全 文 ：第二军医大学学报 2010 年 11 月第 31 卷第 11 期 http:/ /www． ajsmmu． cn
Academic Journal of Second Military Medical University，Nov． 2010，Vol． 31，No． 11
·1211·
DOI:10． 3724 /SP． J． 1008． 2010． 01211 ·论 著·
白花丹参上调 Bcl － 2 抑制内皮细胞凋亡
于长凯1，2，张晓艳2，高允生1*
1．泰山医学院药学院药理学教研室，泰安 271016
2．江苏联合职业技术学院连云港中医药分院，连云港 222006
［摘要］ 目的 研究白花丹参对过氧化氢(H2O2)诱导的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)凋亡的抑制作用及对凋亡相
关基因 Bcl － 2 表达的调节。方法 应用酶消化灌注法分离人脐静脉血管内皮细胞，采用形态学观察和Ⅷ因子抗体免疫荧光
检测法进行鉴定。取对数生长期的细胞分组进行干预(白花丹参高剂量组 0． 10 g /ml，白花丹参低剂量组 0． 01 g /ml) ，应用流
式细胞技术观察细胞凋亡情况，应用免疫细胞荧光技术检测凋亡相关基因 Bcl － 2 的表达。结果 在白花丹参干预下，H2O2
诱导的 HUVEC凋亡率降低(高剂量组 P ＜ 0． 01，低剂量组 P ＜ 0． 05) ，高剂量组 Bcl － 2 的表达增加(P ＜ 0． 01)。结论 白花
丹参对 H2O2诱导的 HUVEC凋亡具有抑制作用，这种作用与 Bcl － 2 表达上调有关。
［关键词］ 白花丹参;脐静脉;内皮细胞;细胞凋亡;bcl － 2 基因
［中图分类号］ R 972． 6 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 0258 － 879X(2010)11 － 1211 － 04
Salvia miltiorrhiza bge． f． alba up － regulates Bcl － 2 and inhibits apoptosis of human umbilical vein
endothelial cells
YU Chang － kai1，2，ZHANG Xiao － yan2，GAO Yun － sheng1*
1． Department of Pharmacology，School of Pharmacy，Taishan Medical University，Taian 271016，Shandong，China
2． Lianyungang Branch of Traditional Chinese Medicine，Jiangsu Union Technical Institute，Lianyungang 222006，Jiangsu，China
［收稿日期］ 2010 － 03 － 05 ［接受日期］ 2010 － 09 － 19
［基金项目］ 山东省教育厅科研基金(J04E07)． Supported by Research Foundation of Education Department of Shandong Province (J04E07)．
［作者简介］ 于长凯，硕士． E － mail:lygyck2009@ 163． com
* 通讯作者(Corresponding author)． Tel:0538 － 6229756，E － mail:ysgao@ tsmc． edu． cn
［Abstract］ Objective To study the influence of Salvia miltiorrhiza bge． f． alba(SMA)on apoptosis and Bcl － 2 expression in
human umbilical vein endothelial cell (HUVEC)in vitro． Methods HUVECs were isolated using perfusion and enzyme digestion
methods，and the obtained cells were identified by morphological observation and Ⅷ∶Ag immunoreactivity examination． The cells in
the exponential phase of growth were treated with H2O2 and different concentrations of SMA(high dose:0． 10 g /ml，low dose:0． 01 g /
ml)． The cell apoptosis was determined by flow cytometric analysis and Bcl － 2 expression was examined by immunofluorescence
mehtod． Results SMA significantly decreased the H2O2 － induced apoptosis of HUVECs (P ＜ 0． 01 in high dose group and P ＜ 0． 05
in low dose group) ，and significantly increased the expression of Bcl － 2 in high dose group(P ＜ 0． 01)． Conclusion SMA can inhibit
H2O2 － induced apoptosis of HUVEC，which might be associated with the increase of Bcl － 2 expression．
［Key words］ Salvia miltiorrhiza bge． f． alba;umbilical veins;endothelial cell;apoptosis;bcl － 2 genes
［Acad J Sec Mil Med Univ，2010，31(11) :1211 － 1214］
白花丹参(Salvia miltiorrhiza bge． f． alba)为唇
形科植物丹参(Salvia miltiorrhiza bge．)的白花变型，
主要分布于泰山及其周边地区，属珍稀濒危药用植
物［1］。文献［2］报道白花丹参有较强的血管扩张作
用，对高血脂症和动脉粥样硬化具有显著疗效，对血
栓闭塞性脉管炎具有独特疗效，而血管内皮细胞
(vascular endothelial cell，VEC)损伤是以动脉粥样
硬化为基础的众多心脑血管疾病的始动环节或关键
因素［3］。前期实验显示，白花丹参对过氧化氢所致
人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)损伤具有保护作
用［4］，本实验旨在对这种保护作用的机制加以探讨。
1 材料和方法
1． 1 材料、试剂和仪器 白花丹参根:采自泰山东
麓，并经泰山医学院药学院中药学教研室鉴定确认;
正常分娩后的健康新生儿脐带，山东泰安市中心医
·1212· 第二军医大学学报 2010 年 11 月，第 31 卷
院分娩室提供;DMEM/F12 培养基，美国 Sigma 公
司;胎牛血清，美国 Invitrogen 公司;胶原酶Ⅰ，美国
Invitrogen公司;H2O2(30%，AR 级) ，天津四通化工
公司产品，临用前稀释，并在 5 min 内使用;Annexin
Ⅴ － FITC 凋亡检测试剂盒，北京宝赛生物技术有限
公司;兔抗人Ⅷ因子抗体:武汉博士德生物工程有
限公司;兔抗人 Bcl － 2 抗体:北京宝赛生物技术有
限公司;FITC标记山羊抗兔 IgG:武汉博士德生物工
程有限公司;激光共聚焦显微镜，美国 Bio － Red 公
司(型号 Radiance 2100) ;超速低温离心机:美国
Beckman － CoulterSigama 公司(型号 LE － 80K) ;倒
置荧光显微镜:日本 OLYMPUS公司(型号Ⅸ71) ;流
式细胞仪:美国 B － D公司(型号 FACSCalibur) ;IPP
通用医学图像分析系统:MEDIA CYBERBNETCS 公
司(型号 ipwin32)。
1． 2 血管内皮细胞的培养和鉴定 参照 Jaffe 等［5］
的方法，取新生儿脐带(长度为 20 ～ 30 cm) ，冲洗干
净。注入 0． 1%的胶原酶Ⅰ溶液 10 ml，37℃消化 15
min，收集消化液并用 10 ml 培养液冲洗管腔，56 × g
离心 10 min，重悬细胞，以 1 × 105 /ml 接种于培养瓶
中，置 37℃、5% CO2培养。约 1 周后可传代，2 代内
用于实验。原代培养的细胞培养 5 ～ 7 d 后，倒置显
微镜下观察细胞的形态。
在 6 孔板里放入盖玻片，调整细胞密度为(1 ～
3)× 104 / ml，每孔接种 1 ml，待 3 ～ 5 d 后细胞均匀
铺满孔底，PBS冲洗;95%冰乙醇固定;将稀释的兔
抗人Ⅷ因子抗体小心加入到盖玻片上，37℃孵育 1
h;吸出液体，PBS 冲洗 3 次;加入稀释的荧光素
FITC标记的羊抗兔 IgG抗体，37℃孵育 1 h;吸出液
体，在激光共聚焦显微镜下观察、摄片。
1． 3 白花丹参提取物的制备 称取白花丹参粉末
100 g，蒸馏水浸泡，文火煎煮 2 次，每次 1． 5 h，合并
滤液，用布氏漏斗抽滤;用旋转蒸发仪浓缩至 100
ml。得 1． 0 g /ml的白花丹参水提取物，用 0． 22 μm
微孔滤膜过滤除菌后于 4℃保存，备用，用含血清培
养液稀释成相应浓度(按生药含量计算)用于实验。
1． 4 分组与处理 取处于对数生长期的 HUVEC，
按如下条件分组处理: (1)对照组:加入 DMEM/F12
培养基; (2)模型组:加入 DMEM/F12 培养基和
H2O2; (3)白花丹参高剂量组与(4)白花丹参低剂
量组:加入 DMEM/F12 培养基、H2O2和白花丹参提
取液。使(2)、(3)、(4)组中 H2O2的浓度均为为 2． 0
mmol /L。使(3)、(4)组中白花丹参浓度分别为 0． 10
g /ml和 0． 01 g /ml，各组继续培养 4 h。
1． 5 流式细胞技术检测血管内皮细胞凋亡 干预
结束后，胰蛋白酶消化，制备 1 × 106 /ml 细胞悬液，
取 1 ml转移至离心管;56 × g，4℃离心 10 min，弃
上清;加入 1 ml 冷 PBS，56 × g，4℃离心 10 min，重
复 3 次，200 μl结合液重悬细胞;加入 10 μl Annexin
Ⅴ和 5 μl PI，轻轻混匀，避光室温染色 15 min;加入
300 μl结合液，上机检测细胞凋亡情况。试验重复 3
次，取平均值。
1． 6 白花丹参对血管内皮细胞 Bcl － 2 蛋白表达的
影响 干预结束后，收集细胞，制备单细胞悬液，加
入兔抗人 Bcl － 2 抗体，37℃作用 30min，PBS 洗涤 1
次，加入 FITC 标记的羊抗兔 IgG 抗体，4℃避光孵育
45 min，PBS 洗涤 1 次，用 PBS 重悬，取 20 μl 涂片，
在荧光显微镜下观察摄片，每组 7 张，应用荧光显微
镜图像采集处理系统进行分析，比较各组平均荧光
强度。
1． 7 统计学处理 选用 SAS 8． 1 统计软件进行统
计学处理，实验数据均以珋x ± s表示，数据采用单因素
方差分析等进行统计。组间比较采用 q 检验。检验
水准(α)为 0． 05。
2 结 果
2． 1 HUVEC 的鉴定 HUVEC 接种于培养瓶 12 h
后，大部分已贴壁，5 ～ 7 d 后细胞己基本融合、呈特
征性的“铺路石”样镶嵌排列(图 1A)。免疫细胞荧
光技术鉴定 HUVEC:共聚焦显微镜下可见细胞核周
围呈黄绿色发亮荧光，95%以上的细胞呈特征性的
阳性反应，见图 1B。
2． 2 白花丹参对 H2 O2诱导 HUVECs 凋亡的影
响 经流式细胞仪检测，正常对照组凋亡率为
(7． 93% ± 1． 45%) ;H2 O2 损伤模型组凋亡率为
(40． 63% ±3． 48%) ;与正常对照组(n = 3)相比，
H2O2损伤模型组凋亡率增高(P ＜ 0． 01)。白花丹参
高剂量组与白花丹参低剂量组的凋亡率分别为
(15． 47% ± 5． 20%)和(31． 08% ± 1． 93%)。与
H2O2损伤模型组相比，差异均有统计学意义(P ＜
0． 01，P ＜0． 05) ，即白花丹参各剂量组明显抑制了 H2
O2的作用，降低了血管内皮细胞的凋亡率，见图 2。
2． 3 白花丹参对血管内皮细胞 Bcl － 2 蛋白表达的
影响 结果显示，正常对照组的平均荧光强度为
19． 33 ± 1． 17;H2 O2损伤模型组的平均荧光强度为
14． 61 ± 0． 53，与正常对照组相比，H2O2损伤模型组
Bcl － 2 平均荧光强度降低有统计学意义(P ＜ 0．
01) ，提示 H2O2损伤模型组细胞 Bcl － 2 表达明显减
少。白花丹参高剂量组与白花丹参低剂量组的平均
第 11 期．于长凯，等．白花丹参上调 Bcl － 2 抑制内皮细胞凋亡 ·1213·
荧光强度分别为 20． 78 ± 1． 88 和 15． 40 ± 0． 38。白
花丹参高剂量组与 H2O2损伤模型组相比，差异有统
计学意义(P ＜ 0． 01) ，提示高浓度和中浓度的白花丹
参明显抑制了 H2O2的作用，使血管内皮细胞 Bcl － 2
蛋白表达增加，使平均荧光强度增高;而白花丹参
低剂量组与 H2O2损伤模型组相比，差异没有统计学
意义(P ＞ 0． 05) ，见图 3。
图 1 HUVEC的鉴定
Fig 1 Identification of HUVECs
A:Morphological identification;B:Ⅷ factor staining identification． Orig-
inal magnification:× 100(A) ;× 400 (B)
图 2 白花丹参抑制人血管内皮细胞凋亡的作用
Fig 2 Inhibitory effect of SMA on apoptosis
of human vascular endothelial cells
PI － /AnnexinⅤ －:Living cells;PI + /AnnexinⅤ －:Mechanically dam-
aged cells;PI + /AnnexinⅤ +:Later apoptotic and necrotic cells;PI － /
AnnexinⅤ+:Early apoptotic cells． Control:DMEM/F12;Model:DMEM/
F12 + H2O2;SMA:Salvia miltiorrhiza bge． f． alba．
图 3 白花丹参提取物对 HUVEC凋亡相关蛋白 Bcl －2 表达的影响
Fig 3 Influence of Salvia miltiorrhiza bge． f． alba(SMA)on expression of apoptosis related gene Bcl －2 in HUVECs
A:Control;B:Model;C:SMA 0． 10 g /ml;D:SMA 0． 01 g /ml． Original magnification:× 100
3 讨 论
白花丹参对血管内皮细胞具有保护作用［4］，但
相关机制未明。而血管内皮细胞凋亡与心、脑血管
疾病密不可分，故推测白花丹参可能通过抑制血管
内皮细胞凋亡、进而保护其活性。本研究选用流式
细胞技术检测了白花丹参对血管内皮细胞凋亡情况
的影响。本实验结果表明:白花丹参可显著降低由
H2O2诱导的血管内皮细胞的凋亡率，而且白花丹参
的剂量越高，血管内皮细胞凋亡率降低越明显。提
示白花丹参是过抑制血管内皮细胞凋亡这一机制来
保护血管内皮细胞。
细胞凋亡的发生和调控是一个极其复杂的系
统，其机制尚未完全清楚。但已证明受多个基因的
调控，其中 Bcl － 2 基因及其表达的 Bcl － 2 蛋白在凋
亡的调控中具有重要的作用［6 － 8］，是研究得最早、也
是研究得比较清楚的凋亡相关基因和蛋白之一。本
实验通过检测 Bcl － 2 蛋白的平均荧光强度来评价
Bcl － 2 的表达情况，结果显示:经白花丹参作用的血
管内皮细胞 Bcl － 2 表达显著增加，而且白花丹参的
剂量越高，血管内皮细胞表达的 Bcl － 2 蛋白越多。
可见，白花丹参使血管内皮细胞表达的 Bcl － 2 蛋白
增多，而 Bcl － 2 表达的增加抑制了血管内皮细胞凋
亡。这与相关报道［9 － 11］符合。而且，结果显示白花
丹参高剂量组的 Bcl － 2 表达量增加明显，甚至超过
了对照组，这说明白花丹参对 Bcl － 2 表达的促进作
用很强，只要白花丹参达到一定的剂量，就可以消除
由于H2O2的作用而使 Bcl － 2 表达下降的程度。但
·1214· 第二军医大学学报 2010 年 11 月，第 31 卷
是，白花丹参低剂量组与 H2 O2损伤模型组之间在
Bcl － 2 表达没有明显差别，而从降低细胞凋亡率的
结果来看，白花丹参低剂量组对血管内皮细胞也具
有很好的保护作用，推测白花丹参除通过促进 Bcl －
2 表达增加外，应该尚有其他途径来抑制血管内皮
细胞的凋亡，或者除抑制凋亡以外尚有其他渠道来
保护血管内皮细胞免受损伤，这些有待于进一步研
究证实。本研究发现白花丹参对 H2O2诱导的血管
内皮细胞凋亡具有抑制作用，这种作用与 Bcl － 2 表
达上调有关。
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［本文编辑］ 尹
檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪
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