全 文 ：第 6卷第 2期
2007年 3 月
杭州师范学院学报(自然科学版)
Journal of Hangzhou Teachers College(Natural Science Edit ion) Vol.6 No.2M ar.2007
收稿日期:2007-03-01
基金项目:浙江省自然科学基金项目(Y506225).
作者简介:付再萍(1981—),女 ,浙江台州人 ,生态学专业硕士研究生 ,主要从事植物生态学研究.
文章编号:1008-9403(2007)02-0129-04
狗脊蕨(Woodwardia japonica(L.f.)Sm)基因组
DNA提取与随机扩增多态性 DNA(RAPD)的优化
付再萍
(杭州师范大学生命与环境科学学院 ,浙江杭州 310036)
摘　要:以狗脊蕨新鲜叶片为材料 , 使用改良的 CTAB 法提取其基因组 DNA ,通过单因子实验优化了各反应
物的浓度 ,即在 25 μL 总反应体系 ,Mg2+(2.5 mmol/ L), dNTPs(200 mmol/ L), DNA(15 ng), Taq 酶(1.5 U),引物
(0.15 μmmol/ L), 扩增程序为:94℃预变性 1 min , 然后 94℃变性 1 min , 39℃退火 1min , 72℃延伸 2 min , 40 个
循环 ,最后 72℃延伸 10 min , 4℃保存.狗脊 RAPD条件优化为分析狗脊蕨的遗传多样性打下稳定的基础.
关键词:狗脊蕨;RAPD;条件优化
中图分类号:Q943　　　　　文献标志码:A
随机扩增多态性 DNA(random amplif ied polymorphisimic DNA , RAPD)是 1990年由美国科学家
Williams和Welsh采用 PCR技术发展起来的一种 DNA分子标记技术 ,具有操作简单快捷 、成本低 、通用
性好 、灵敏度高且不需预先了解基因组的相关分子生物学信息等优点而广泛应用于种质资源分析 、生物种
群划分 、遗传相关分析 、遗传图谱构建 、基因定位[ 1-4] 等方面.在此采用 RAPD分子标记对广布于浙江森林
草本层中的狗脊遗传多样性进行研究 ,由于 RA PD本身具有稳定性和重复性差的缺点[ 5-8] ,为此优化了狗
脊的基因组 DNA 提取方法和 RAPD反应体系 ,以期建立一个稳定的反应体系克服这一缺点 ,也为今后狗
脊蕨在各个演替阶段的遗传多样性分析提供最基本的保障.
1　材料和方法
1.1　植物材料
狗脊嫩叶采自于浙江宁波天童国家森林公园 ,放入封口袋中 ,冰壶保存 ,硅胶快速干燥后带回实验室
内 ,贮存于-70℃的超低温冰箱中.
1.2　狗脊基因组 DNA提取及检测
1.2.1　狗脊基因组 DNA提取(改良的 CTAB法)
取新鲜叶子1 g 左右 ,加入适量液氮研磨 ,转移至 65℃预热的 650 μl2%CTAB提取液中(2%CTAB;
1.4 mo l/LNaCl;20 mmo l/L EDTA (pH 8.0);100 mmol/L Tris-HC l(pH 8.0);2%(V/V)的 β-巯基乙
醇), 65℃水浴 1 h ,期间每隔几分钟摇动一次;1 h后 ,加入 650 μl氯仿和异戊醇混合液(体积比 24:1),振
荡摇匀 ,4℃10 000×g 离心 10 min;取上清液 400μl转至另一干净 eppendo rf管中 ,再加入 400μl的氯仿
和异戊醇的混合液(体积比 24:1),振荡摇匀 ,4℃10 000×g 离心 10 min;取上清液 350 μl至另一 1.5 ml
管中 ,加 2倍体积的无水乙醇 ,上下轻轻颠倒混匀 ,发现有白色絮状沉淀出现 ,冰浴 20 min;4℃8 000×g
离心 5 min ,弃上清 ,用 70%酒精清洗 1 次;200 μlT E溶解 ,加同体积的氯仿和异戊醇的混合液(体积比
24:1),重复一次.最后用 200μlTE 溶解 ,放在-20℃保存备用.
1.2.2　狗脊基因组 DNA的检测
利用 UV-2401PC(日本岛津)紫外分析检测仪检测在 260 nm 、280 nm 的 OD值 , DNA 样品的浓度=
OD 260 ×N(样品稀释倍数)×50/1 000;再以 1.2%(w/v)琼脂糖凝胶电泳的方法检测 DNA 的完整性.
1.3　引物序列(由上海生工生物工程技术服务有限公司提供)
表 1　引物序列
编号 序列 编号 序列
S8 GTCCACACGG S11 GTAGACCCGT
2　结　果
图 1　6 个样地狗脊基因组 DNA 电泳结果
2.1　狗脊基因组 DNA的完整性和纯度
使用改良的 CTAB 法对狗脊叶子进行 DNA 提取时 ,
DNA 样品的色泽为白色.取 15 μLDNA 样品溶于435 μL双
蒸水中 ,混匀 ,测得 DNA 浓度为 55.35 ng/μL , OD260/OD280
=1.827.说明所获得的 DNA 纯度较高.对 10 μLDNA 进行
琼脂糖凝胶电泳分析显示(图 1),狗脊基因组 DNA 电泳得
到的条带比较整齐 、清晰 ,基本无降解 ,完整性较好.由此可
以说明 ,所提取的 DNA 的质量和产量都较高.
2.2　PCR-RAPD反应体系的优化
对于要求检测大量样本的遗传多样性和居群遗传结构研究来说 ,检测手段的实验稳定性至关重要[ 9] .
很多研究证明 RA PD对 PCR反应的条件比较敏感[ 5-8] .容易造成两种极端现象 ,一种是非特异性扩增严
重 ,即产生很多条不确定的产物甚至是无目的产物 ,另一种可能没有扩增条带.所以 ,有必要针对不同的实
验材料进行 RAPD反应体系的优化.
M:marker　1～ 8 分别是Mg2+浓度:0.5 、1 、1.
5、2、2.5、3、3.5 、4 mmol/ L
图 2　Mg2+浓度对扩增带型的影响(S8)
2.2.1　Mg2+浓度的优化
Mg2 +浓度可能影响到引物退火温度 、模板与扩增产物特异
性的强弱 、引物二聚体的形成以及 DNA聚合酶活性和精确度等
诸多方面[ 10] .Mg2+浓度过低 , Taq酶有所失活 ,过高则会使引物
的错配频率增加[ 11] .该实验设置 8个浓度梯度(0.5 ,1 ,1.5 , 2 ,2.
5 ,3 , 3.5 , 4 mmol/L),电泳结果如图 2显示 ,在 Mg2+浓度为 2.5
mM ,扩增条带多且清晰.
2.2.2　模板 DNA 浓度对体系的影响
RAPD 分析时不同植物使用的模板 DNA 浓度各不相
同[ 12] .浓度过低 ,分子碰撞几率降低 , 引起扩增条带少且不稳
定;模板含量过高 ,又会相应增加非特异产物的扩增 ,造成弥散
型电泳结果.在该实验中 ,当模板 DNA 为 15 ng 时 ,扩增出的条带丰富且清晰(见图 3).
2.2.3　Taq酶用量对反应体系的影响
图 4表示不同 Tag 酶用量对扩增带型的影响.当 Taq酶为0.5 U时 ,扩增条带少(1泳道);当为1.5U
时 ,扩增条带多且清晰(3泳道).当为更高的浓度下 ,非特异性扩增增强 、背景亮 、弥散现象严重.因此 , Taq
酶应选用 1.5 U.
130 杭州师范学院学报(自然科学版) 2007年　
2.2.4　引物浓度对反应体系的影响
由图 5所示:当引物浓度水平小于0.05μmo l/L(1泳道)时 ,扩增带少 、亮度弱 ,扩增效果不理想;当引
物浓度为 0.15 μmol/L(3泳道)时 ,扩增条带的数量多且清晰;而引物浓度为 0.2 ～ 0.3 μmol/ L 时 ,背景
很亮 ,出现弥散现象.引物浓度应采用 0.15μmol/ L.
2.2.5　dNTP 浓度对反应体系的影响
dN TP 是 PCR反应的基本单位 ,其浓度大小直接影响产物的质量 、特异性及合成的可靠性.过高会导
致聚合酶错误的渗入 ,过低又会影响合成效率 ,而影响扩增效果[ 13] .此实验在 50 ～ 300μM 之间 ,设置了不
同的 dNTP 浓度梯度.结果发现 , dN TP 浓度为 50 ,100 μmmol/L 时扩增条带少而且不清晰 ,浓度为 150
和200μmmol/L时扩增条带多而清晰 ,浓度为 250和 300 μmmol/ L 时非特异性扩增较多(见图 6).因此 ,
dN TP 浓度选在 200μmmol/L 较合适.
M:marker;1 ～ 8:35、36 、37、38 、39 、40、41 、42℃
图 7　退火温度对扩增带型的影响(S8)
2.2.6　退火温度对反应体系的影响
退火温度是影响 RAPD 反应最重要的条件之一 ,
它具有相对的灵活性 ,是优化 RAPD 反应的重要控制
措施[ 14] .在整个反应体系组成确定时 ,对于热循环中的
退火温度设置了 8个梯度 ,看其对扩增结果的影响.由
图 7可见 ,温度在 39℃扩增条带清晰.温度低于 37℃
或高于 41℃,不能得到满意的结果.温度只要在许可范
围内就可得到扩增产物 ,只是温度太低会出现非特异
性片段.因此采用 39℃的退火温度.
3　讨　论
该试验通过对狗脊不同器官提取的 DNA比较发现 ,幼嫩的狗脊叶片提取的 DNA 质量最佳.老的叶
片革质厚 、富含多酚和多糖 ,提取时 ,往往与 DNA 缠在一起 ,形成粘稠的褐色混合物而难以得到适用于
RAPD的高质量的 DNA ,因此该实验采取去除多糖与多酚的 CTAB 并加以改进 ,提取 DNA 之前 ,在
65℃预热的提取液中加入2%(V/V)的 β-巯基乙醇 ,尽量减少酚被氧化 ,也及时钝化 DNase 酶 ,防止 DNA
131　第 2 期 狗脊蕨(Woodwardia japonica (L.f.)Sm)基因组DNA提取与随机扩增多态性 DNA(RAPD)的优化
被降解.
RAPD-PCR优化中 ,PCR混合物中的 DNA 模板 、引物 dN TP 的磷酸基团均可与 Mg2+结合 ,降低
Mg 2+实际浓度.Taq酶需要的是游离的 Mg 2+.另外 ,引物和模板 DNA 原液中如含 EDTA 等螯合剂也会
影响游离的 Mg 2+浓度.
引物的退火温度决定着 PCR的特异性.所需的温度取决于引物的碱基组成 、长度和浓度 ,合适的退火
温度一般低于引物在 PCR条件下真实 Tm(T m=4(G+C)+2A+T))[ 14]值的 5℃.对于 RAPD通常使用
的 10个碱基的引物 ,退火温度一般低于 40℃,Williams指出 , 0℃以上的退火温度会抑制 RAPD反应.该
实验采用了多种引物进行退火温度的优化 ,发现不同的引物对退火温度的要求也是不一样的.因此 ,建议
不同的引物采用不同的退火温度.
dN TP 是反应中磷酸的主要来源 ,是合成 DNA的原料 ,其浓度略高一些 ,可以保证 PCR扩增反应的
完全 ,因为在浓度低于200μmol/ L时可以看到扩增条带明显减少.但如果 dN TP 浓度过高 ,就会与 Taq酶
竞争 Mg2+ ,使 Taq酶无法正常完全发挥聚合作用.
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Genomic DNA Extraction and Optimization of RAPD Analytic
Conditions ofWoodwardia j aponica(L.f.)Sm
FU Zai-Ping
(College of Life and En vi ronmen t Science , Hangzh ou Normal University , Hangzh ou 310036 , C hina)
Abstract:DNA of Woodward ia ja ponica was extr acted from the f resh leaves using improved CTAB .The optimized re-
action sy stem and progr amme o f RAPD for Woodward ia j aponica are as fo llow s.The reactions w ere perfo rmed in a volume
of 25 μl containing 2.5 mmol/ L M g2+ , 200 μmol/ L dNTPs , 15 ng of DNA , 1.5 U Taq DNA polymera se , 0.15 μmo l/ L
primer(S8).Thermal cycling w as pro g rammed by 1 cycle for 1 min at 94℃, follow ed by 40 cycles fo r 1 min a t 94℃, 1 min
at 39℃, 2 min at 72℃, and finally by 1 cycle for 10 min at 72℃, sto ring a t 4℃.
Key words:Wood wardia japonica ;RAPD;optimization
132 杭州师范学院学报(自然科学版) 2007年