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(续表 2)
化合物
(compound)
分子量
(molecular
weight)
分子式
(m olecu lar
formu la)
挥发油相对含量 (relat ive content)/ %
益智壳
(seedcase)
益智仁
(nut let)
炮制品
(processin g)
丁香烯 204 C15H24 0.29 2.80 0.21
古香木兰烯 204 C15H24 0.13 0.91 0.20
艾里莫芬烯 204 C15H24 0.51 10.86 10.71
胡椒烯 204 C15H24 0.61 0.37 0.12
β-榄香烯 204 C15H24 0.72 1.07 0.13
γ-古芸烯 204 C15H24 1.16 1.84 8.58
诺卡酮 218 C15H22O 未检出 12.35 12.92
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(收稿日期:2010-09-06;修回日期:2010-09-16)
鬼箭羽提取物抑制血管生成的实验研究
陈锡强1 , 2 , 何秋霞1 , 2 , 严守生3 , 刘可春1 , 2 , ＊ , 侯海荣1 , 2 , 韩利文1 , 2 , 王思锋1 , 2 , 袁延强1 , 2 (1.山东
省生物传感器重点实验室 , 济南　250014;2.山东省科学院生物研究所 , 济南　250014;3.山东省齐鲁制药有限公司药理部 ,
济南　250014)
摘要:目的　研究鬼箭羽氯仿提取物对血管生成的影响。方法　采用人脐静脉内皮细胞模型 (HUVEC)、 大鼠动
脉环模型 (ra t ao rtic ring s)和鸡胚绒毛尿囊膜 (CAM)模型研究鬼箭羽提取物抑制血管生成作用。结果　8 μg ·
mL-1鬼箭羽提取物显著抑制人脐静脉内皮细胞的增殖 , 抑制率达到 36.2%;2 μg · mL-1和 4 μg ·mL -1鬼箭羽提
取物能够显著抑制大鼠动脉环新血管结构形成 , 抑制率分别达到 56.41%和 65.25%;鬼箭羽提取物 20 μg ·个-1与
40 μg·个-1对鸡胚绒毛尿囊膜 (CAM)血管抑制率分别达到了 22.6%与 31.2%。结论　鬼箭羽提取物具有显著的
抗血管生成活性。
关键词:鬼箭羽;抗血管生成;人脐静脉内皮细胞;大鼠动脉环;鸡胚绒毛尿囊膜
中图分类号:R285.5　　　　文献标识码:A　　　　文章编号:1672-2981 (2010)11-0820-04
　　基金项目:山东省科学院科技发展基金项目 (No.SY2007BS10)。
作者简介:陈锡强 , 男 , 博士 , 主要从事天然产物抗肿瘤筛选, E-m ail:cxqq 1972 @163.com　　＊通讯作者:刘可春 , 男, 博士 ,
研究员 , 主要从事天然药物活性筛选 , T el:(0531) 82605352.E-mai l:hliu kch@k eylab.net
Cen t ral South Pharmacy.November 2010 , Vol.8 No.11　中南药学 2010年 11月第 8卷第 11期
　821　
do i:10.3969/ j.issn.1672-2981.2010.11.007
Anti-angiogenic activity of extract fromWinged Euonymus Twig
CHEN Xi-qiang 1 , 2 , HE Qiu-x ia1 ,2 , YAN Shou-sheng 3 , LIU Ke-chun1 ,2 ＊ , HOU Hai-rong 1 , 2 , HAN Li-w en1 , 2 ,
WANG Si-feng1 , 2 , YUAN Yan-qiang1 , 2 (1.Biolog y Institute o f S handong Academy of Sciences , J inan 250014;2.
Shandong Key Laboratory o f Biosensors , J inan 250014;3.Qilu Pharmaceutical Co., LTD., J inan 250014)
Abstract:Objective　 To study the anti-angiog enic activity of ext ract fr om Winged Euonymus Twig.Methods　H u-
man umbilica l vein endo thelial cells (HUVEC)model , r at aor tic ring model and chicken chorioallantoic membrane
(CAM)model we re used to evaluate the anti-angiog enesis effect o f ex tract f rom Ramulus E uonymi respectiv ely.Re-
sults　Ex tract from Winged Euonymus Twig inhibited the prolifera tion of H UVEC with inhibition ratio of 36.2% at 8
μg·m L-1 .Ex tract from Winged Euonymus Twig could inhibit the neovascula rization of ra t ao rtic ring s w ith inhibition
ra tio of 56.41% and 65.25% at 2 and 4 μg ·mL-1 .I n the chicken CAM experiment , extr act fr om Winged Euonymus
Tw ig induced 22.6% and 31.2% inhibition ratio o f microvessel density at 20 and 40μg· egg-1 , respectiv ely.Conclu-
sion　Ex tract from Winged Euonymus Twig show es significant anti-angiog enic activities.
Key words:Winged Euonymus Tw ig;angio genesis;human umbilical vein endothelial cell;rat ao r tic rings;chicken
cho rioallantoic membrane
　　中药材鬼箭羽 (Winged Euonymus Tw ig , WET)为卫
矛科植物卫矛的带翅嫩枝或枝翅 , 有行血通经 、 散瘀止痛的
功效 , 主要用来治疗月经不调 、 瘀血 、 腹痛 、 冠心病 、 风湿
痹痛等症。现代药理研究表明 WET 具有抗心肌缺血 、 抗缺
氧 、 降血脂 、 降血糖 、 抗过敏的药理作用[ 1-3] 。利用斑马鱼
筛选模型所需样品量少 、 试验周期短 、 药效评价简单 、 高通
量筛选等特点[ 4] , 对多种常见中药材的系统溶剂提取物进行
了抑制血管生成的活性筛选。研究发现中药材WET 的提取
物具有抑制血管生成的作用 , 我们利用人脐静脉内皮细胞
(HUVEC)增殖模型 、 大鼠动脉环模型和鸡胚绒毛尿囊膜
(CAM)模型进一步试验 , 证实了WET 的抗血管生成活性。
1　材料
1.1　试剂与仪器
鬼箭羽 [ 济南市建联中药店 , 经宋广运研究员鉴定为卫
矛属植物卫矛 Euonymus.alatus (Thunb.). Sieb.的枝] 。
DMEM 培养基 、 RPMI-1640 培养基与胎牛血清 (FBS)
(Gibco 公司 , Life Techno log ies , USA);M199 培养液 (齐
鲁制 药);M atrigel 胶 (BD 公 司);麻 醉 剂 T ricaine
(MS222 , Sigma公司);M ultiskan FC 型酶标仪 (美国 the r-
mo 公司);COIC XSZ-H 型荧光显微镜 (重庆光电仪器有
限公司);超净工作台 (苏州安泰净化消毒设备厂);CO2 多
用培养箱 (上海医用仪器设备公司);甲基纤维素片 (经过
高压灭菌 , 备用)。
1.2　细胞培养与实验动物
人脐静脉内皮细胞取自 12 h 以内的新鲜脐带 , 经过酶
解 、 消化 、 离心 、 培养后传代 , 实验所用为 10 ～ 12 代;种
鸡蛋 (济南滋平家禽养殖有限公司);Wistar 大鼠 2 只 , 体
重 400 g 左右 [ 山东大学实验动物中心 , SCXK (鲁)
20080004]
1.3　样品的制备
WET 4 kg 粉碎后 , 用 95%的乙醇提取 3 次后 , 合并提
取液 , 浓缩回收至无醇味 , 得浸膏 1 200 mL , 浸膏依次用
石油醚 、 氯仿 、 乙酸乙酯 、 正丁醇进行超声提取 , 氯仿层萃
取物经过浓缩 、 真空干燥 , 共得氯仿提取物 26.2 g。氯仿提
取物 20 g 经硅胶柱色谱分离 , 洗脱剂为氯仿-甲醇梯度洗
脱 , 共得到 13 部位 ,部位Ⅵ (GJY-Ⅵ)浓缩干燥后为 1.2 g ,
置冰箱中 , 备用。
2　方法
2.1　人脐静脉内皮细胞增殖实验
HUVEC 用无血清的 M199 培养液稀释到 5×105 个 ·
m L-1 , 按 96 孔板每孔 100 μL接种于 96 孔培养板中 , 每孔
加 2%成纤维细胞生长因子 (BGFG) 6 μL , 96 孔板放入
CO 2 培养箱 24 h。 24 h 细胞贴壁后去除培养基 , 实验组加
入终浓度为 8、 4 、 2 μg· mL -1的含 GJY-Ⅵ 培养基 , 溶剂
对照组加入含 0.1%DMSO 的 RPMI-1640 培养基;另设细
胞对照组 , 只加入 RPMI-1640 培养基。每组均设 8 个复
孔 , 培养 48 h 后 , 各孔用 PBS 清洗 1 次后 , 按 200 μL ·
孔-1加入无血清培养基及 20 μL · 孔-1 MT T 溶液 (5 g ·
L-1)继续培养 4 h。弃上清液 , 加入 150 μL DMSO 溶解 ,
振荡混匀。在自动酶标仪上 570 nm 处检测吸光度 (A)值 ,
统计各组细胞数量并计算各组抑制率。
抑 制 率 的 计 算 方 法 如 下: 抑 制 率 =
细胞对照组平均值-实验组平均值
细胞对照组平均值 ×100%
2.2　大鼠动脉环实验
实验方法参照 huang 的方法改进[5] , SD 大鼠 2 只 , 脱
臼法处死 , 取其长约 3 cm 的胸主动脉 , 剪去外围结缔组织 ,
剪成长约 1 mm 的动脉环 , 按小管形成的方法 , 配制培养混
合胶和加药 , 在预冷的 96 孔细胞培养板中 , 每孔加入预先
融化的 Matrigel 50 μL (提前 12 h 将 Matrig el放入 4 ℃冰箱
中融化 , 使用前稀释 1 倍), 将血管环放入胶中包埋;37 ℃
中南药学 2010年 11月第 8卷第 11期　Cen t ral South Pharmacy.November 2010 , Vol.8 No.11
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孵育 1 h , 使胶凝固;加入含 10% FBS 的 DMEM 培养液
30 μL , 并加入 2 、 4 μg ·m L-1的 GJY-Ⅵ , 每个浓度至少
6个复孔 , 96 孔板放培养箱内常规培养;第 3 日更换新鲜培
养基 , 并换药 1 次;第 6 日取出 , 显微镜 (OLYM PUS ,
DP70 , Japan)下倒置显微镜下观察动脉环附近内皮细胞和
新生血管的生成情况 , 并拍照 (×200);随机选择 3 个面积
拍照并运用 Image Pro Plus 软件计算微血管所覆盖的面积。
2.3　鸡胚绒毛尿囊膜实验
7 日龄 45 只活胚蛋 , 随即分组为 3 组 , 每组 15 个 , 在
照卵灯下寻找胚头中轴侧区域 , 划定 1 cm ×1 cm 圆形开窗
部位 , 用 75%乙醇溶液消毒开窗部位 , 在鸡胚气室端钻孔
2 mm 小孔并穿透壳膜。暴露出鸡胚绒毛尿囊膜 , 将甲基纤
维素滤膜放置于尿囊膜上血管部位 , 用微量进样器将各组药
物滴加入甲基纤维素滤膜中 , 3 组分别为生理盐水 10 μL、
GJY-Ⅵ 20μg ·个-1 、 GJY-Ⅵ 40μg·个-1 , 加药完毕后
用胶带密实封口。并继续放入 38 ℃的孵箱内孵育 72 h。
新生血管数量计算:揭开透明胶带 , 加满 4%多聚甲
醛 , 室温下原位固定 30 min。待鸡胚绒毛尿囊膜 CAM 上血
管内的血液凝固后 , 揭去封窗的透明膜 , 剪除 CAM 水平以
上的蛋壳 , 以滤膜载体为中心把 CAM 剪下 , 投入水中 , 使
其舒展开 , 并将其在水中转移到载玻片上 , 自然干燥。拍照
后用 Pho toshop 选定照片上的一定面积 (700×700 像素),
计算 3 个面积内的平均血管数目计入统计。
2.4　统计方法
采用 SPSS 11.3 软件 , 组间比较 t检验等。
3　结果
3.1　鬼箭羽提取物对人脐静脉内皮细胞增殖的影响
0.1% DMSO 溶剂对人脐静脉内皮细胞的增殖无影响;
8 μg·m L-1时WET 提取物对人脐静脉内皮细胞增殖有显著
性的抑制作用 (P<0.01 , 见表 1)。
表 1　WET提取物对人脐静脉内皮细胞的影响 (x±s , n=8)
Tab 1　Effect of WET on the HUVEC(x±s, n=8)
分组
(group)
浓度
(concent ration)
/μg·mL-1
细胞
存活力
(cell
survival)
抑制率
(inhibi tory
rate)
/ %
对照组 -- 0.96±0.19 -
溶剂组 0.1%DMSO 0.96±0.12 0
GJY-Ⅵ 组 2 0.96±0.14 0
4 0.89±0.18 7.3
8 0.61±0.08## 36.5
　　注:与对照组比较 , ##P<0.01。
　　n ote:vs the cont rol g rou p , ##P<0.01.
3.2　WET 提取物对大鼠动脉环新生血管的影响
接种第 3 日起 , 对照组开始看见动脉环周围内皮细胞增
殖 , 逐渐成条索状血管芽 , 第 6 日对照组出现新生微血管 ,
内皮细胞聚集成环状;WET 提取物组细胞分布零散 、 无聚
集 , 微血管覆盖面积显著低于生理组 (见图 1)。WET 提取
物对大鼠主动脉环血管生成的抑制作用 , 具有浓度依赖性
(见表 2)。
表 2　WET提取物对大鼠动脉环血管生成数目及血管面积的影响(x±s , n=6)
Tab 2　Effect of WET on rat aorta ring assay and area of blood vessels(x±s , n=6)
组别
(group)
浓度 (concent rat ion)
/μg·mL -1
动脉环计量
(rat aorta ring as say inhibitory rate)/ %
血管面积计数
(area of blood ves se)
对照组 -- 151.16±18.26 9 547.83±569.32
GJY-Ⅵ 组 2.0 65.88±20.80##(56.41) 7 263.42±844.12##
4.0 52.52±23.61##(65.25) 5 594.17±1970.6##
　　注:＊与对照组比较 , ##P<0.01。
　　note:vs th e cont rol group , ##P <0.01.
图 1　鬼箭羽提取物对大鼠动脉环血管生成的影响
Fig 1　Ef fect of WET on rat aorta ring assay
A .对照组 (箭头为细胞聚集成环区域)(con t rol group);B.GJY
-Ⅵ 2 μg·mL-1组 (GJY-Ⅵ , 2 μg·mL -1 group)
3.3　WET 提取物对 CAM 血管生成的影响
WET 提取物处理鸡胚 72 h 后 , 3 个实验组中可计入统
计的数量分别为 8 、 12、 12个 。实验结果显示 , 对照组微孔
滤膜周围 CAM 血管生长良好 , 呈树枝状 、 叶脉样 、 平行生
长 , WET 药物组血管变细 、 侧枝减少 、 药物滤膜远端血管
密度增加等现象 (见图 2)。统计结果显示 , 20 μg 组及 40
μg 组均显示出血管生成减少现象 , 抑制率随着剂量增加而
增加 (见表 3)。
表 3　WET提取物对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成数目及抑制率的影响
(x ±s)
Tab 3　WET extract on CAM angiogenesis inhibition(x±s)
组别
(group) n
剂量
(dose)
/μg· egg -1
血管计数
(vascular
number)
抑制率
(in hibit ion
rate)
对照组 8 -- 93.95±12.97 --
GJY-Ⅵ组 12 20 72.06±11.30## 22.6
12 40 63.91±18.70## 31.2
　　注:＊与对照组比较 , ##P<0.01。
　　n ote:vs the cont rol g rou p , ##P<0.01.
4　讨论
肿瘤的生成 、 转移 、 复发和预后均与肿瘤血管生成密切
相关 。恶性肿瘤的侵袭性生长及转移依赖于血管生成(angio-
Cen t ral South Pharmacy.November 2010 , Vol.8 No.11　中南药学 2010年 11月第 8卷第 11期
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图 2　GJY-Ⅵ 对鸡胚绒毛尿囊膜的影响
Fig 2　Ef fect of WET on the angiogenic activi ty of the CAM
A.对照组 (cont rol g roup);B.GJY-Ⅵ 20 μg · 个-1组 (WET
group , 20 μg· egg -1)
genesis), 抑制肿瘤血管生成是不同于常规抗肿瘤治疗的新
策略。以肿瘤血管生成为靶点 , 筛选和开发新型抗肿瘤治疗
药物是当前肿瘤治疗与研究的热点问题之一。
WET 有着十分广泛的临床应用 , 尤其在治疗糖尿病和
肾病方面有着很好的疗效[ 6-8] , WET 也是抗肿瘤中药复方的
常用药物。我们采用多个血管生成实验对 WET 提取物的活
性进行了验证 , 结果显示 8 μg·mL -1WET 提取物能够显著
性抑制人脐静脉内皮细胞的增殖 , 抑制率达到36.2%;2μg·
mL-1和 4 μg ·mL-1对大鼠动脉环血管生成有显著性抑制 ,
并呈现出剂量依赖 , 说明内皮细胞增殖引起的血管结构生成
和组织能够被 WET 提取物中活性物质抑制。 7 日龄鸡胚
CAM 正经历从出芽血管生成期到套叠血管生成的阶段[9] ,
生理情况下新生血管数量大量增加 , 为观察药物作用最佳时
期 , 本实验中 20 μg ·个-1和 40 μg ·个-1WET 提取物对 7
日龄鸡胚 CAM 的生成有显著性的抑制作用 , 说明WET 提
取物中有抑制 CAM 新血管生成的成分。通过本实验说明传
统药材WET 的成分中含有较强抑制血管生成的成分 , 这与
WET 抗肿瘤的作用有相关性 , 因而能够解释传统应用的部
分机制。
WET 提取物抑制血管生成的作用在国内未见报道。 Un
-Kyo等的研究发现卫矛科植物正丁醇的提取物对血管生成
相关基因 MM P9 的表达有显著性的抑制作用[ 10] 。在本研究
中活性部分为氯仿层 , 因而我们相信所含抑制血管生成的有
效成分不同。研究表明WET 氯仿层中含有松萝酸 、 羽扇豆
酮 、 白桦脂醇 、 齐墩果酸 (Ⅶ )等成分[ 11-12] 。在本实验的
WET 提取物中 , 究竟是已知还是未知成分在起抑制血管生
成的作用 , 有待进一步研究。
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(收稿日期:2010-09-25;修回日期:2010-10-19)
精制妇科千金片对生物性大鼠子宫内膜炎的作用
王蓉蓉1 , 潘善庆1 , 田洪1 , 欧阳杰湖1 , 陈子渊1 , 左之文2 , 颜利玲2 (1.湖南省药品检验所 , 长沙　
410001;2.湖南省株洲千金药业有限公司 , 湖南株洲　412003)
摘要:目的　探讨精制妇科千金片对生物性大鼠子宫内膜炎的作用。方法　SD 大鼠随机分为正常对照组 , 模型组 ,
阳性药物金鸡胶囊组 , 精制妇科千金片高 、 中 、 低剂量组。除正常对照组外 , 其他动物均用大肠埃希菌造成生物性
　　作者简介:王蓉蓉 , 女 , 副主任药师 , 主要从事药品质量检测及安全性研究以及新药研发工作 , Tel:(0731) 82275832 , E-mail:
w ang2 rcn@yah oo.com.cn
中南药学 2010年 11月第 8卷第 11期　Cen t ral South Pharmacy.November 2010 , Vol.8 No.11