全 文 ：书文章编号:1000-5404(2012)04-0361-03 短篇论著
半边旗有效成分 5F对人小细胞肺癌 NCIH446 细胞毒性、侵袭能力、
运动能力及MMP- 9、uPA表达的影响
陈 杰1，庞江琳2，覃燕梅1，梁念慈1(524023 广东 湛江，广东医学院:生物化学与分子生物学教研室1，附属医院妇产科2)
［摘要］ 目的 探讨半边旗有效成分 5F对人小细胞肺癌 NCIH446 细胞毒性、侵袭能力、运动能力及 MMP-9、uPA表
达的影响。方法 MTT法检测 5F对 NCIH446 细胞的增殖作用;Transwell chamber法检测 5F对 NCIH446 细胞侵袭能力和
趋化性运动能力的影响。Western blot 方法检测 5F 对 NCIH446 细胞侵袭转移相关基因 MMP-9、uPA 表达水平的影响。
结果 5F对 NCIH446 细胞的增殖有显著抑制作用(P ＜ 0． 05)。在无明显细胞毒性情况下，5F能够明显抑制 NCIH446 细
胞的侵袭能力、运动能力(P ＜ 0． 05)。5F作用于 NCIH446 细胞 24 h，能明显下调 MMP-9、uPA蛋白表达。结论 5F能抑
制 NCIH446 细胞的增殖、侵袭、转移能力，下调 MMP-9、uPA表达水平，5F具有潜在抗肺癌转移的作用。
［关键词］ 半边旗;5F;细胞增殖;肿瘤侵润;细胞系，肿瘤;基质金属蛋白酶-9;尿激酶型纤维蛋白酶酶原激活剂
［中图法分类号］ R966;R734． 2;R730． 23 ［文献标志码］ A
［基金项目］ 国家自然科学基金(39870900) ;香港创新科技署合作项目(GHP /
022 /06)
［通信作者］ 陈 杰，E-mail:jackchan818@ 126． com
肺癌的治疗中，抑制肺癌的侵袭和转移是提高患
者生存率的关键。肺癌细胞发生侵袭和转移与其自身
分泌蛋白酶降解细胞外基质(extracellular matrix，
ECM)和基底膜密切相关，而分泌的蛋白酶中，尿激酶
型纤维蛋白酶酶原激活剂(urokinase-typeplasminogen
activator，uPA)和基质金属蛋白酶-9(matrix metallopro-
teinases-9，MMP-9)在侵袭中起到极为重要的作
用［1 － 2］。本实验以天然药物半边旗中有效成分 5F 为
靶点药物，研究其对小细胞肺癌 NCIH446 细胞的生长
增殖、侵袭、转移能力影响。
1 材料与方法
1． 1 细胞及试剂
NCIH446 细胞购自上海细胞所，半边旗有效成分 5F(纯度
为 55%)由广东天然药物研究开发重点实验室提供，胎牛血清
购自杭州四季青公司，RPMI1640 培养基购自 Gibco 公司，Fi-
bronectin购自 Sigma 公司，Matrigel 购自 BD 公司，Transwell 小
室购自 corning公司，MMP-9、uPA抗体购自 Santa Cruz公司。
1． 2 细胞培养
NCIH446 细胞培养于含 10% 胎牛血清，25 mmol /L
HEPES，100 U /ml青霉素和 100 μg /ml 链霉素的 RPMI1640 完
全培养基中，37℃、5% CO2饱和湿度培养箱培养。细胞经过传
代，取对数生长期的细胞进行实验。
1． 3 药物配制
半边旗有效成分 5F使用时用 DMSO配成原液，分装冻存，
临用前用无血清培养基稀释成所需浓度。药物作用于细胞时，
DMSO的终浓度≤0． 1%(体积比) ，实验表明该浓度对细胞生
长无影响。
1． 4 生长增殖实验
采用 MTT法:选取对数期生长的 NCIH446 细胞，经胰酶消
化调整细胞浓度以 5 × 104 /ml，接种于 96 孔培养板内，在 37℃、
5%CO2饱和湿度条件下过夜后，加入等体积不同浓度药物，每
组设 5 个平行孔，并设 RPMI1640 完全培养基调零孔，置培养板
于孵箱中 6、24 h后，每孔加入 10 μl MTT (5 mg /ml) ，继续培养
4 h。倾去培养液，每孔加入 150 μl DMSO溶解，用微量振荡器
摇振 15 min，以测定波长为 570 nm，参考波长为 450 nm，测定其
光密度值。实验重复 3 次。
据公式计算抑制率，并绘制浓度-抑制率曲线。细胞生长
增殖抑制率 =(1 －给药组细胞光密度值 /对照组细胞光密度
值)× 100%。
1． 5 重组基底膜侵袭实验
在 Transwell小室膜的外表面涂 Fibronectin 4． 5 μg(10 μl)，置
超净台内风干，膜内表面涂 Matrigel 5 μg(10 μl) ，风干，形成人
工重组基底膜;在 24 孔板内加入 0． 1% BSA-RPMI1640 培养
基，每孔 700 μl，收集细胞，悬浮于 0． 1% BSA-RPMI1640 培养
基中，使终浓度为 1 × 106 /ml;将 Transwell 小室浸于 24 孔板的
条件培养基，将细胞悬液加到 Transwell小室中，每小室 100 μl，
并同时加入各浓度药物 1 μl，对照组加入等量的 PBS。37 ℃、
5%CO2温箱内孵育 6 h。将 Transwell小室取出，滤膜用甲醇固
定 1 min，Hematoxiline染色 3 min，水洗，Eosin染色 10 s，水洗，用
生理盐水浸湿的棉签擦去滤膜内表细胞;用封片胶将滤膜封于
载玻片上，于 400 ×显微镜下计数穿过 PVPF滤膜的细胞数。每
膜计数上下左右中任意 5个不重叠视野，每组平行设 3个滤膜。
抑制率 =(1 －给药组侵袭细胞数 /对照组侵袭细胞数)×
100%。
1． 6 细胞趋化性运动能力的测定
运动实验与侵袭实验相比，PVPF 滤膜上不需铺 Matrigel。
抑制率 =(1 －给药组迁移细胞数 /对照组迁移细胞数)×100%。
1． 7 Western blot检测 5F对 uPA、MMP-9 蛋白表达的
影响
药物作用 NCIH446 细胞 24 h，收集细胞，用裂解液裂解细
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第 34 卷第 4 期
2012 年 2 月 28 日
第 三 军 医 大 学 学 报
J Third Mil Med Univ
Vol． 34，No． 4
Feb． 28 2012
DOI:10.16016/j.1000-5404.2012.04.001
胞，检测蛋白浓度，SDS-PAGE，将蛋白从凝胶上转移到 PVDF
膜上，5%脱脂奶粉封闭，一抗孵育，冲洗，HRP 标记的二抗孵
育，冲洗，最后用 ECL法检测，拍照。图像用 Bandscand 软件进
行光密度分析，以各蛋白与 β-actin 的灰度值之比代表各蛋白
的相对表达量。
1． 8 统计学分析
数据资料以 珋x ± s表示，采用 SPSS 12． 0 统计软件进行单因
素方差分析。
2 结果
2． 1 5F对 NCIH446 细胞生长增殖抑制作用
NCIH446 细胞加入不同浓度的 5F，分别培养 6、24 h，用
MTT 法测定药物对细胞生长的影响。结果可见药物对
NCIH446 细胞增殖具有明显的抑制作用，并且抑制率均随浓度
(剂量)和时间的增加而增加。浓度为 25、50、100 μmol /L的 5F
用药组作用 24 h，对应的抑制率为(14． 31 ± 0． 89)%、(32． 10 ±
0． 35)%、(46． 52 ± 0． 28)%(P ＜ 0． 05) ，表明 5F 能明显抑制
NCIH446 细胞的生长增殖。当作用 6 h，药物对 NCIH446 的抑
制率为(2． 01 ± 0． 67)%、(4． 35 ± 0． 56)%、(9． 16 ± 0． 38)%
(P ＞ 0． 05)。表明药物在 6 h内对细胞无明显的毒性。据此采
用 50、100 μmol /L作为侵袭和趋化运动实验的工作浓度。
2． 2 5F对 NCIH446 细胞侵袭能力的影响
药物作用于 NCIH446 细胞 6 h，50、100 μmol /L实验组对应
的侵袭抑制率为(38． 39 ± 1． 62)%、(54． 65 ± 2． 18)%(P ＜ 0. 05)，
提示 5F能明显降低细胞体外侵袭人工重组基底膜的能力。
2． 3 5F对 NCIH446 细胞趋化运动能力的影响
5F作用 NCIH446 细胞 6 h，5F使细胞体外趋化运动的能力
明显降低，当实验组浓度为 50、100 μmol /L 时，对应的运动能
力抑制率为(36． 13 ± 0． 73)%、(50． 18 ± 1． 53)%(P ＜ 0． 05)。
2． 4 5F对 NCIH446 细胞蛋白表达的影响
结果显示，5F能明显下调 uPA、MMP-9 蛋白在 NCIH446 细
胞中的表达(P ＜ 0． 05)。见图 1。
1 2 3
MMP蛳9（92×103）→
uPA（55×103）→
β蛳actin（43×103）→
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
相
对
表
达
水
平
髿
鬀
MMP蛳9 uPA
对照组 50 μmol/L 5F 100 μmol/L 5F
a
a
a
a
A:Western blot结果 1:对照组;2:50 μmol /L 5F组;3:100 μmol /L
5F组;B:半定量分析结果 a:P ＜ 0． 05，与对照组比较
图 1 5F对 NCIH446 细胞 uPA、MMP-9 蛋白表达的影响
3 讨论
5F是从半边旗提取所得的有效成分，已有的研究
结果表明，它对多种肿瘤具有抑制细胞增殖、诱导细胞
凋和抑制细胞侵袭转移作用［3］。本实验结果表明，药
物为 100 μmol /L 的实验组细胞的生长抑制率可达
46． 52%，表明 5F可以明显抑制小细胞肺癌的细胞增
殖。本实验采用小室实验证实了 5F 能明显抑制
NCIH446 细胞的侵袭转移。为了进一步探讨 5F 对肿
瘤侵袭抑制的机制，本实验研究了与侵袭、转移密切相
关的 2 个基因 MMP-9、uPA的表达。
uPA属于丝氨酸蛋白水解酶类，它以无活性的酶
原存在，在细胞表面与 uPA 受体(uPAR)结合后被纤
溶酶、舒血管素激活［4］后，它从两方面进行细胞外基
质的降解和基底酶的破坏，一方面能直接降解 ECM的
糖蛋白及蛋白多糖的蛋白核心部分。另一方面，它可
以激活 MMPs系统。uPA 在很多肿瘤中均过表达，包
括大肠癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌等［5］。而在
肺癌中，uPA的阳性表达率明显高于正常组织，而且进
展性与临床特征相关，提示 uPA 在肺癌的进展中起到
重要作用。
MMPs是一组锌离子依赖性内肽酶，而 MMP-9 是
其中一个重要成员，相对分子质量为 92 × 103，它以酶
原的形式分泌，被激活后形成Ⅳ型明胶酶，降解、破坏
靠近肿瘤表面的 ECM的 型胶原、层粘连蛋白和明胶，
最终导致肿瘤的侵袭、转移。在肿瘤细胞中，MMP-9
多呈现过表达，提示 MMP-9 与肿瘤的侵袭和转移密切
相关［6］。uPA、MMP-9 二者在肿瘤的侵袭和转移中联
系密切。已有的研究表明，激活 PTEN抑制 PI3K信号
通路，不仅可以明显减少 MMP-9 的表达，同时可使
uPA的分泌受到抑制，从而抑制肿瘤的运动和浸润;
uPA可以激活 MMP-9、MMP-13 等基质金属蛋白酶前
体，活化的 MMPS 可以进一步降解细胞外基质，破坏
基底膜成分，促进肿瘤细胞的侵袭和转移。Xu等［7］发
现 MMP-9 可通过降低蛋白酶连接素 1(NP-1)的表达
从而增加 uPA的活性。
本实验结果表明，5F抑制小细胞肺癌侵袭和转移
效果明显，细胞中 uPA和MMP-9 的表达随药物浓度增
加而下调，表明 5F可能是通过上调 PTEN或者是抑制
FAK的表达，继而抑制 PI3K 途径或其他相关途径，使
uPA和 MMP-9 的分泌减少，从而阻止或抑制肿瘤细胞
侵袭和转移［8］。至于 uPA与MMP-9的下调与 NCIH446
细胞的侵袭转移能力减弱是否存在直接关系，有待进
一步研究。综上所述，5F 作用小细胞肺癌 NCIH446
细胞，可抑制肿瘤的生长增殖，侵袭、转移能力，并下调
uPA和 MMP-9 的表达，提示 5F 具有潜在的治疗肺癌
作用。
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第 三 军 医 大 学 学 报
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Vol． 34，No． 4
Feb． 28 2012
参考文献:
［1］ Yan L，Lin B，Gao L，et al． Lewis (y)Antigen Overexpression Increases
the Expression of MMP-2 and MMP-9 and Invasion of Human Ovarian
Cancer Cells［J］． Int J Mol Sci，2010，11(11):4441 －4452．
［2］ Chen N H，Liu J W，Zhong J J． Ganoderic acid T inhibits tumor inva-
sion in vitro and in vivo through inhibition of MMP expression［J］．
Pharmacol Rep，2010，62(1) :150 － 163．
［3］ Li M Y，Leung J，Kong A W，et al． Anticancer efficacy of 5F in NNK-
induced lung cancer development of A /J mice and human lung cancer
cells［J］． J Mol Med，2010，88(12) :1265 － 1276．
［4］ Dass K，Ahmad A，Azmi A S，et al． Evolving role of uPA/uPAR system
in human cancers［J］． Cancer Treat Rev，2008，34(2):122 －136．
［5］ Ulisse S，Baldini E，Sorrenti S，et al． The urokinase plasminogen acti-
vator system:a target for anti-cancer therapy［J］． Curr Cancer Drug
Targets，2009，9(1) :32 － 71．
［6］ 潘海邦，王波，杨爱军，等．胃癌组织中 CEACAM6、MMP-9 的表达
及其与临床病理的关系［J］ ．第三军医大学学报，2010，32(24) :
2632 － 2635．
［7］ Xu D，McKee C M，Cao Y，et al． Matrix metalloproteinase-9 regulates
tumor cell invasion through cleavage of protease nexin-1［J］． Cancer
Res，2010，70(17) :6988 － 6998．
［8］ Huang G J，Yang C M，Chang Y S，et al． Hispolon suppresses SK-
Hep1 human hepatoma cell metastasis by inhibiting matrix metallopro-
teinase-2 /9 and urokinase-plasminogen activator through the PI3K /Akt
and ERK signaling pathways［J］． J Agric Food Chem，2010 58(17) :
9468 － 9475．
(收稿:2011-09-14;修回:2011-10-14)
(编辑 张 维)
文章编号:1000-5404(2012)04-0363-04 短篇论著
不同强度经颅直流电刺激对帕金森大鼠旋转行为学的影响
李一言，田学隆，蒋巍巍，钱 龙，俞雪鸿 (400030 重庆，重庆大学生物工程学院生物医学信息检测实验室)
［摘要］ 目的 研究不同强度阳极经颅直流电刺激(transcranial direct current stimulation，tDCS)对帕金森病(Parkin-
son’s disease，PD)大鼠旋转行为学的影响。方法 根据完全随机原则，将成功造模的 32 例 PD 大鼠分成 3 个刺激组和 1
个假刺激组，每组 8 只。给予 3 个刺激组的左侧初级运动皮层(M1)区直流电刺激分别为 20、80、200 μA的阳极刺激，刺
激时间为 30 min;给予假刺激组 30 s的假刺激。tDCS后，对 PD大鼠腹腔注射阿朴吗啡(apomorphine，APO) ，记录 PD大鼠
旋转的潜伏期、持续时间和平均转速(30 min内)。结果 刺激后，80 μA 刺激组、200 μA 刺激组均与假刺激组的平均转
速组间存在显著差异 (P ＜ 0. 05) ;80 μA 刺激组和 200 μA 刺激组的平均转速间差异无显著性(P ＞ 0. 05) ;各组潜伏期和
持续时间组间差异无显著性(P ＞ 0. 05)。结论 适当强度的 tDCS 对 PD 大鼠的旋转运动功能具有显著的改善作用。考
虑到安全性，最佳的刺激强度为 80 μA。
［关键词］ 经颅直流电刺激;帕金森病;旋转行为;大鼠
［中图法分类号］ R-332;R742． 5;R338． 8 ［文献标志码］ A
［基金项目］ 第四届国家大学生创新性实验课题(101061138)
［通信作者］ 田学隆，E-mail:xltian@ cqu． edu． cn
帕金森病是一种常见的神经退行性疾病，主要病
理改变是位于中脑的黑质多巴胺能神经元变性或缺
失，使得合成的多巴胺减少，抑制乙酰胆碱的功能降
低，乙酰胆碱的兴奋作用相对增强。两者失衡的结果
便导致患者出现相应的症状。
经颅直流电刺激(transcranial direct current stimu-
lation，tDCS)作为一种无创、无痛的皮层刺激方式，通
过在左侧初级运动皮层施加一定强度的弱电流，从而
极化局部大脑区域，刺激多巴胺的合成，引起皮层兴奋
性可逆的改变，调节大脑皮层的兴奋性［1］;同时还调
节皮层神经康复活动，缓解视觉病患者的疲劳和不
适［2］;另外还有辅助治疗厌食症的功能［3］。尽管 tDCS
对帕金森病具有改善作用，但目前关于 tDCS对帕金森
病(Parkinson’s disease，PD)大鼠行为学影响的研究甚
少。本实验试图探究不同强度 tDCS 对 PD 大鼠旋转
行为学的影响，以期为临床应用提供实验依据。
1 材料与方法
1． 1 动物及材料
健康雌性 Sprague-Dawley(SD)大鼠，体质量 180 ～ 260 g，鼠
龄为 60 ～ 80 d，第三军医大学实验动物中心提供;6-羟基多巴
胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)购自美国 Sigma 公司;阿朴吗
啡(apomorphine，APO)购自美国 Sigma 公司;大鼠脑立体定位
仪购自成都仪器厂;牙科钻购自南京立德磨具厂;抗坏血酸购
自美国 Sigma公司。
1． 2 方法
实验采用单侧注射 6-OHDA制备 PD大鼠模型。术前给大
鼠注射 APO确认其无旋转行为，腹腔注射 APO 的目的是诱发
PD大鼠的旋转行为。参照大鼠脑立体定向图谱［4］，采用黑质
致密部(SNC)和腹侧被盖区(VTA)两点注射法［5］:对 PD 大鼠
腹腔注射 10%水合氯醛(0． 5 ml /100 g)麻醉。头颅水平位固
定在大鼠脑立体定位仪上，保证前囟和后囟处于同一水平面。
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第 34 卷第 4 期
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第 三 军 医 大 学 学 报
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