全 文 ：【文章编号】1005-4057( 2002) -03-0165-02 基础研究
半边旗抗肿瘤有效成分 6F对 HL-60细胞 c-Myc、
Bcl-2及 PCNA表达的抑制作用
何承伟 1　梁念慈 1　莫丽儿 2　李金华 1　张　晓 1
(广东医学院　 1. 生物化学与分子生物学研究所 ;　 2. 化学教研室 ,广东湛江 524023)
【基金项目】国家自然科学基金项目 ( 39870900) ;广东省科委重点
学科基金 ( 9306) ;广东省科委重大科技攻关项目
( 9622007-002)
【收稿日期】2001-07-21;【修订日期】2001-10-30
【作者简介】何承伟 ,男 , 1972年出生 ,博士 ,讲师
【摘要】目的:研究蕨类植物半边旗提取物 6F对 HL-60细胞内 c-Myc、 Bc1-2及增殖细胞核抗原 ( PCN A)表达的影响 ,探讨其抗肿瘤作
用机制。方法:异硫氰酸荧光素 ( FITC)标记的抗体与细胞反应后在流式细胞仪上检测上述三种蛋白的表达水平。结果: 58～ 231 nmo1 /L 6F
作用 HL-60细 12 h后 , c-M yc、 Bc1-2及 PCN A蛋白表达水平明显下降 ,并呈剂量效应关系。 结论:化合物 6F可下调 HL-60细胞 c-M yc、
Bc1-2及 PCN A的表达水平 ,推测这是 6F对 HL-60细胞具有强烈细胞毒作用并诱导其细胞凋亡的机制之一。
【关键词】半边旗 ; HL-60细胞 ;基因表达 ;肿瘤 /药物治疗
【中图分类号】R 965　【文献标识码】A
Inhibitory effect of compound 6F isolated from Pteris semipinnata L .
on the expression of c-Myc, Bc1-2 and PCNA in HL-60 cells
HE Cheng -wei
1
, LIANG Nian-ci
1
,MO Li-er
2
,et al
( 1. Institute o f Biochemist ry and M olecular Biolog ry; 2. Depa rtment o f Chemistry , Guangdong
Medical Colleg e, Zhangjiang 524023)
【Abstract】Objective: To s tudy the ef fects of Compound 6F is olated f rom Pteris Semip innata L . ( PSL) on th e exp ression of c-Myc, Bc1-2 and
PCNA in HL-60 cel ls , and to dis cus s th e anti tumor mechanisms of 6F. Methods: The ex pres sion level s of c-M yc, Bc1-2 and PCN A were mea-
sured by f low cytom et ry ( FCM )af ter th e HL-60 cel ls w ere incubated wi th antibody labelled w ith f luorescein i sothiocyanate( FI TC) . Results:
Th e ex pres sion levels of c-M yc, Bc1-2 and PCN A decreased obviously in HL-60 cell s t reated w i th 58～ 231nmo1 /L 6F fo r 12 hou rs, and the
ef fects appeared in a dos e-dependence. Conclusion: Compound 6F could inhibi t th e exp ression of c-Myc, Bc1-2 and PCN A in HL-60 cells. It is
speculated that the cytotoxici ty and apop totic induction of 6F on HL-60 cel ls related to th es e ef fects.
【Key words】P teri s Semip innata L . , HL-60 cel ls , gene ex pres sion, tumor /pharmacotherap y
　　在研究半边旗 (Pteris Semipinnata L . PSL)抗肿瘤有效成
分中发现 ,化合物 6F的活性最高 [1] ,这是因为 6F结构中的 7β
位及 9位羟基 , 15位羰基三者之间可形成稳定的羟基 ,使 17位
亚甲基的亲电性大大增强 ,从而表现出很高的生物活性。 研究
表明 , 6F可增强多种常用抗肿瘤药物的活性 [2] ,抑制 DN A拓
扑异构酶及酪氨酸蛋白激酶的活性 [3] ,诱导 HL-60细胞凋亡
(另文待发表 )。许多抗肿瘤药能直接或间接下调多种基因的表
达水平。癌基因 c-Myc及 bc1-2在细胞凋亡过程中起重要作用 ,
增殖细胞核抗原 ( pro liferation cell nuclear antig en, PCN A)在细
胞增殖过程中起重要作用。本文探讨具有潜在应用前景的抗肿
瘤有效化合物 6F对这几种基因表达水平的影响 ,从分子水平
研究其抗肿瘤作用机制。
1　材料与方法
1. 1　受试药物
化合物 6F(化学命名是: 对映 -7α, 9-二羟基-15羰基 -16-烯 -
贝壳杉烷 -19, 6β -内脂 )由我所植化室分离提取并鉴定结构。
1. 2　主要化学试剂
RPM I-1640培养基购自 Gibco公司 ,小牛血清购自杭州四
季青生物材料公司 ,鼠抗人 c-Myc, Bc1-2及 PCNA单克隆抗
体 , FITC标记的羊抗鼠二抗购自北京中山生物技术有限公司。
1. 3　细胞株
人早幼粒白血病细胞株 ( HL-60)由我所细胞培养室保存。
1. 4　细胞培养
HL-60细胞在含 10%灭活小牛血清、 100单位 /m L青霉素
和 100 mg /L链霉素的 RPMI-1640完全培养基中 ,于 37℃ , 5%
(体积分数 ) CO2 ,饱和湿度孵箱内培养。
1. 5　 c-Myc, Bc1-2, PCN A蛋白表达量的测定
取 1. 5× 106细胞 ,固定于 1 mL 100%冷甲醇中 ,充分振摇
后置于 - 20℃至少 10 min。离心沉淀 ,弃上清液。用不含钙、镁
的 PBS洗细胞一次 ,留 50μL,再加含 1%牛血清白蛋白及 1%
牛血清的 PBS 50μL,混匀后置室温中 30 min。分别加入 50μL
1∶ 100稀释的抗 c-Myc ,抗 Bc1-2,抗 PCNA鼠抗人单克隆抗
体 ,置冰上 30 min,用 PBS洗两次 ,留约 50μL上清液 ,加 50μL
1∶ 100稀释的 FITC标记的羊抗鼠二抗 ,冰上避光孵育 30
min, PBS洗 2次后 ,以 488 nm激发光波长 ,以阴性对照 (用
PBS代替单克隆抗体 ,其余步骤同上 )调零 ,在流式细胞仪上分
析 FITC(对数值 )对细胞数的直方图 ,并得出阳性表达率。
2　结果
如图 1和表 1所示 ,与未用药组相比 ,经不同浓度的化合物
6F作用 12 h后 , HL-60细胞 C-Myc, Bc1-2, PCNA蛋白表达水
平明显下隆 ,并呈明显的剂量效应关系。
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　第 20卷第 3期
2002年 6月 　　　　　
广　东　医　学　院　学　报
JO URNAL OF GU ANGDONG M EDICAL COLLEGE
　　　　 Vo l. 20 No. 3　
Jun. 2002　
FITC( Log)
图 1　流式细胞仪检测化合物 6F对 HL-60细胞 c-Myc、 Bc1-2及 PCN A
　蛋白表达水平的影响。
A、 B、 C、 D: c-Myc; E、 F、 G、 H: Bc1-2; I、 J、 K、 L: PCN A
A、 E、 I: unt reated; B、 F、 J: 58nm o1 /L 6F; C、 G、 K: 116nmo1 /L 6F;
D、 H、 L: 231nm o1 /L 6F
表 1　 6F作用后 HL-60细胞 c-Myc、 Bc1-2及 PCNA表达水平*
组别 ( nmo1 /L) c-M yc Bc1-2 PCNA
　　　　 0 　　　 31. 5 　　　 28. 7 　　　 70. 1
58 23. 7 16. 9 61. 2
116 12. 9 13. 8 52. 7
231 2. 9 6. 4 18. 2
　　* 表中数值为阳性细胞百分率 (% )
3　讨论
癌基因 c-Myc的异常表达促进细胞的增殖和恶性转化 ,抑
制细胞分化 ,与多种肿瘤的发生有密切关系 ,但它同时又具有
促进细胞凋亡的作用 [5] ,这是由于 c-Myc仅为初始信号 ,细胞
的命运取决于所处的环境 ,如存在诱导细胞凋亡的环境 , c-Myc
则诱导细胞凋亡 ,反之则促进细胞增殖。 c-Myc与 DN A某些序
列特异结合 ,并与其他转录因子相互作用 ,调节基因转录。 c-
Myc还能与抑癌基因产物 Rb蛋白特异结合调节细胞周期活
动 ,促进细胞凋亡。 Bc1-2蛋白位于线粒体内膜 ,核膜及内质网
膜上 ,是一个 21kD的磷蛋白 [4 ]。 Bc1-2抑制细胞凋亡 ,但不影响
细胞增殖分化。Bc1-2通过稳定细胞内膜系统、维持细胞内 Ca2+平衡 ,抑制 Ca2+ 从内质网释放、与 c-Myc一起阻止 p53进入核内 ,抑制 p53诱导细胞凋亡 ,以及通过抗氧化作用抑制细胞凋亡。 值得一提的是 ,编码 bc1-2相关蛋白 X的基因产物 Bax可与 Bc1-2形成异二聚体 , Bax /Bc1-2的比值越高 ,越易诱导细胞
凋亡 ,反之则抑制细胞凋亡。 Bc1-2可以作为治疗某些疾病的理
想靶点。 PCNA是一种分子量为 36kD的核蛋白 ,是 DN A多聚
酶δ的辅助蛋白 ,为 DNA复制所必需 ,在 DN A合成细胞增殖
过程中起重要作用 ,于 G1晚期出现 , S期达高峰 , G2期下隆 , M期及 G0期无表达。 因此 PCN A能较可靠地反映细胞群体增殖活性 [6 ]。本研究的结果证实 ,不同浓度的半边旗提取物 6F作用
HL-60细胞 12小时后能明显抑制 c-M yc、 Bc1-2及 PCN A的表
达水平 ,并呈剂量依赖关系。 6F的这一作用可能是其抑制 HL-
60细胞生长并诱导细胞凋亡的机制之一 ;但 6F是如何抑制这
三种基因的表达尚需作进一步的研究。
参考文献
[1 ]　何承伟 ,梁念慈 ,莫丽儿 ,等 .半边旗抗肿瘤有效成分对 HL-60细胞及淋巴细胞的体外杀伤作用及其构效关系 . 中草药 , 1999, 30
(增刊 ): 117-118
[ 2]　何承伟 ,梁念慈 ,莫丽儿 ,等 . 半边旗抗肿瘤有效成分 6F对 HL-60细胞周期的影响及体外增效作用 . 癌症 , 1998, 17( 3): 191-193
[3 ]　李金华 ,何承伟 ,梁念慈 ,等 .半边旗抗肿瘤有效成分对 HL-60细
胞 DN A拓扑异构酶活性及其细胞周期的影响 . 中国药理学报 ,
1999, ( 6): 541-545
[ 4 ]　 Park JR, Hocken bery DM. BCL-2, a novel regulator of apoptosis. J
Cell Bioch em, 1996, 60( 1) ; 12-17
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[ 6 ]　 Grzanka A, Skok Z, Janiak A, et al. The ex pres sion of p roli f erating
cell nuclear an tig en ( PCN A) in leukemia cel l lines HL-60 and K-
562 at th e ligh t and elect ron microscope level. Neoplasma, 2000,
47( 5): 288-293
【文章编号】1005-4057( 2002) -03-0166-01
睑板腺囊肿摘除术的改进
朱朝花　许倩茹　刘　凌 (广东医学院附属医院眼科 ,广东湛江 524001)
　　【关键词】睑板腺囊肿 ;摘除术 ;改进
【收稿日期】2002-01-20;【修订日期】2002-03-28
【作者简介】朱朝花 ,女 , 1969年出生 ,中专 ,护理师
　　睑板腺囊肿 (下称囊肿 )是由于睑板腺出口阻塞 ,腺体分泌
物潴留在睑板内而引起的慢性炎性肉芽肿 ,为眼科常见病 ,临
床上多采用手术摘除 ,但传统的手术方法中剪除全部囊肿会引
起睑缘凹陷 ,影响容貌 ,我们针对这一缺陷 ,对手术方法进行了
改进 ,现报道如下:
1　一般资料
1. 1　对象
本组 118例 ,其中单眼 108例 ,双眼 10例 ;男 52例 ,女 66
例年龄最大 65岁 ,最小者 6个月 ;发病最长时间 1 a ,最短者 10
d。
1. 2　手术方法的改进
用 0. 5% ～ 1%丁卡因表麻 2次 ,眼部常规消毒 ,用 2%利多
卡因在皮下和结膜下浸润 ,用囊肿镊夹住囊肿翻转眼睑 ,用镰
刀状刀片作纵切口 ,刮除囊肿内容物后 ,剪除部分囊壁 ,将近睑
缘处的囊壁留 1 /3～ 1 /5。 如囊肿发病时间较长 ,局部硬变者予
腔内注射强的松龙 0. 2 m L或地塞米松 1 mg加庆大霉素 0. 1
mL ,术毕局部压迫止血 5～ 10 min至无活动性出血 ,结膜囊内
涂四环素可的松眼膏 ,盖眼垫。
1. 3　结果
118例患眼局部平伏 ,伤口愈合好 ,无 1例出现睑缘凹陷 ,
术后随访 0. 5～ 2 a,无 1例复发。
2　讨论
传统的手术方法是在囊肿的内容物全部刮除后 ,不剪囊
壁 ,只在囊腔内涂 2%碘酊 ,但此法因保留完整的囊腔而复发率
高 ;或剪除全部囊壁以减小复发机会 ,但此法又会使睑缘出现
凹陷 ,影响患者正常的容貌 ,有些需要再次整容 ,增加患者的痛
苦和经济负担 ,令患者不满 ,甚至引起医疗纠纷。改进后的手术
方法克服了传统手术方法中的不足 ,在用刮匙彻底刮净囊腔内
容物后 ,剪切部分囊肿 ,致使囊腔不完整 ,不易复发 ,同时留下
的 1 /3～ 1 /5囊壁又可使睑缘有依托 ,不致于凹陷而影响容貌。
但应注意对已机化变性的囊肿 ,在腔内注射强的松龙时 ,切勿
将药物注入皮内 ,因为注入皮内可使局部皮肤发暗形成黑斑。
166
　第 20卷第 3期
2002年 6月 　　　　　
广　东　医　学　院　学　报
JOU RN AL OF GUAN GDONG M EDICAL COLLEGE
　　　　 Vol. 20 No. 3　
Jun. 2002