全 文 ： 2010, Vol. 31, No. 24 食品科学 ※分析检测264
应用AFLP技术鉴别不同地区的普洱茶晒青毛茶
季鹏章 1 ,2，吕才有 3，梁名志 1，张 俊 1，黄兴奇 2
(1.云南省农业科学院茶叶研究所，云南 昆明 650203；2.云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，
云南 昆明 650203；3.云南农业大学普洱茶学院，云南 昆明 650201)
摘 要：为鉴别不同地区的普洱茶晒青毛茶，对 31个来自不同地区的普洱茶晒青毛茶进行AFLP-毛细管电泳技术
分析，一共得到 426个可重复的位点，多态位点百分率为 94.6%，聚类分析主要分为台地茶类、老树茶类等两大
类。结果表明，采用以下方法可鉴别不同来源的普洱茶晒青毛茶：从典型的主要特征峰和染色信号的最高值和次
高值来区别；从峰形图的整个形状来区分；与对照的峰形图比较来区分。表明AFLP-毛细管电泳技术是一种高效
的分子标记技术，能成功应用于不同区域普洱茶晒青毛茶的鉴别。
关键词：普洱茶；晒青毛茶；A F L P
AFLP Fingerprinting for Identifying Geographical Origins of 31 Sun-dried Tea (Maocha) Samples
JI Peng-zhang1,2，LU Cai-you3，LIANG Ming-zhi1，ZHANG Jun1，HUANG Xing-qi2
(1. Institute of Tea Research, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650203, China；
2. Institute of Biotechnology and Genetic Germplasm, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650203, China；
3. College of Pu er Tea, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China)
Abstract ：Amplified fragment length polymorphisms (AFLPs) markers were employed to identify the geographical origins
of 31 sundried tea samples, which was a material for Pu erh tea processing. A total of 420 polymorphic bands out of 426
reproducible products were amplified. Percentage of polymorphic loci (P) was 94.6%. Dendrogram generated after UPGMA
clustering by NTSYS software indicated that 31 samples could be divided into conventional and ancient tea type. There were
three methods to identify ancient tea and conventional tea, and to discriminate ancient tea from other geographical origins using
AFLP marker: (1) based on the main peak value and the highest and second highest value of dye signal of tea samples. (2) based
on the whole AFLP diagram of different samples. (3) cmpare target tea AFLP diagram with control tea group AFLP diagram. The
result showed that AFLP marker was an effective tool and a robust method in discrimination of sun-dried tea (Maocha).
Key words：Pu erh tea；sun-dried tea；amplified fragment length polymorphism (AFLP)
中图分类号：TS272.5 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)24-0264-04
收稿日期：2010-08-19
基金项目：“十一五”国家科技支撑计划项目(2007BAD58B06)；云南省应用基础研究计划重点项目(2006C0012Z)
作者简介：季鹏章(1975—)，男，副研究员，博士，研究方向为茶树种质资源与遗传改良。E-mail：pengzhji@126.com
普洱茶是以云南大叶种茶树的鲜叶经杀青、揉捻、
日晒等工序制成的晒青毛茶为原料，再经发酵、蒸揉、
成型制成各种形状的成品普洱茶[1]。晒青毛茶是普洱茶
特异品质的物质基础。普洱茶有“青饼”和“熟普”
之分，以晒青毛茶为原料，压制成“青饼”，目前
市场流通中交易常称为“生普”(生茶)，是普洱茶的历
史原形；“熟普”(熟茶 )是“生普”在后期经渥堆后
发酵所形成的品质独特的一类茶叶[2]。普洱茶因其独特
品质和保健功效，产业发展十分迅速。用著名古茶园
所产鲜叶制作的老树茶晒青，品质优于用台地茶园所产
鲜叶制作的台地茶晒青，价格居高不下；但古茶园晒青
产量有限，导致了假冒著名老树茶的大量出现。与此
同时，市场上出现了部分用中小叶种、大理茶等非云
南大叶种鲜叶制作的假冒“普洱茶”晒青，严重影响
了普洱茶的声誉。老树茶是指由百年以上的古茶园所产
鲜叶加工而成的普洱茶，云南省现有古茶园 4万 hm 2；
台地茶是指采制于新中国成立后发展建立的密植条栽茶
园，云南省现有该类茶园近 20 万 hm 2。
晒青毛茶的鉴定目前主要依据感官审评、内含化学
成分分析等方法，然而，上述方法存在分析费用高、
,
..
,
,
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标准不一致等问题。多种分子标记技术已成功应用于茶
叶、茶树的鉴别，如RAPD[3-4]、RFLP[5]、5S rRNA[6]、
AFLP[7]。本实验在收集云南不同区域的 31份普洱茶晒青
毛茶的基础上，采用AFLP 毛细管电泳技术对其进行分
析，旨在区分不同区域的老树茶、区分老树茶与台地
茶，为普洱茶原产地保护提供参考，促进普洱茶的持
续健康发展。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
材料：共收集晒青毛茶样本 3 1 个，包括普洱
茶的主要原产地——云南省西双版纳州、普洱市、临
沧市等地的晒青毛茶。临沧二嘎子茶经鉴定为大理茶
种(C am el l ia t a l i e ns is 大理茶)、佛香茶为中小叶种
(C. sinensis var. sinensis茶)，其余样本都是云南大叶
种(C. sinensis var. assamica阿萨姆茶)所制晒青毛茶(表 1)。
代号 样品 来源 类型 代号 样品 来源 类型
M1 1号样 勐海 未知 M17 老班章 勐海 老树
M2 2号样 勐海 未知 M18 巴达 勐海 老树
M3 3号样 勐海 未知 M19 勐混 勐海 老树
M4 4号样 勐海 未知 P1 孟连 普洱孟连 台地
M5 5号样 勐海 未知 P2 普洱 1 普洱宁洱 台地
M6 6号样 勐海 未知 P3 普洱 2 普洱宁洱 台地
M7 7号样 勐海 未知 P4 普洱饼茶 普洱宁洱 台地
M8 9号样 勐海 未知 P5 澜沧大山 普洱澜沧 台地
M9 勐宋大安 勐海勐宋 台地 L1 临沧 1 临沧 台地
M10 佛香茶 勐海 台地 L2 临沧 2 临沧 台地
M11 紫娟 勐海 台地 L3 蚂蚁堆 临沧 台地
M12 紫芽茶 勐海 台地 L4 勐库茶 临沧 老树
M13 布朗山 勐海 台地 L5 白莺山 临沧 老树
M14 曼迈 勐海 老树 L6 二嘎子茶 临沧 老树
M15 老茶树 勐海 老树 L7 黑条子茶 临沧 老树
M16 格朗和 勐海 老树
表 1 普洱茶晒青毛茶来源
Table 1 Sun-dried tea samples in this study
Taq酶、MgCl2、10× PCR buffer Fermentas MBI
公司；EcoR I酶、MseI酶、T4连接酶试剂盒 日本
Toyobo公司；琼脂糖 西班牙 Pharmacia公司。
CEQ8000遗传分析系统 美国贝克曼库尔特公司；
5415R离心机 德国 Eppendorf 公司；PTC-200型 PCR
仪 美国MJ公司。
1.2 DNA的提取和AFLP-PCR的扩增
采用改进的 CTAB法[8]，用于正式扩增的样品都用
RNA酶A进行纯化。纯化后的DNA用紫外分光光度计
测定 260nm和 280nm波长处的光密度值。用于 PCR反应
的总DNA浓度稀释到 200ng/μL。扩增反应参照文献[9]。
1.3 AFLP-毛细管电泳
整个流程在遗传分析系统上完成，采用荧光标记技
术和毛细管电泳分离技术，扩增产物在高分辨率毛细管
中电泳分离，激光激发荧光采集数据，电泳结果通过
软件自动统计分析并转化为“0、1”矩阵备用，同时
导出电泳分离图谱。
1.4 数据处理和分析
输入得到的0、1矩阵，用NTSYSpc 2.0[10]对除M1～
M8之外的M9～M19、P1～P5、L1～L7 等 23 个样本
进行 U PG MA 聚类分析。同时分析 31 个样本的电泳
分离图谱。
2 结果与分析
2.1 AFLP引物组合的扩增结果
两对选中的 AFLP引物共扩增出可重复的 426条
带，检测出 403个多态性(P=94.6%)，平均每对引物扩
增的总带数为 213条，多态性条带 201.5。引物 E-AAC/
M-CTG的P=94.62%，引物E-AAC/M-CTA的P=94.58%
(表 2 )。
引物组合 引物系列 扩增位点 多态性位点 多态性比率/%
E-AAC/M-CTG
5＇-GACTGCGTACCAATTCAAC-3＇
5＇-GATGAGTCCTGAGTAACTG-3＇
223 219 94.62
E-ACC/M-CTA
5＇-GACTGCGTACCAATTCAAC-3＇
5＇-GATGAGTCCTGAGTAACTA-3＇
203 201 94.58
总计 426 403 94.6
平均 213 201.5
表 2 所用引物组合及其检测效率
Table 2 Primers used in AFLP and their screening efficiency
2.2 聚类分析
根据 Jaccard相似性系数[11]，对M9～M19、P1～
P5、L1～L7等 23个样品进行 UPGAM 聚类(图 1)，相
似性系数在 0.33左右时，可分为 2个大的类群，5个小
类群。第一个大类群由勐宋大安(M9)、紫芽(M12)、布
图 1 23个晒青毛茶的 UPGMA 聚类图
Fig.1 UPGMA dendrogram based on Jaccard similarities of 23 tea
samples
P4
系数
0.20 0.31 0.42 0.53 0.65
M9
M13
L1
L3
P3
M17
M18
M19
M14
P2
L7
M16
L2
M15
L4
M11
L5
L6
P5
M10
M12
P1
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代号 茶样 主要峰值(碱基对)/bp
M1 1号样 102 124 145 153 171* 228 334# 361 415
M2 2号样 96 127 145* 171# 228 259 306 360
M3 3号样 93 124 145* 153# 171 228 334 362 415
M4 4号样 99 124 145* 153 171# 229 340 415
M5 5号样 127 145# 153 171* 334 415
M6 6号样 96# 124 145* 153 171 360 415
M7 7号样 96 127 145* 153 171# 229 259 306 383
M8 9号样 96 145# 171* 228 259 333 362
M9 勐宋大安 143* 153 171# 129
M10 佛香茶 153# 234*
M11 紫娟 83# 96 127 145 171* 228 243 321 362 415
M12 紫芽茶 99* 145* 229 207 363
M13 布朗山 145* 151 171 228# 259 361 440
M14 曼迈 61 96 102 124 145# 153 171* 263 334 362
M15 老茶树 96 145# 153 171* 228 263 333 415
M16 格朗和 96 127 145* 171# 228 260 362 415 472
M17 老班章 96 127 145* 171 228# 259 306 360
M18 巴达 93 127 145# 153* 171 228 333 415
M19 勐混 126 145* 153# 171 209 228 259 305 360 415
P1 孟连 96 124 145# 171* 228 234 260 361
P2 普洱 1 102 124 145* 153 171* 229 259 362
P3 普洱 2 96 145* 153 171# 228 264 305 362
P4 普洱饼茶 61* 100 153# 333 415 522
P5 澜沧大山 210*
L1 临沧 1 83 127 145* 171# 228 252 259# 305 361 415
L2 临沧 2 127 145# 154* 172 264 334 416
L3 蚂蚁堆 94 145 153* 171# 333 415
L4 勐库茶 114* 154# 172 334
L5 白莺山 107 124 153 172* 213# 246 272 321 333 429
L6 二嘎子 96* 173
L7 黑条子茶 113* 124 145 171# 228 260 331 360 415
表 3 31个晒青毛茶引物 E-AAC/M-CTG的毛细管电泳图谱主要峰值
Table 3 Main peak values of 31 tea samples in AFLP fingerprint
patterns using primer combination E-AAC/M-CTG
注：* .染色信号最高值；# .染色信号次高值。下同。
朗山(M13)、孟连(P1)、临沧 1(L1)、蚂蚁堆(L3)等 6个
样品构成；第二个大类群由紫娟(M11)、曼迈(M14)、
老茶树(M 15 )、格朗和(M 16 )、老班章(M 17 )、巴达
(M18)、勐混(M19)、普洱 1(P2)、普洱 2(P3)、临沧 2
(L2)、勐库(L4)、黑条子茶(L7)等 12个样品构成；5个
小类群分别是佛香(M10)、普洱饼(P4)、澜沧大山(P5)、
白莺山(L5)和二嘎子茶(L6)。
2.3 AFLP-毛细管电泳图谱分析
25000
20000
15000
10000
5000
0
染
色
信
号
强
度
片段长度 /nt
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
114.13
154.01
172.03
334.57
A.勐库茶
25000
20000
15000
10000
5000
0
染
色
信
号
强
度
片段长度 /nt
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550
360.81
B.老班章茶
96.34
127.08
145.56
171.57 228.81
259.78
306.24
代号 茶样 主要峰值(碱基对)/bp
M1 1号样 84 112 132 164 177 277 283 333# 338* 443 512
M2 2号样 124 132 176# 207 220 247 282 323 337* 414 442
M3 3号样 163 177# 283 324 338*
M4 4号样 84 124 132# 176# 282 337* 414
M5 5号样 96 132# 164 177 221 248 283 338* 443
M6 6号样 97 132# 163 207 282 337* 442
M7 7号样 84 132 164 177 197 248 333#338* 415 443
M8 9号样 124 132* 176# 247 282 332 337 353 414 443 476
M9 勐宋大安 97 132# 164 177 221 248 283 338* 415 443 510
M10 佛香茶 132 169 247 282 332# 337*
M11 紫娟 98 132 160# 164* 207 276 282 301 337 428 442
M12 紫芽茶 84 132# 169 283 332 456
M13 布朗山 132 176# 221 248 283 324 338* 413 443
M14 曼迈 84 132# 176* 282# 323 353 414 443
M15 老茶树 84 132# 169# 247 282 323 337* 414 443 476
M16 格朗和 132 169 176# 282 323 337* 443
M17 老班章 102 124 132# 169 282 337* 442 523
M18 巴达 84 132 169# 282 337* 443
M19 勐混 84 102 124 132* 169# 247 282 337* 442
P1 孟连 97 125 132* 164 248 283 324 333 338# 444 463
P2 普洱 1 96 132# 176* 282 337 353 414 443 510
P3 普洱 2 117 124 132# 160* 169 207 247 282 332 414 443
P4 普洱饼茶 176# 282 337*
P5 澜沧大山 337*
L1 临沧 1 84 124 132 169# 207 248 324 337* 443 476
L2 临沧 2 132# 160 176 282 337*
L3 蚂蚁堆 169 176# 338*
L4 勐库茶 132# 169 207 247 282 332 337* 442
L5 白莺山 332*
L6 二嘎子 84 112 176 215 282# 332* 456
L7 黑条子茶 84 132 163 176# 282 323 337* 442
表 4 31个晒青毛茶引物 E-ACC/M-CTA的毛细管电泳图谱主要峰值
Table 4 Main peak values of 31 tea samples in AFLP fingerprint
patterns using primer combination E-ACC/M-CTA
图 2 引物 E-AAC/M-CTG对不同茶样的 AFLP选择性扩增电泳图谱
Fig.2 AFLP fingerprint patterns of tea samples using primer
combination of E-AAC/M-CTG
4500
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
染
色
信
号
强
度
片段长度 /nt
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
C.紫娟茶
96.18
83.72 145.48
171.46
228.79
243.34
321.61
362.08
415.51
126.67
267※分析检测 食品科学 2010, Vol. 31, No. 24
两对 31个AFLP-毛细管电泳图谱都有一定的差异，
见图 2和表 3、4。引物 E-AAC/M-CTG 则有明显的差
异，如二嘎子茶 96、215特征峰，佛香茶的 234特征
峰，紫娟的 83、198、200特征峰，勐库茶的 199、511
特征峰，澜沧大山的 210特征峰；引物 E-AAC/M-CTA
的如白莺山 332特征峰等。此外，对于图形比较类似的
样品，可以依据染色信号的最高值和次高值来进行比
较，如勐海格朗和、老班章、巴达，引物 E-AA C/M-
CTA 最高值都是 337，但次高值分别为 176、132、169。
因而可成功地将三者区分出来。
3 讨 论
3.1 23个晒青毛茶的聚类分析
从聚类图可以看出第一个大类群由勐宋、布朗山等
6个样品构成，6个样品都为台地茶，分析第一大类群
由台地茶构成。第二个大类群由老班章、勐混、巴达、
曼迈、格朗和等 12个样品构成。这 12个样品中老班章、
勐混、巴达、曼迈、格朗和、老茶树、勐库和黑条
子茶等多数样本为老树茶，分析第二大类群主要由老树
茶构成。此外，5个小类群中，佛香茶(C. sinensis var.
sinensis)、临沧二嘎子茶(C. taliensis)与云南大叶种亲缘
关系较远。而临沧白莺山则推测白莺山是茶树种质资源
库，生长有大理茶等其他茶组植物，白莺山茶可能混
杂有其他茶组植物的基因[12-13]，因而与大叶种亲缘关系
较远。
3.2 晒青毛茶AFLP-毛细管电泳鉴别技术分析
陈亮等[3]应用RAPD标记对原产于云南等地的 24份
野生茶树资源进行分子鉴定研究。结果表明，RAPD标
记在鉴定茶树种质资源方面非常有效。有 3种独立的方
法可以用于茶树种质资源的分子鉴定：特殊的标记；特
异的谱带类型；不同引物提供谱带类型的组合。16 个
特异标记的存在和 3个特异标记的缺失可以鉴定 14份资
源；Singh等[4]用从市场上购来的 10个不同品牌的红茶、
绿茶，提取 D N A，用 R A P D 鉴别，并认为该方法用
来证明某著名品牌的茶叶的来源，有极大的应用性。
Matsumoto等[5]用RFLP技术，以 PAL基因为探针鉴别
日本绿茶的遗传差异，集合 2种限制性内切酶，2.3kb
的探针能从阿萨姆种茶中鉴别出日本绿茶。Dhiman等[6]
报道从 5S rRNA基因片段设计了种间的特异 PCR探针，
并成功地检测到在茶叶样品中掺杂的腰果壳。从上述报
道可看出，分子标记在茶树种质和产品鉴别是可行的。
本研究所用的AFLP-毛细管电泳技术，一对引物可
扩增出 200多个位点，位点差异在 1bp都能检测到，更
容易检测出材料的细微差异，同时采用高效自动化技
术，降低了人为操作带来的误差，易于对扩增样本进
行标准化分析，提高了数据的可靠性。通过对 31个晒
青毛茶的AFLP分析，31个晒青毛茶的AFLP毛细管电
泳图谱都有差异，可以通过以下方法来区分不同地区的
晒青毛茶、区分老树茶与台地茶：①从典型的主要特征
峰和染色信号的最高值和次高值来区别，如勐库茶的
199、511特征峰和澜沧大山的 210特征峰；②从峰形图
的整个形状来区分；③与对照的峰形图比较来区分。此
外，该技术还可以用于鉴别非云南大叶种加工的晒青毛
茶，如本实验中的佛香茶、二嘎子茶，二者与云南大
叶种晒青的AFLP图谱有明显的区别。说明AFLP-毛细
管电泳技术可用于普洱茶的真伪鉴别。
不同区域晒青毛茶的鉴别技术是非常复杂的，梁名
志等[14]以云南省的古茶园和台地茶园的蒸青茶、晒青茶
为样品，从感官审评、内含品质化学成分和矿物质元
素检测分析得出：老树茶与台地茶确有差异，但很难用
感官审评、内含品质化学成分和矿物质元素检测等方法
来区分。云南普洱茶产地广泛，本次研究用 AFLP-毛
细管电泳虽取得一定进展，但并没有覆盖所有普洱茶典
型产地。今后要对普洱茶典型产地继续开展AFLP-毛细
管电泳分析，通过数据、图谱的积累，形成一整套完
整的不同古茶山的 AFLP-毛细管电泳数据库，应用于
不同产地普洱茶晒青毛茶的鉴别。将更能发挥出
AFLP-毛细管电泳技术的优势，为云南普洱茶产业的
健康发展服务。
参 考 文 献 ：
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