全 文 ：櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄
目前，香蕉根结线虫病已经成为海南省香蕉种植地区的
重要病害，由于近年来香蕉长期种植，复种率高，病原线虫不
断增加，导致根结线虫病发生越来越严重，造成香蕉产量降
低。为了有效和可持续控制香蕉根结线虫病，一方面要开展
对香蕉根结线虫种类的鉴定工作，明确其种群并制定相应的
防治措施;另一方面要加强微生物防治技术研究。
参考文献:
［1］黄秉智． 香蕉优质高产栽培［M］． 北京:金盾出版社，2008:1 － 8．
［2］李丰年，曾惜冰，黄秉智． 香蕉栽培技术［M］． 广州:广东科技出
版社，1999:1 － 10．
［3］李一农，李芳荣，罗海燕，等． 外来入侵生物香蕉穿孔线虫管理对
策［J］． 植物保护，2006，32(6):119 － 121．
［4］鄢小宁，郑服丛，林茂松． 两广地区香蕉根际寄生线虫的调查与
鉴定［J］． 热带农业科学，2005，25(6):4 － 8．
［5］张绍升． 植物线虫病害诊断与治理［M］． 福州:福建科学技术出
版社，1999:105．
［6］陈立杰，王 旭，段玉玺，等．蔗糖离心法分离土壤线虫的最佳条
件筛选［J］．沈阳农业大学学报，2007，38(6):849 － 851．
［7］方中达．植病研究方法［M］． 3 版．北京:中国农业出版社，1998:
306 － 311．
［8］Eisenback J D，Hirschmann H，Sasser J N，et al．四种最常见根结线
虫分类指南［M］． 杨宝君，译． 昆明:云南人民出版社，1986．
［9］杨宝君． 十五种根结线虫病害的病原鉴定［J］． 植物病理学报，
1984，4(2):107 － 111．
［10］思彬彬，张学娟，张靠稳． 不同寄主上南方根结线虫的
ISSＲ － PCＲ 鉴别［J］． 江苏农业科学，2014，42(3):35 － 36．
［11］刘维志． 植物线虫志［M］． 北京:中国农业出版社，2004:
39 － 655．
［12］黎少梅． 广东海南两省与香蕉有关的植物寄生线虫［J］． 热带
作物科技，1991(1):43 － 45．
［13］黎少梅，许克林，黎春生，等． 广东香蕉肾状线虫病的分布为害
及病原鉴定［J］． 华南农业大学学报，1987，8(4):9 － 14．
［14］李夷波，王寿华，李春敏，等． 云南河口香蕉黄化束顶病研究Ⅰ．
症状与发病规律［J］． 植物病理学报，1995，25(2):143 － 147．
［15］李迅东，翟留香，李 芹． 云南香蕉根际线虫种群动态的研究
［J］．华南农业大学学报，1998，19(4):32 － 35．
谢美华，李 霖，李雪玲，等． 芒萁叶斑病病原菌分离鉴定和生物学特性［J］． 江苏农业科学，2015，43(2):130 － 133．
doi:10． 15889 / j． issn． 1002 － 1302． 2015． 02． 041
芒萁叶斑病病原菌分离鉴定和生物学特性
谢美华1，李 霖2，李雪玲1，杨海艳1，王振吉1，范树国1
(1．楚雄师范学院化学与生命科学系 /云南省高校应用生物学重点实验室，云南楚雄 675000;
2．楚雄医药高等专科学校信息中心，云南楚雄 675000)
摘要:对芒萁叶斑病进行病原鉴定，研究病原菌生物学特性和杀菌剂对其抑制作用。结果表明，该病原菌为拟盘
多毛孢属真菌，最适宜生长的碳源为乳糖、氮源为硝酸钠。菌丝适宜生长的温度范围较窄，只能在 15 ～ 30 ℃范围内生
长，28 ℃ 菌丝生长最好，分生孢子在 32 ℃时萌发率最高;适宜菌丝和分生孢子生长和萌发的 pH值范围均较广，适宜
菌丝生长的 pH值为 4． 0，适宜分生孢子萌发的 pH值为 6． 0;光周期对菌落生长的影响不大，光照有利于分子孢子的
萌发。供试杀菌剂中以百菌清抑菌效果最好。
关键词:芒萁;叶斑病;病原鉴定;生物学特性
中图分类号:S435． 67 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2015)02 － 0130 － 04
收稿日期:2014 － 02 － 25
基金项目:云南省应用基础计划(编号:2011FZ186);云南省高校科
技创新团队支持计划;楚雄师范学院科研基金(编号:10YJYB02);
楚雄师范学院大学生创新创业训练计划(编号:2013cxcy04)。
作者简介:谢美华(1981—)，女，云南楚雄人，硕士，实验师，从事植物
病理学真菌病害研究。E － mail:xiemeihua@ cxtc． edu． cn。
通信作者:杨海艳，博士，高级实验师，从事植物病理学真菌病害研
究。Tel:(0878)3100784;E － mail:haiyanyang@ cxtc． edu． cn。
芒萁［Dicranopteris dichotomya (Thunb． )Bernh．］是多年
生常绿蕨类植物，广泛分布于中国长江以南各省区、朝鲜南部
及日本，是酸性土壤指示植物，有药用价值［1］。在自然状态
下，芒萁的种间竞争力极强，芒萁的化感物质释放到周围环
境，抑制并排挤其他植物的生长发育，从而形成单优势的“纯
植丛”群落［2］。近年来，关于芒萁的研究主要集中在生理生
化指标的测定［3 － 4］、化感作用［5 － 9］、多糖和黄酮提取［9 － 11］等方
面，但对芒萁叶斑病的研究目前还未见报道。本研究选取芒
萁叶斑病病叶，对该病害进行分离鉴定和生物学特性研究，以
期为芒萁叶斑病控制和防治方面提供理论基础。
1 材料与方法
1． 1 病原菌的分离
自楚雄彝族自治州西山公园采集到 9 组芒萁叶斑病的病
叶进行培养，共分离到 3 个菌株，其中，1 株是交链孢属菌株，
1 株是黑曲霉属菌株，1 株是拟盘多毛孢属菌株。将纯培养得
到的3个菌株孢子悬浮液接种到健康的芒萁叶片上，每组设24
个重复。10 d后，接种了交链孢属和黑曲霉属的植株依然健
康，而接种了拟盘多毛孢属菌株的植株出现了叶斑病。从接种
发病的芒萁植株上再分离到的纯培养，性状与接种物相同。从
—031— 江苏农业科学 2015 年第 43 卷第 2 期
而推测其为芒萁叶斑病的病原，菌株编号为 mangqi01。
1． 2 病原菌的鉴定
1． 2． 1 形态学鉴定 纯化分离到的病原菌，利用显微镜进行
观察，对其进行形态鉴定。
1． 2． 2 病原菌 rDNA － ITS 序列扩增和分析 用 CTAB 法提
取病原菌全基因组 DNA，进行 ITS － PCＲ 扩增。引物序列为
ITS4:5 － TCCTCCGCTTATTGATATGC － 3;ITS5:5 －
GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG －3。PCＲ 反应体系总体积
25 μL，反应各成分终浓度为:Taq 酶 0． 02 U /μL;引物
0． 4 μmol /L;DNA 模板 20 ng /μL;dNTPs 0． 4 μmol /L;2 ×
PCＲ反应缓冲液。PCＲ 扩增程序为:95 ℃预变性，3 min;
94 ℃变性 30 s，52 ℃退火 45 s，72 ℃复性 45 s，30 个循环;
72 ℃ 延伸 10 min。扩增产物送北京百泰克生物技术有限公
司测序，所得序列在 NCBI上比对，下载与其相似性较高的序
列及其近似属的序列，用 BioEdit、Clustal x和 MEGA 4． 1 软件
采用 NJ法进行系统分析，构建系统进化树。
1． 3 生物学特性研究［12 － 13］
1． 3． 1 不同碳源和氮源对菌落生长的影响 以察氏培养基
为基础培养基，分别以葡萄糖、甘油、D －果糖、D －半乳糖、乳
糖、可溶性淀粉等量取代其碳源;分别以硫酸铵、硝酸铵、甘氨
酸、L －苯丙氨酸、牛肉膏、蛋白胨取代氮源。每种培养基中
分别接种直径为 5 mm的菌块，25 ℃恒温黑暗培养，5 d 后用
十字交叉法测量菌落直径。每个处理设 3 个重复。
1． 3． 2 不同温度对菌落和分子孢子萌发的影响 取直径为
5 mm的菌块接种于察氏培养基中央，分别在 5、10、15、20、
25、28、30、32、35、40、45 ℃黑暗下恒温培养，5 d 后测量菌落
直径。用无菌水制备菌悬液，滴于载玻片上，培养条件同菌落
培养，24 h后镜检孢子萌发率，每次检 100 个孢子。每个处理
设 3 个重复。
1． 3． 3 不同 pH 值对菌落和分子孢子萌发的影响 将高压
灭菌后的察氏培养基 pH值分别调为 3． 0、4． 0、5． 0、6． 0、7． 0、
8. 0、9． 0、10． 0、10． 9 倒平板，取直径 5 mm的菌块接种于察氏
培养基中央，黑暗条件下 25 ℃培养 5 d后测量菌落直径。用
0． 2 mol /L 磷酸氢二钠和 0． 2 mol /L 柠檬酸缓冲液将分生孢
子悬浮液 pH 值调配为 3． 0、4． 0、5． 0、6． 0、7． 0、8． 0、9． 0、
10. 0、10． 9，置于 25 ℃恒温箱黑暗培养，24 h 后镜检萌发率，
每次检 100 个孢子。每个处理设 3 个重复。
1． 3． 4 不同光照处理 取直径为 5 mm 的菌块接种于察氏
培养基中央，分别置于 24 h 光照、光 －暗周期 12 h － 12 h、
24 h 黑暗环境中，25 ℃培养 5 d后测量菌落直径。用无菌水
制备菌悬液，滴于载玻片上，培养条件同菌落培养，24 h 后镜
检孢子萌发率，每次镜检 100 个孢子。每个处理设 3 个重复。
1． 4 不同杀菌剂对菌落生长的影响
将代森锰锌、百菌清、敌克松、 霜·锰锌和扑海因用无
菌水按其常用倍数稀释，每 10 mL培养基中加入 1 mL药液制
成含药液的平板，对照组加入等量无菌水。取 5 mm 菌块置
于察氏培养基平板中央，25 ℃黑暗培养 5 d后测量菌落直径。
每个处理设 3 个重复。
2 结果与分析
2． 1 芒萁病原菌的鉴定
2． 1． 1 形态学鉴定 该病主要发生在叶部，发病初期，叶缘、
叶脉出现灰色、灰黑色小斑点;中期小斑点扩大成不规则灰色
轮纹，其上着生黑色斑点，并伴有叶黄化、卷曲等症状，病情严
重时整个叶片枯萎掉落。PDA培养基上，28 ℃培养 3 d 后菌
落直径 6 cm，隆起，菌丝白色、絮状，直径 1． 5 cm 处有明显的
轮纹，反面杏色，直径 1． 5 cm处出现深杏色轮纹，且轮纹上的
培养基呈辐射形开裂;菌丝生长速度快，28 ℃培养 5 d后菌落
直径为 5 cm;长满全皿，正面白色，不均匀分布黄褐色菌丝，反
面出现深褐色不规则小圆点;培养 10 d，正面不均匀分布透明
水滴及黑色油滴，反面均匀分布深褐色圆点，不均匀分布黑点
(图 1)。分生孢子 5细胞，多为竹节状或棒状，少数为纺锤形，
直立或弯曲，向基部渐尖;中间 3 色胞异色型，第 1、2 色胞褐
色，梯形，第 2色胞外壁加厚，第 3色胞浅褐色，半透明，分隔处
缢缩或不缢缩;顶胞多为长梯形或圆柱形，少数为三角形，透
明，具侧生式顶端附属丝 1 ～ 3 根，多为 2 根;基部细胞圆锥形
或锥形，不具或只具中生式基部附属丝 1 根;大小(3． 7 ～
5． 9)×(4． 2 ～6． 7)μm(平均 3． 95 ×6． 3 μm)(图 2、图 3)。
2． 1． 2 病原菌 rDNA － ITS 序列分析 将 mangqi01 菌株的
5． 8S rDNA － ITS序列在NCBI里进行序列比对，结果显示
—131—江苏农业科学 2015 年第 43 卷第 2 期
mangqi01 与 Pestalotiopsis sp．、Pestalotiopsis oxyanthi、Pestaloti-
opsis foedans、Pestalotiopsis clavispora、Pestalotiopsis ixorae 和
Pestalotiopsis mangiferae 同源性最高，下载它们的序列，以
Pestalotia cinchonae 和 Pestalotia subcuticularis 为外群，用 Bi-
oEdit、Clustal x 和 MEGA 4． 1 软件采用 NJ 法进行系统分析，
构建系统进化树，结果(图 4)表明，与其遗传距离较近的有 6
个种，属内节点支持率为 0． 96，结合其形态特征的观察研究，
供试菌株 mangqi01 为腔孢纲(Coelomycetes)黑盘孢目(Melan-
coniale)拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis Stey．)［14 －16］，病原菌的种
待定。
2． 2 不同氮源和碳源对 mangqi01 菌落生长的影响
试验结果表明，该菌对供试的 7 种氮源和碳源均能利用，
菌落在不同氮源和碳源培养基上生长速度有明显差异。最适
该菌生长的氮源是硝酸钠，与硫酸铵、硝酸铵、L －苯丙氨酸、
牛肉膏、甘氨酸和蛋白胨作氮源差异极显著。最适该菌生长
的碳源是乳糖，与可溶性淀粉、蔗糖和葡萄糖差异不显著;与
D －半乳糖、D －果糖和甘油差异极显著(表 1)。
表 1 不同 N源和 C源对 mangqi01 菌株生长的影响
N源 菌落直径
(cm) C源
菌落直径
(cm)
硫酸铵 3． 83 ± 0． 02Dd 葡萄糖 4． 18 ± 0． 33Aa
硝酸铵 2． 00 ± 0． 04Ee D －果糖 3． 35 ± 0． 1Bb
甘氨酸 4． 25 ± 0． 06BbCc 甘油 2． 95 ± 0． 19Cc
L －苯丙氨酸 3． 92 ± 0． 19Dd D －半乳糖 2． 53 ± 0． 13Dd
牛肉膏 4． 20 ± 0． 05BbCc 乳糖 4． 42 ± 0． 03Aa
蛋白胨 4． 32 ± 0． 07Bb 可溶性淀粉 4． 21 ± 0． 08Aa
硝酸钠 4． 75 ± 0． 09Aa 蔗糖 4． 30 ± 0． 162Aa
注:同列数据后小写、大写字母不同者分别表示差异显著(P ＜
0． 05)、极显著(P ＜ 0． 01)。表 2、表 3、表 4 同。
2． 3 不同光照对 mangqi01 菌株生长的影响
通过 24 h 光照、12 h 光 /暗交替、无光照培养，有无光照
对菌落的生长影响差异不显著。光照条件下分生孢子萌发率
最高，与 12 h光 /黑影响无显著差异，与黑暗条件培养达到极
显著差异(表 2)。
2． 4 不同温度对 mangqi01 菌落生长和孢子萌发的影响
试验结果表明，该病原菌生长适应的温度范围较窄，只能
在 15 ～ 30 ℃范围内生长，最适的生长温度是 28 ℃，与 25 ℃
表 2 不同光照对菌落和孢子萌发的影响
处理条件
菌落直径
(cm)
分生孢子萌发率
(%)
光照 0． 88 ± 0． 06Aa 23． 33 ± 1． 76Aa
光 /黑 1． 25 ± 0． 08Aa 20． 67 ± 0． 67Aa
黑暗 1． 18 ± 0． 12Aa 11． 33 ± 0． 88Bb
无显著差异，与 30 ℃差异显著，与其他处理差异极显著;该病
原菌在 10 ℃以下、32 ℃ 及以上温度条件下停止生长。该病
原菌孢子在 5 ～ 45 ℃ 范围内均能萌发，最适萌发温度为
32 ℃，与其他处理差异极显著(表 3)。
表 3 温度对菌落生长和孢子萌发的影响
温度
(℃)
菌丝生长速度
(cm)
孢子萌发数
(个)
5 0Cc 1． 67 ± 0． 88Gg
10 0Cc 7． 33 ± 0． 67Ff
15 0． 75 ± 0． 06Cc 13． 00 ± 0． 67Ee
20 2． 78 ± 0． 22Bb 20． 33 ± 0． 881Dd
25 3． 28 ± 0． 15AaBb 22． 00 ± 1． 53Dd
28 3． 62 ± 0． 52Aa 37． 67 ± 1． 45Cc
30 2． 93 ± 0． 22Bb 15． 33 ± 0． 33Ee
32 0Cc 52． 33 ± 1． 20Aa
35 0Cc 43． 00 ± 2． 64Bb
40 0Cc 4． 00 ± 0． 58FfGg
45 0Cc 1． 00 ± 0． 58Gg
2． 5 不同 pH值对 mangqi01 菌落生长和孢子萌发的影响
试验结果表明，菌丝和分生孢子萌发适应的 pH 值范围
较广，在 pH值 2． 5 ～ 10． 9 之间均能生长和萌发。该菌菌丝
在酸性条件下长得较好，pH 值 4 时菌丝生长最快，与 pH 值
—231— 江苏农业科学 2015 年第 43 卷第 2 期
9、pH值 10 和 pH值 10． 9 差异极显著;与其他处理差异不显
著。pH值 6． 0 时孢子萌发率最高，pH 值 6． 0 时孢子萌发率
与与其他处理差异极显著(表 4)。
表 4 pH值对菌丝生长和孢子萌发的影响
pH值 菌丝生长速度
(cm)
孢子萌发数
(个)
2． 5 2． 87 ± 0． 16AaBbCc 9． 67 ± 0． 33DdEe
3 3． 00 ± 0． 25AaBb 13． 33 ± 0． 88Dd
4 3． 15 ± 0． 16Aa 19． 00 ± 1． 15Cc
5 2． 92 ± 0． 17AaBbCc 23． 00 ± 1． 15Bb
6 2． 92 ± 0． 04AaBbCc 32． 00 ± 1． 15Aa
7 2． 87 ± 0． 08AaBbCc 24． 00 ± 1． 53Bb
8 2． 65 ± 0． 32AaBbCc 23． 33 ± 1． 76Bb
9 2． 18 ± 0． 19BbCc 18． 00 ± 1． 15Cc
10 2． 08 ± 0． 12Cc 12． 33 ± 0． 33DdEe
10． 9 2． 20 ± 0． 16BbCc 8． 67 ± 0． 88Ee
2． 5 不同杀菌剂对菌落生长的影响
试验结果表明，与对照相比，5 种广谱杀菌剂对该菌的生
长均有抑制作用(图 5)。百菌清对该菌的抑制效果最好，随
后依次是扑海因、代森锰锌、 霜·锰锌，效果最差的是敌克
松。百菌清的抑菌效果与扑海因和代森锰锌无显著差异，与
霜·锰锌和敌克松差异极显著。
3 结论与讨论
3． 1 病原菌的分离鉴定
芒萁繁殖力极强，生长发育旺盛，种间竞争力强而排挤其
他植物种类的生长与分布，因此在植物群落下层连续成片分
布，形成单优层片［17］，从而使病害更容易传播蔓延。目前，还
未见对芒萁叶斑病病原菌的报道。本研究通过对芒萁叶斑病
病原菌进行分离纯化，利用形态学特征观察并结合分子生物
学手段进行分析鉴定［18］，结果表明，两者的鉴定结果相互吻
合，初步推测病原菌为拟盘多毛孢属真菌。
3． 2 病原菌生物学特性
本研究结果表明，该菌对供试的 7 种氮源和碳源均能利
用，菌落在不同氮源和碳源培养基上生长速度有明显差异，最
适该菌生长的氮源是硝酸钠，最适该菌生长的碳源是乳糖。
该病原菌适宜生长的温度范围较窄，只能在 15 ～ 30 ℃范围内
生长，最适的生长温度是 28 ℃，在 10 ℃以下、32 ℃及以上温度
条件下停止生长;该病原菌孢子在 5 ～45 ℃范围内均能萌发;有
无光照对菌落生长无显著影响，光照有利于分子孢子的萌发;适
宜菌丝和分生孢子生长和萌发的 pH值范围均较广，菌丝适宜生
长的 pH值为 4． 0，分生孢子适宜萌发的 pH值为 6． 0。
3． 3 广谱杀菌剂对该菌生长的影响
在本研究中 5 种广谱杀菌剂对该菌落的生长均有抑制作
用。百菌清对该菌的抑制效果最好，随后依次是扑海因、代森
锰锌、 霜·锰锌，效果最差的是敌克松。该菌的生物学特
性试验都是在实验室中进行的，相对于自然生长时复杂的生
长环境，实验室的环境相对单一，要确定该病害的生物学特
性，哪种杀菌剂对该菌的抑制作用最好，还有待开展大田试验
进一步证实。
参考文献:
［1］苏育才． 芒萁多糖提取及抗菌活性初步研究［J］． 亚热带植物科
学，2005，34(2):43 － 45．
［2］苏育才，陈晓清． 芒萁的研究进展［J］． 生物学教学，2012，37
(2):5 － 7．
［3］阴卓越，张明如，邹伶俐，等． 不同遮阴处理对芒萁冬季光合参数
日变化的影响［J］． 福建农林大学学报:自然科学版，2013，42
(4):418 － 422．
［4］梁晓华，梁晓东，徐成东，等． 云南 3 种蕨类植物部分生理生化指
标的测定［J］． 江苏农业科学，2010，38(4):378 － 380．
［5］叶居新，洪瑞川，聂义如，等． 芒萁植株浸出液对几种植物生长的
影响［J］． 植物生态学与地植物学学报，1987(3):203 － 211．
［6］罗丽萍，葛 刚，陶 勇，等． 芒萁对几种杂草和农作物的生化他
感作用［J］． 植物学通报，1999，16(5):591 － 597．
［7］罗丽萍，葛 刚，袁宜如，等． 芒萁水提液对几种农作物生长的影
响［J］． 南昌大学学报:理科版，1998，22(4):13 － 17．
［8］袁宜如，陶 勇，葛 刚，等． 芒萁水提液对三种受体植物若干生
理特性的影响［J］． 南昌大学学报:理科版，2000，24(4):
317 － 322．
［9］袁宜如，李晓云，邹峥嵘，等． 芒萁水提取物对玉米种子萌发和幼
苗生长的影响［J］． 安徽农业科学，2009，37(35):17434 －
17435，17459．
［10］汤 晓，朱建华． 芒萁根茎黄酮类化合物的提取工艺优化研究
［J］． 宁波职业技术学院学报，2008，12(5):112 － 115．
［11］丁利君，周圳辉，林燕如． 芒萁中黄酮物质的提取及其抗氧化研
究［J］． 食品科学，2005，26(8):77 － 82．
［12］方中达． 植病研究方法［M］． 北京:农业出版社，1979．
［13］陆家云． 植物病原真菌学［M］． 北京:中国农业出版社，2001．
［14］张中义． 植物病原真菌学［M］． 成都:四川科学技术出版社，
1988:424 － 436．
［15］巴尼特 H L，亨特 B B． 半知菌属图解［M］． 沈崇尧，译． 北京:
科学出版社，1977:13 － 25．
［16］王忠文，廖咏梅，陈卫平，等． 中国拟盘多毛孢属的新组合种
(Ⅵ)［J］． 广西农业生物科学，2006，21(2) :163 － 166．
［17］张明如，何 明，温国胜，等． 芒萁种群特征及其对森林更新影响
评述［J］． 内蒙古农业大学学报:自然科学版，2010，31(4):
303 － 308．
［18］Hidaka Y，Kaneda T，Amino N，et al． Chinese medicine，Coix seeds
increases peripheral cytotoxic T and NK cells［J］． Biotherapy，
1992，5:201 － 203．
—331—江苏农业科学 2015 年第 43 卷第 2 期