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(2013-05-23 收稿 责任编辑徐春燕)
doi:10． 3969 / j． issn． 1671-6825． 2013． 06． 003
* 国家自然科学基金资助项目 39870900;广东省中医药局建设中医药强省课题 20111057;佛山市医学类科技攻关项目 201108064;佛山科
学技术学院博士启动基金 2012006(佛山科学技术学院校级科研项目资助)
半边旗提取物 5F 对乳癌细胞 MDA-MB-231 培养物诱导的
HUVEC血管生成潜能的影响*
何振辉1) ，翁闪凡1) ，何太平2) ，覃燕梅2) ，梁念慈3) #
1)佛山科学技术学院医学院医学检验系 佛山 528000 2)广东医学院生物化学与分子生物学研究所 湛江 524023 3)广东省
天然药物研究与开发重点实验室 湛江 524023
#通讯作者，男，1940 年 5 月生，本科，教授，研究方向:生化药理学，E-mail:ncliang@ gdmc． edu． cn
关键词 半边旗提取物;5F;人脐静脉内皮细胞;KDＲ;Flt-1;血管生成;MDA-MB-231
中图分类号 Ｒ978． 7
摘要 目的:研究半边旗提取物 5F对乳癌细胞 MDA-MB-231 培养物(乳癌细胞培养物)诱导的人脐静脉内皮
细胞(HUVEC)血管生成潜能的影响及其作用机制。方法:MTT法检测不同浓度 5F对乳癌细胞培养物诱导的 HU-
VEC增殖的抑制作用;Transwell小室法检测不同浓度 5F对乳癌细胞培养物诱导的 HUVEC穿膜能力和趋化性运动
能力的影响;细胞-基质黏附实验检测 5F对乳癌细胞培养物诱导的 HUVEC黏附能力的影响;ＲT-PCＲ、Western blot
法检测不同浓度 5F对乳癌细胞培养物诱导的 HUVEC KDＲ、Flt-1 mＲNA和蛋白表达的影响。结果:不同浓度 5F处
理 6、24 h后对乳癌细胞培养物诱导的 HUVEC的增殖有一定程度的抑制作用(F组间 = 64． 852，F时间 = 131． 393，P ＜
0． 001)。20、40、80 μmol /L 5F可抑制乳癌细胞培养物诱导的 HUVEC 体外穿膜能力、趋化性运动能力和黏附基质
能力(F = 48． 206、147． 613、22． 081，P均 ＜ 0． 001)。不同浓度 5F作用于乳癌细胞培养物诱导的 HUVEC 24 h后，下
调 HUVEC KDＲ、Flt-1 mＲNA和蛋白的表达(mＲNA:F = 86． 381、79． 175;蛋白:F = 36． 621、127． 910，P 均 ＜ 0． 001)。
结论:5F抑制乳癌细胞培养物诱导的 HUVEC体外增殖、穿膜能力、趋化性运动能力和黏附基质能力，其机制可能
与下调细胞 KDＲ mＲNA和蛋白的表达水平有关。
Effect of Pteris semipinnata L extract 5F on angiogenic abilities of HU-
VEC induced by the culture of MDA-MB-231 cells
HE Zhenhui1)，WENG Shanfan1)，HE Taiping2)，QIN Yanmei2)，LIANG Nianci3)
·427· 郑州大学学报(医学版) 2013 年 11 月 第 48 卷 第 6 期
1)Department of Laboratory Medicine，Medical College，Foshan University，Foshan 528000 2)Institute
of Biochemistry and Molecular Biology，Guangdong Medical College，Zhanjiang 524023 3)Guangdong
Provincial Key Laboratory for the Ｒesearch and Development of Natural Drugs，Zhanjiang 524023
Key words Pteris semipinnata L extract;5F;HUVEC;KDＲ;Flt-1;angiogenesis;MDA-MB-231
Abstract Aim:To investigate the effect and its possible mechanisms of Pteris semipinnata L extract(5F)on angio-
genic abilities of human umbilical vein endothelial cells(HUVEC)induced by the culture of human high metastatic breast
cancer MDA-MB-231 cells． Methods:MTT assay was used to evaluate the cell proliferation of HUVEC induced by the cul-
ture of MDA-MB-231 cells after being treated by 5F for 6 h and 24 h． The effect of 5F on invasion and migration of HUVEC
induced by the culture of MDA-MB-231 cells was measured by transwell chamber assay． The adhesive potential of HUVEC
cells induced by the culture of MDA-MB-231 cells was tested by cell-matrix adhesion assay． ＲT-PCＲ and Western blot
were applied to detect the expression levels of KDＲ，Flt-1 mＲNA and protein in HUVEC induced by the culture of MDA-
MB-231 cells． Ｒesults:5F inhibited the proliferation of HUVEC induced by the culture of MDA-MB-231 cells after 6 h
and 24 h treatment(Fgroup = 64． 852，Ftime = 131． 393，P ＜ 0． 001)． 20，40 and 80 μmol /L 5F significantly inhibited the in-
vasion，migration and adhesion to matrigel of HUVEC induced by the culture of MDA-MB-231 cells (F = 48． 206，
147． 613，22． 081，P ＜ 0． 001)． After 24 h treatment，5F down-regulated the expressions of KDＲ，Flt-1 mＲNA and protein
(mＲNA:F = 86． 381，79． 175;protein:F = 36． 621，127． 910，P ＜ 0． 001)induced by the culture of MDA-MB-231 cells．
Conclusion:5F could inhibit the proliferation，invasion，and migration of HUVEC induced by the culture of MDA-MB-231
cells and adhesion to matrix of HUVEC，which may be involved in its down-regulation of the expression of KDＲ．
半边旗(Pteris semipinnata L，PsL)又名半边蕨、
半边梳，为凤尾蕨科凤尾蕨属植物，广泛分布于南方
各省，民间常用于清热解毒、消肿止痛。5F 是作者
所在的课题组从 PsL 中提取的二萜类化合物，化学
名为 11α-羟基-15-氧-16-烯-ent-贝壳杉烷-19 酸，分
子式为 C20 H28 O4，相对分子质量为 332． 4。以往的
研究［1-2］表明，5F能诱导多种肿瘤细胞凋亡，具有较
强的抗肿瘤活性。何太平等［3-4］发现 5F 影响高转
移卵巢癌细胞 HO-8910PM 多种癌相关基因尤其是
P53、Nr1d1 的表达。作者以人脐静脉内皮细胞
(HUVEC)为受试对象，研究 5F 对高转移乳癌细胞
MDA-MB-231 培养物诱导的 HUVEC 血管生成潜能
的影响，并分析其作用机制。
1 材料与方法
1． 1 材料 HUVEC、MDA-MB-231 细胞分别购自
美国 Cascade Biologics公司和美国典型培养物保藏
中心。小牛血清购自杭州四季青公司，MTT 购自
Amresco公司，DMEM 培养基购自 Gibco 公司，PVPF
滤膜(孔径 8 μm，直径 13 mm)购自 Osmonics公司，
Fibronectin、Matrigel 购自 BD 公司。KDＲ 小鼠 IgG
单抗、Flt-1 小鼠 IgG 单抗、β-actin 山羊 IgG 多抗购
自 Santa Cruz 公 司，使 用 时 以 TBST 溶 液 按
1∶(1 000 ～ 2 000)稀释;辣根过氧化物酶标记山羊
抗小鼠 IgG、兔抗山羊 IgG 购自北京中杉金桥生物
技术有限公司，使用时以 TBST溶液按 1∶(4 000 ～
10 000)稀释。5F由广东医学院天然药物开发中心
提供，实验前以 DMSO溶解，培养液稀释。
1． 2 细胞培养和乳癌细胞培养物的制备 MDA-
MB-231 细胞、HUVEC分别培养于含体积分数 10%
小牛血清、1 × 105 U /L青霉素和 100 mg /L链霉素的
DMEM完全培养基中，37 ℃、体积分数 5%CO2 饱和
湿度孵箱中培养。
取生长良好的 MDA-MB-231，弃去培养液，加入
无血清 DMEM培养液继续培养 24 h，收集上清，即
为乳癌细胞培养物，过滤除菌，备用。
1． 3 HUVEC增殖抑制实验 采用 MTT 法。参照
文献［5］，选取处于对数生长期的 HUVEC，确保细胞
存活率在 97% 以上。细胞以(0． 5 ～ 1． 0)× 105
mL －1接种于 96 孔培养板，每孔 100 μL。在 37 ℃、
体积分数 5%CO2、饱和湿度条件下过夜，换乳癌细
胞培养物后，用药组加入 1 μL 不同浓度 5F，使 5F
终浓度为 10、20、40、80、160 μmol /L，每个浓度设 3
个平行孔，并设空白对照组、溶剂对照组及完全培养
基调零孔，置孵箱中 6、24 h后，每孔加入 10 μL 5 g /
L MTT 继续培养 4 h。倾去培养液，每孔加入 200
μL DMSO 溶解，于酶标仪上测定波长 570 nm 处的
吸光度。实验重复 3 次。细胞增殖抑制率 =(1 －
给药组细胞吸光度值 /对照组细胞吸光度值)×
100%。
1． 4 乳癌细胞培养物诱导的 HUVEC穿膜、趋化性
运动能力测定［6］ 将 PVPF 滤膜用指甲油贴在 Tr-
·527·Journal of Zhengzhou University(Medical Sciences) Nov． 2013 Vol． 48 No． 6
answell小室上，风干;在膜的外表面涂 10 μL 纤连
蛋白(5 μg) ，置超净台内风干，膜的内表面涂 10 μL
Matrigel(5 μg) ，干燥后形成人工重组基底膜。收集
对数生长期的 HUVEC，悬浮于 1 g /L BSA-DMEM无
血清培养基中，调整密度为 1 × 109 L －1。将 Tran-
swell小室浸于 24 孔板(每孔预先加入 600 μL 乳癌
细胞培养物)中，每个小室加入 100 μL HUVEC 悬
液，同时加入 20、40、80 μmol /L 的 5F 1 μL，对照组
加入等量的 PBS。37 ℃、体积分数 5% CO2 孵箱内
孵育 6 h。将 Transwell小室取出，滤膜用甲醇固定 1
min，苏木素染色 3 min，水洗，伊红染色 10 s，水洗，
用生理盐水浸湿的棉签擦去滤膜内表面的细胞;用
封片胶将滤膜封于载玻片上，于高倍镜下计数穿膜
细胞。每膜计数 5 个视野，每组平行设 3 个滤膜。
趋化性运动能力测定与上述实验相比，只是 PVPF
滤膜上不铺 Matrigel，其余处理相同。抑制率 =
(1 －给药组穿膜或迁移细胞数 /对照组穿膜或迁移
细胞数)× 100%。
1． 5 HUVEC基质黏附实验 96 孔培养板每孔预
铺 Matrigel，置超净台内风干后用 20 g /L BSA封闭 1
h，PBS冲洗;收集预先经 20、40 和 80 μmol /L 5F 处
理 24 h的以乳癌细胞培养物培养的 HUVEC 细胞，
悬浮于含 1 g /L BSA-DMEM 培养基中，调整细胞密
度为 8 × 105 mL －1，每孔加入 100 μL，并设空白对照
组、溶剂对照组及 DMEM培养基调零孔。37 ℃培养
1 h;弃培养液，以 PBS 轻轻冲洗 3 遍除去未黏附细
胞;弃去 PBS，每孔加入 100 μL DMEM 完全培养基
和 50 μL 1 g /L MTT继续培养 4 h。倾去 MTT，每孔
加入 150 μL DMSO溶解，振摇 15 min，于酶标仪上
测定波长 570 nm处的吸光度。每组平行设 3 个孔，
实验重复 3 次。黏附抑制率 = (1 －给药组黏附细
胞吸光度 /对照组黏附细胞吸光度)× 100%。
1． 6 各组细胞 Flt-1和 KDＲ mＲNA的检测［7］ 待
HUVEC贴壁生长后，加入乳癌细胞培养物，再分别
加入 PBS、体积分数 0． 1% DMSO 和终浓度为 20、
40、80 μmol /L 5F，处理 24 h 后收集细胞，提取总
ＲNA，逆转录为 cDNA。Flt-1 上游引物 5-GAC
TAGATAGCGTCACCAG-3，下游引物 5-TAAGACT
GCCAAAGATGTT-3;KDＲ 上游引物 5-AGGGTG
GAGGTGACTGAG-3， 下 游 引 物 5-GAGTCAGT
GGAGGTGGGA-3;GAPDH 上 游 引 物 5-TCATT
GACCTCAACTACATGGTTT-3， 下 游 引 物 5-
GAAGATGGTGATGGGATTTC-3。PCＲ 反应体系按
试剂盒说明配制，在 Mx3000P实时定量荧光 PCＲ仪
上进行反应。反应条件:94 ℃变性 5 min;94 ℃ 10
s，53 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s，共循环 40 次。记录各管 Ct
值，采用 2 － ΔΔCt法计算 Flt-1、KDＲ 及 GAPDH mＲNA
的表达量，以 Flt-1 /GAPDH 及 KDＲ /GAPDH 作为
Flt-1 及 KDＲ mＲNA的相对表达量。
1． 7 各组细胞 Flt-1和 KDＲ 蛋白的检测 细胞同
1． 6 中分组处理 24 h，收集，PBS 洗涤后用预冷的细
胞裂解液刮下，转移至预冷的 1． 5 mL 离心管中，冰
育 30 min后，于 4 ℃，12 000 g 离心 15 min，收集上
清。取少量上清用考马斯亮蓝法进行蛋白定量。
Western blot的方法参照《分子克隆实验指南》，以
β-actin为内参。溶剂对照组及不同剂量 5F 组 Flt-1
和 KDＲ 蛋白的相对表达量为各组相应指标与空白
对照组的比值 × 100%。
1． 8 统计学处理 采用 SAS V8． 1 处理数据。采
用 2 × 7 析因设计的方差分析比较处理不同时间各
组细胞的增殖抑制率，余指标采用单因素方差分析，
组间两两比较用 SNK-q检验。检验水准 α = 0． 05。
2 结果
2． 1 5F对乳癌细胞培养物诱导的 HUVEC增殖的
抑制作用 见表 1。5F 对乳癌细胞培养物诱导
HUVEC 的增殖具有一定程度的抑制作用，并且
抑制率均随浓度和时间的增加而增加。20、40、
80 μmol /L 的 5F 在 6 h 内对血管内皮细胞生长
的抑制率均低于 10%，且与空白对照组相比，差
异无统计学意义，因此在考察 5F 对 HUVEC 体外
穿膜和趋化性运动能力的影响时，为了排除 5F
自身对细胞的毒性作用，选择 20、40、80 μmol /L
作为实验浓度。
表 1 5F对乳癌细胞培养物
诱导的 HUVEC增殖的抑制作用(n = 3)
组别
抑制率 /%
6 h 24 h
空白对照组 0． 00 ± 0． 34 0． 00 ± 8． 26
溶剂对照组 － 0． 87 ± 1． 77 0． 48 ± 4． 59
10 μmol /L 5F组 1． 46 ± 4． 36 4． 01 ± 1． 46
20 μmol /L 5F组 2． 68 ± 0． 77 9． 40 ± 7． 70
40 μmol /L 5F组 3． 04 ± 3． 68 25． 01 ± 1． 92*
80 μmol /L 5F组 5． 73 ± 1． 13 37． 04 ± 3． 57*
160 μmol /L 5F组 15． 77 ± 4． 03* 58． 65 ± 5． 43△
F组间 =64． 852，F时间 =131． 393，F交互 =23． 266，P ＜0． 001;* :与
空白对照组相比，P ＜0． 05;△:与空白对照组相比，P ＜0． 01。
2． 2 5F对乳癌细胞培养物诱导的 HUVEC 穿膜能
力、趋化性运动能力及黏附基质能力的影响 见图
·627· 郑州大学学报(医学版) 2013 年 11 月 第 48 卷 第 6 期
1、2及表 2。5F 能明显抑制乳癌细胞培养物诱导的
HUVEC穿膜能力、趋化性运动能力及黏附基质能力。
图 1 穿膜能力实验中
黏附在 PVPF膜上的 HUVEC(× 400)
A:空白对照组;B:80 μmol /L 5F 组。
图 2 趋化性运动能力
实验中黏附在 PVPF膜上的 HUVEC(× 400)
A:空白对照组;B:80 μmol /L 5F 组。
表 2 5F对乳癌细胞培养物诱导的 HUVEC穿膜
能力、趋化性运动能力及黏附基质能力的影响(n = 3) %
组别 穿膜能力抑制率 趋化性运动能力抑制率 黏附抑制率
空白对照组 0． 00 ± 6． 54 0． 00 ± 7． 27 0． 00 ± 5． 76
溶剂对照组 － 0． 63 ± 3． 67 0． 69 ± 7． 05 － 1． 77 ± 6． 80
20 μmol /L 5F组 19． 54 ± 3． 68* 20． 45 ± 4． 68* 19． 00 ± 5． 63*
40 μmol /L 5F组 26． 89 ± 7． 07* 38． 65 ± 3． 75* 24． 50 ± 6． 68*
80 μmol /L 5F组 40． 34 ± 6． 14* 61． 87 ± 2． 29* 33． 25 ± 7． 64*
F 48． 206 147． 613 22． 081
P ＜ 0． 001 ＜ 0． 001 ＜ 0． 001
* :与空白对照组相比，P ＜ 0． 01。
2． 3 5F 对乳癌细胞培养物诱导的 HUVEC Flt-1、
KDＲ mＲNA和蛋白表达的影响 见图 3，表 3、4。
不同浓度的 5F作用于乳癌细胞培养物诱导的 HU-
VEC 24 h后，细胞中 Flt-1、KDＲ mＲNA和蛋白的表
达水平均下调。
表 3 各处理组 HUVEC KDＲ、
Flt-1 mＲNA相对表达量的比较(n = 3) × 10 －4
组别 KDＲ Flt-1
空白对照组 56． 22 ± 1． 95 46． 71 ± 1． 50
溶剂对照组 59． 21 ± 1． 70 47． 53 ± 1． 69
20 μmol /L 5F组 46． 58 ± 2． 68* 43． 48 ± 1． 80*
40 μmol /L 5F组 31． 93 ± 1． 01* 22． 43 ± 1． 02*
80 μmol /L 5F组 29． 24 ± 0． 91* 19． 71 ± 1． 98*
F 86． 381 79． 175
P ＜ 0． 001 ＜ 0． 001
* :与空白对照组相比，P ＜ 0． 05。
图 3 5F对乳癌细胞培养物
诱导的 HUVEC KDＲ、Flt-1蛋白表达的影响
1:空白对照组;2:溶剂对照组;3:20 μmol /L 5F 组;4:40
μmol /L 5F组;5:80 μmol /L 5F组。
表 4 各处理组 HUVEC KDＲ、
Flt-1 蛋白表达的比较(n = 3) %
组别 KDＲ Flt-1
空白对照组 100． 67 ± 4． 93 101． 17 ± 7． 29
溶剂对照组 103． 33 ± 7． 23 97． 33 ± 11． 02
20 μmol /L 5F组 68． 77 ± 7． 51* 86． 67 ± 6． 35*
40 μmol /L 5F组 60． 33 ± 6． 00* 31． 65 ± 3． 51*
80 μmol /L 5F组 54． 67 ± 4． 73* 37． 02 ± 3． 01*
F 36． 621 127． 910
P ＜ 0． 001 ＜ 0． 001
* :与空白对照组相比，P ＜ 0． 05。
3 讨论
对于肿瘤血管生成抑制剂，一般可以用分子模
型、细胞模型、组织器官模型来筛选和研究其作用机
制。随着内皮细胞培养技术的发展，血管形成的许
多过程都可以用血管内皮细胞模型进行研究，如血
管内皮细胞的增殖、血管内皮细胞向肿瘤组织的浸
润、运动等［8］。该研究结果显示 5F 具有抑制高转
移乳癌细胞培养物诱导的 HUVEC 体外增殖、穿膜、
趋化性运动能力和黏附基质能力。但体外有作用的
物质在体内不一定有相同的作用，结合先前的研
究［9］，下一步应以具体的体内实验如构建裸鼠乳癌
模型来观察 5F抗肿瘤血管生成的作用。
·727·Journal of Zhengzhou University(Medical Sciences) Nov． 2013 Vol． 48 No． 6
肿瘤血管生成的首要环节是肿瘤血管生成因子
与血管生成抑制因子失衡，血管生成表型形成。在
诸多血管生成因子中，血管内皮生长因子(vascular
endothelial growth factor，VEGF)居于中心地位［10］。
VEGF与其受体结合后发挥生物学作用。目前，
VEGF受体(VEGFＲ)已发现有 5 种:VEGFＲ-1(Flt-
1) ，VEGFＲ-2(KDＲ/Flk-1) ，VEGFＲ-3(Flt-4) ，NP-1
和 NP-2。Flt-1、KDＲ、Flt-4 均是受体酪氨酸蛋白激
酶;Flt-1、KDＲ是 VEGF的主要受体，主要在血管内皮
细胞上表达，Flt-4主要存在于淋巴管内皮细胞［11］。
KDＲ是 VEGF最重要的受体，处于信号转导的
上游。Ｒastelli等［12］发现 VEGFＲ-2 在 VEGF所诱导
的血管生成和血管通透性中起主要作用。单独使用
KDＲ抑制剂就能阻断 VEGF和 bFGF所诱导的血管
生成。VEGF 能通过 Grb10 上调 KDＲ 的表达。活
化的 KDＲ能够激活 PI3K、PLC-γ，引起血管内皮细
胞的迁移和血管通透性增加;通过黏附斑激酶和 Src
的相互作用，促进血管内皮细胞的增殖和运动，抑制
其凋亡［13］。该实验结果显示 5F可下调乳癌细胞培
养物诱导的 HUVEC 中 KDＲ mＲNA 和蛋白的表达，
这可能是 5F 抑制 MDA-MB-231 细胞培养物(含有
高分泌水平 VEGF)引发的血管内皮细胞的增殖、运
动、浸润基底膜等生物学作用的原因。
在 VEGFＲ中，Flt-1 的信号转导机制目前还未
明了。基因敲除方法显示 Flt-1 缺乏的小鼠死于血
管生成过多。Flt-1 mＲNA 的剪接可产生可溶性的
Flt-1(sFlt-1)。sFlt-1跟 VEGF结合后，不能发生信号
转导。sFlt-1能抑制肿瘤血管生成。也有报道［14］认
为 Flt-1能诱导单核巨噬细胞迁移并分泌 VEGF，因此
Flt-1信号转导通路能促进肿瘤生长和转移。该实验
结果显示 5F 下调 MDA-MB-231 细胞培养物诱导的
HUVEC中 Flt-1的表达，这种作用究竟是促进还是抑
制 HUVEC的血管生成潜能，尚待进一步研究。
总之，该研究结果显示，5F 能抑制 MDA-MB-
231 细胞培养物诱导的 HUVEC 体外增殖、穿膜、趋
化性运动能力和黏附基质能力，其作用机制可能与
5F下调 HUVEC KDＲ mＲNA和蛋白表达水平有关。
结合课题组先前的研究［9，15］，提示 5F具有开发为肿
瘤血管生成抑制剂的潜能。
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(2013-02-18 收稿 责任编辑徐春燕)
·827· 郑州大学学报(医学版) 2013 年 11 月 第 48 卷 第 6 期