±5.0 5.0±0.07
a:Cy to to xic activity w as measured by the M TT test as described in Ma terials and Methods.Values are
presented as x±s.(n=3 ～ 5);b:Concentration to inhibit grow th by 50% over a 72 h period;c:5-
Fluo rouracil , positive control.＊P <0.05 , ＊＊P <0.01 (compared w ith SPC-A-1 cell line).HePG I I:
Human liver adenocarcinoma cell line;SPC-A-1:Human lung adenocarcinoma cell line;MGC-803:
Human gastric adenocarcinoma cell line;CNE-2Z:Human nasopharyngeal carcinoma cells in low
differentiation;BEL-7402:Human liver adenocarcinoma cell line.
结 果 和 讨 论
如表 1所示 ,从半边旗全草中分离提取的
5个化合物 ,其中化合物 4F 和 B对 5种癌细胞
的生长均无抑制作用 ,其余 3个化合物 5F ,6F ,
A及 PSE 可明显抑制 5种癌细胞的生长 。且
制作用呈明显的剂量依赖关系 ,其中 6F 的抑
制作用最强 ,其次是A ,5F 。分析它们的结构可
以看出 , B 是一个倍半萜类化合物 , 4F 是四环
二萜类化合物 ,但分子中缺乏α,β 不饱和环戊
酮结构(其 16位碳原子上接的是甲基),而 5F ,
6F ,A都是含α,β-亚甲基-环戊酮结构的对映贝
壳杉烷类化合物 ,它们均显示不同强度的细胞
毒活性。根据文献报道[ 6 , 7] , 含α, β-亚甲基环
戊酮结构的化合物可经 M ichael加成反应与含
巯基的酶结合 ,导致酶失活 ,从而显示这类化合
物的细胞毒作用。本文报道的二萜类化合物 ,
其作用靶点可能也是巯基酶 ,活性基团为α,β-
亚甲基-环戊酮 。我们在体外培养的 MGC-803
细胞中加入化合物 6F 和不同浓度的还原型谷
胱甘肽(GSH),结果发现谷胱甘肽可显著抑制
6F 的体外细胞毒活性 ,故此推测 6F 有可能作
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用于细胞内巯基化合物而引起细胞毒作用 ,其
作用靶点是巯基 。
化合物 4F 和 B 因缺乏α,β不饱和环戊酮
结构 ,不能经 Michael加成反应与巯基酶结合 ,
因而无明显细胞毒活性。5F , 6F , A 的细胞毒
活性强度不一样 ,比较它们的构效关系(图 1)
可以发现 , 5F 比 6F 和 A 在 7-C原子上少了一
个羟基 。我们知道 , 7-C 原子上的-OH 和 15-C
原子上的羰基之间可以形成一个氢键 ,增加了
羰基碳的正电荷 ,进而减少了 17-C原子上的电
子密度 ,使得 17-C 原子更加容易与巯基酶结
合 ,所以 5F 的活性要比 6F 和 A 弱得多 。另
外 ,6F 和 A中的内酯环是否也为活性基团或增
加药物的生物利用度从而增加了它们的活性 ,
还有待于进一步研究证实 。6F 和 A 是一个同
分异构体 ,区别仅在于-OH的位置不同 。在 6F
中 ,7-C原子上的-OH ,9-C原子上的-OH 和 15-
C 原子上的羰基之间可以两两形成氢键 ,大大
降低了 17-C 原子上的电子云密度 ,使得 17-C
变得极为活泼 ,有利于亲核试剂(巯基酶)的进
攻 ,6F 更易于与巯基酶结合;而 A中 11-C原子
上的-OH 和 7-C 原子上的-OH 之间不能形成氢
键 ,因而表现出其活性比 6F 大为降低(10倍左
右)。这一构效关系为该类化合物的结果改造
和设计新化合物提供了参考和理论依据 。
本实验结果还发现 , 3 个化合物对不同肿
瘤细胞系的细胞毒活性具有选择性 。在 5种实
体瘤细胞中 ,肺癌 SPC-A-1 细胞对药物最为敏
感 ,6F ,A分别作用各细胞 72 h 后 ,对 SPC-A-1
细胞的 IC50分别与对其余 4 种细胞的 IC50相
比 ,P <0.05 ,具有显著性差异 。与白血病细胞
相比 ,则更为敏感 ,其中 6F 作用白血病 HL-60
细胞 72 h后的 IC50为 0.03 μg·ml-1 ,与本实验
所选用的 5种实体瘤细胞系的 IC50相比有显著
差异。在体内实验 ,粗提物(主要含 5F , 6F 和
A)对小鼠淋巴白血病 P388 ,小鼠 S180肉瘤具很
强的抗肿瘤作用 ,而对肝癌作用较差 。这些结
果提示化合物 5F , 6F 和 A 及半边旗粗提物体
外对不同细胞系的细胞毒作用及对体内不同肿
瘤的抗肿瘤作用具有一定的选择性。而 3个具
细胞毒活性的化合物 5F ,6F 和 A ,尤其是化合
物 6F 的体内实验将有待于进一步研究。
参 考 文 献
1　丁恒山主编.中国药用孢子植物.上海科学技术出
版社 , 1982∶104
2　崔燎 , 梁念慈 , 陈志东 , 等.半边旗体内外抗癌作用
及急性毒性研究.中药材 , 1996 , 19∶29
3　张晓 , 崔燎 , 梁念慈 , 等.半边旗有效成分及抗肿瘤
活性研究.中国药学杂志 , 1997 , 32∶37
4　Hansen MB , Nielsen SE , Berg K.Re-examinaton
and fur ther development of a precise and rapid dye
method fo r measuring cell g row th/cell kill. J
Im munol Methods , 1989 , 119∶203
5　鄂征主编.组织培养技术(修订本).北京:人民卫生
出版社 , 1988∶292
6　Fujita E , Nagao Y , Kaneko K , et al.The antitumo r
and antibacterial activity of the isodon diterpenoids.
Chem Pharm Bull , 1976 , 24∶2118
7　Fuji K , Xu HJ , Tatsumi H , et al.Design and
synthesis of antitumor compounds based on the
cy to tox ic diterpenoids from the Genus Rabdosia.
Chem Pharm Bull , 1991 , 39∶685
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COMPARISON OF THE CYTOTOXICITYOF FIVE CONSTITUENTS
FROM PTERIS SEMIPINNATA L.IN VITRO AND THE ANALYSIS
OF THEIR STRUCTURE-ACTIVITY RELATIONSHIPS
Li Jinhua(Li JH), Liang Nianci(Liang NC), Mo Lier(Mo LE),
Zhang Xiao(Zhang X)and He Chengwei(He CW)
(Insti tute of Medical B iochem istry , Guangdong Medical Col lege , Zhanj iang 524023)
ABSTRACT　The antitumor constituents were isolated from Pteris sem ipinnata L.(PsL), a
Chinese t raditional herb , and screened using tetrazolium salt (MT T)method.Their cy toto xic effects
in vi tro on several human tumo r cell lines were studied.Compounds 5F , 6F , A and the ethanolic
ex tract of PsL (PSE)were show n to have st rong cyto toxicity against five cell lines:human liver
adenocarcinoma cell line(HePG II), human lung adenocarcinom a cell line(SPC-A-1), human gastric
adenocarcinoma cell line (MGC-803), human nasopharyngeal carcinoma cells in low differentiation
(CNE-2Z)and human liver adenocarcinoma cell line (BEL-7402)in dif ferent degrees in a dose-
dependent manner;compound 6F w as the most active one , whose IC50 after 72 h treatment for the
above five cell lines were 0.343±0.003 , 0.115±0.022 , 0.590±0.032 , 0.328±0.066 and 0.221
±0.058 μg·ml-1 , respectively.Compounds A and 5F were less act ive;no cytotoxicity of compounds
4F and B w ere detected on the f ive cell lines.Analysis of the relationship betw een structure and
activi ty revealed that the antitumor act ivity portion in the structure is the α, β-methylene
cyclopentanone moiety , and the si te and number of the hydro xy g roups af fect the cy toto xicity of these
agents significant ly .
KEY WORDS 　 Pteris semipinnata L.;Diterpenoids;Cy totoxici ty;Structure-activity
relationship
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