全 文 ：半边旗提取物 5F对乳腺癌细胞内活性氧水平的影响
邱万寿1，刘威2，吴珏堃1，李玺1，龙梅珺1(1．中山大学附属第三医院甲乳外科，广东 广州 510630;2．暨南大学医学院第四附属医
院，广州市红十字会医院乳腺科，广东 广州 510220)
摘要:目的 观察中草药半边旗提取物 5F(Ent-11a-hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-oic- acid，5F)对乳腺癌细胞的抑制作用及其
对乳腺癌细胞内活性氧(reactive oxygen species，ＲOS)水平的影响。方法 不同浓度(0、5、10、20、40 μg /mL)的 5F分别处理 3
种不同乳腺癌细胞(MCF-7、MDA-MB-231 以及 SK-BＲ-3)，用 CCK-8 法检测 5F 对不同乳腺癌细胞株增殖的影响;流式细胞仪
检测 5F处理后的各乳腺癌细胞株的凋亡率;检测不同浓度的 5F 处理后的乳腺癌细胞内 ＲOS 的水平。结果 5F 可抑制
MDA-MB-231、MCF-7、SK-BＲ-3 三种乳腺癌细胞的增殖，其抑制效果与 5F 的浓度及作用时间呈显著正相关(P ＜ 0． 05);经 5F
作用 24 h后，MDA-MB-231 细胞、MCF-7 细胞及 SK-BＲ-3 细胞的凋亡率较阴性对照组明显增加(P ＜ 0． 05) ;5F 作用于乳腺癌
细胞株，ＲOS相对含量均较未处理组降低，且随 5F浓度升高 ＲOS水平降低越明显(P ＜ 0． 05)。结论 5F可抑制乳腺癌细胞
的增殖，其抑制效果与 5F浓度和作用时间相关;5F能降低细胞内 ＲOS的生成水平，并呈现剂量依赖性。
关键词:半边旗;5F;乳腺癌细胞;活性氧
中图分类号:Ｒ95 文献标志码:A 文章编号:1673-4610(2015)03-00-03
基金项目:广东省女性肿瘤用药研究基金项目(2014D09)
作者简介:邱万寿，Tel:13802773326，E-mail:wsqiu-d@ 163． com
Effects of 5F from Pteris semiinnata L． on Ｒeactive Oxygen Species Levels in Breast Cancer Cells
QIU Wanshou1，LIU Wei2，WU Juekun1，LI Xi1，LONG Meijun1(1． Department of Thyroid and Breast Surgery，The Third
Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou，Guangdong 510630，China;2． Department of Breast，Guangzhou Ｒed Cross
Hospital，Medical College，Jianan University，Guangzhou，Guangdong 510220，China)
ABSTＲACT:OBJECTIVE To explore the anti-cancer effects and effects on reactive oxygen species levels of ent-11α-hydroxy-15-
oxo-kaur-16-en-19-oic-acid (5F)in human breast cancer cells．METHODS Human breast cancer cells (MCF-7，MDA-MB-231，SK-
BＲ-3)were treated with 5F in different concentrations (0，5，10，20，40 μg /mL)for different periods respectively． Cell viability was
detected by a cell counting kit-8． The appotosis rates of cells were examined by flow cytometer． To detect the level of ＲOS in breast
cancer cells after treated with different concentrations of 5F． ＲESULTS 5F inhibited the proliferation of MDA-MB-231，MCF-7，SK-
BＲ-3 in a concentration-and time-dependent manner (P ＜ 0． 05)． After treated by 5F for 24 h，the apoptosis rate of MDA-MB-231，
MCF-7，SK-BＲ-3 were increased significantly when compared with the control group (P ＜ 0． 05)． The ＲOS level of 5F in patients of
the treated group were lower than that of the untreated groups，and in a concentration-dependent manner (P ＜ 0． 05)． CONCLUSION
5F could inhibit the proliferation of breast cancer cells in a concentration-and time-dependent manner． 5F can reduce intracellular
ＲOS levels in a concentration-dependent manner．
KEY WOＲDS:pteris semipinnata L;5F;breast cancer cell;reactive oxygen species
半边旗是一种传统的中草药，具有清热解毒、消
肿止痛的功效，主要用于肝炎、肠炎及蛇咬伤的治
疗［1］。近年研究发现半边旗的提取物能有效抑制肿
瘤细胞的生长［2-3］，将其提取物进一步分离纯化发现
其活性物质为贝壳杉烷型二萜类化合物(ent-11α-
hydroxy-15-oxo-aur-16-en-19-olic acid，5F)。低浓度
的 5F与氟尿嘧啶、顺铂和长春新碱等化疗药物合用
后，可增加这些药物对癌细胞的杀伤作用，同时通过
减少药物的剂量而降低了其毒性，其化疗增敏及其
减少毒副作用的机制可能与 5F 对细胞内活性氧
(reactive oxygen species，ＲOS)水平的调控有关［4］。
ＲOS是一类比分子氧有更活泼化学反应能力的含氧
物，在细胞凋亡中起到至关重要的作用［5-6］。本研究
以 MDA-MB-231、MCF-7、SK-BＲ-3 三种乳腺癌细胞
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株为研究对象，观察中草药半边旗提取物 5F对乳腺
癌细胞株增殖、凋亡的影响及其对细胞内 ＲOS 水平
的影响。
1 材料和方法
1． 1 材料
人乳腺癌细胞株(MDA-MB-231、MCF-7、SK-BＲ-
3)均来自中山大学附属第三医院中心实验室。半边
旗提取物 5F干粉由广东医学院广东天然药物研究
与开发重点实验室刘义教授馈赠。半边旗中的 5F
提取及稀释方法见相关研究文献［7］。干粉以丙二醇
溶解，蒸馏水稀释，制成丙二醇体积分数为 0． 15、5F
质量浓度为 1 000 mg /L的储备液，除菌过滤后冷藏
保存，实验时即以培养基稀释至所需浓度(丙二醇最
终浓度≤0． 012)。
1． 2 方法
1． 2． 1 分组 设置空白组和阴性对照组。空白组
为加入相同体积 DMEM 培养液，不含细胞。阴性对
照组为含有溶媒和细胞。
1． 2． 2 细胞增殖活性检测 取对数生长期生长的
MDA-MB-231、MCF-7、SK-BＲ-3 细胞用 0． 25%胰蛋
白酶消化，用完全培养液调制成 2． 0 ～ 10． 0 × 104
个 /mL细胞悬液，接种于 96 孔板中，每孔接种 100
μL(含 5． 0 × 103 个细胞)。24 h 后吸出培养液，加
入含有不同浓度的 5F 的新培养液 100 μL，5F 终浓
度分别为 0、5、10、20、40 μg /mL。每株细胞每药物
处理组每一浓度设 8 个平行孔。继续培养 24、48、72
h。移除培养基，每孔加入 100 μL 培养基并加入 10
μL的 CCK-8，共培养 2 h，然后用 Bio-Tek 酶标仪检
测 450 nm处的吸光度(A)值。细胞抑制率 =［1 －
(实验组 A值 －空白组 A 值)/(阴性对照组 A 值 －
空白组 A值)］× 100%。实验重复 3 次。
1． 2． 3 细胞凋亡的检测 对数生长期浓度为 2． 0
× 105 个 /mL 的细胞(MDA-MB-231、MCF-7、SK-BＲ-
3) ，加 2 mL到六孔板中，24 h细胞贴壁后，加入不同
浓度的 5F药液，使其终浓度为 0、40 μg /mL，继续培
养 48 h，倒置显微镜观察其形态，之后用预冷的 PBS
洗涤 2 次，0． 25%胰蛋白酶消化收集细胞，1 200 r /m
低速离心 5 min，弃上清，PBS 清洗 1 次，离心去
PBS，加入 5 μL Annexin V-FITC混匀后，避光孵育 30
min后，上机进行流式检测。具体方法按试剂盒所
附操作指南进行。
1． 2． 4 活性氧水平检测 通过硝基蓝四氮唑染料
受到超氧阴离子 O2-还原，产生蓝黑色素沉淀，通过
溶解后吸光度值强弱定性且间接定量检测细胞内外
ＲOS生成或增加。取对数期生长的 3 株乳腺癌细
胞，细胞浓度调整为 1． 0 × 104 个 /mL，加入 96 孔板
中按细胞培养至 85%细胞融合，吸出培养液，加入
含 5F浓度为 0、5、10、20、40 μg /mL 的培养基，每个
浓度设 8 个复孔。在培养箱里继续培养 3 h 后，加
入每孔染色液(Ｒeagent A)20 μL，37 ℃下培育 60
min。吸去上层液体，加入固着液(Ｒeagent B)每孔
100 μL，待干。重复加入固着液，在空气中晾干后，
每孔加入溶解液(Ｒeagent C)100 μL。96 孔板放置
于摇床上低速摇动至溶解液充分溶解，酶标仪测定
650 nm的吸光度值。按照公式计算 ＲOS 浓度，ＲOS
相对含量(%)=(A药物 /A正常对照)× 100%。
1． 3 统计学分析
本实验数据以均数 ±标准差(珋x ± s)表示。采用
SPSS16． 0 统计学软件处理数据，统计方法主要为单
因素方差分析，方差齐时采用 Tukey 法进行多重比
较，方差不齐采用 Tamhane’s T2 方法进行多重比
较。P ＜ 0． 05 认为差异有统计学意义。
2 结果
2． 1 5F抑制乳腺癌细胞的增殖
CCK-8 染色实验结果表明，5F 可以显著抑制 3
种乳腺癌细胞株的增殖，且随着 5F浓度的增加和作
用时间的延长，存活的细胞逐渐减少，5F 的抑制效
果呈现明显的剂量和时间依赖性(P ＜ 0． 05)(见图
1A、1B、1C)。比较 3 种不同的细胞增殖活性发现，
SK-BＲ-3 细胞对 5F最为敏感，当 40 μg /mL 的 5F作
用 72 h后，其乳腺癌细胞存活率不足 6%;而相同浓
度及相同作用时间下，MCF-7 细胞和 MDA-MB-231
细胞的存活率分别为 50%和 44． 13%。
图 1A 5F对 MDA-MB-231 细胞的抑制情况，* P ＜ 0． 05
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图 1B 5F对 MCF-7 细胞的抑制情况，* P ＜ 0． 05
图 1C 5F对 SK-BＲ-3 细胞抑制情况，* P ＜ 0． 05
2． 2 5F诱导乳腺癌细胞发生凋亡
流式细胞检测凋亡发现:经浓度为 40 μg /mL 5F
处理 48 h后 MDA-MB-231，MCF-7及 SK-BＲ-3三种细
胞的凋亡率依次为 40． 13%、60． 44%、70． 49%(见图
2)。
图 2 5F作用 48 h后的乳腺癌细胞凋亡情况
2． 3 5F乳腺癌细胞株 ＲOS水平的影响
5F 作用 3 h 后，乳腺癌细胞(MDA-MB-231、
MCF-7、SK-BＲ-3)内 ＲOS水平降低，而且随 5F 剂量
的增加而降低，各浓度组 ＲOS均低于空白对照组(P
＜ 0． 05，见图 3)。
图 3 5F对乳腺癌细胞内 ＲOS水平的影响(* P ＜ 0． 05)
3 讨论
蒽环类药物作为抗肿瘤药物被广泛使用，是乳
腺癌化疗的一线用药。有研究认为，蒽环类药物的
抗肿瘤作用是通过诱导活性氧(ＲOS)的生成和脂类
的过氧化反应实现的［8］。同时，蒽环类药物的副反
应，尤其是心脏毒性，亦与氧化应激有关［9-10］。Myers
等人发现自由基清除物维生素 E能降低阿霉素引起
的急性心脏毒性［11］。同时有研究报告了应用抗氧
化剂可令阿霉素引起的心脏毒性得到改善［12-13］。另
外有研究发现，ＲOS 与药物耐药机制的相关［14-15］。
研究指出，ＲOS的生成导致多药物耐药(MDＲ)转运
蛋白表达增多，从而泵出更多已进入胞内的药物，此
为部分抗肿瘤药物耐药的可能机制之一。因此，
ＲOS在蒽环类药物的抗肿瘤效能及其副反应的发生
机制中扮演着重要的角色。基于此，有人提出能否
在不牺牲蒽环类药物的抗肿瘤治疗效能的情况下而
达到预防因 ＲOS生成导致的心脏毒性。
现有研究发现，5F 能在体外杀灭或抑制多种人
类肿瘤细胞［2-3］，同时低浓度的 5F与氟尿嘧啶、顺铂
和长春新碱等化疗药物合用后，可增加这些药物对
癌细胞的杀伤作用，同时通过减少药物的剂量而降
低了其毒性，其化疗增敏及其减少毒副作用的机制
可能与 5F对细胞内 ＲOS水平的调控有关［4］。
基于以上理论，本研究观察 5F对乳腺癌细胞的
抑制作用及其对乳腺癌细胞内 ＲOS 水平的影响，为
5F与乳腺癌一线化疗药物的联用做初步的探索。
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本研究以 MDA-MB-231、MCF-7、SK-BＲ-3 三种乳腺
癌细胞株为研究对象，结果表明，5F可以显著抑制 3
种乳腺癌细胞株的增殖，且 5F的抑制效果呈现明显
的剂量和时间依赖性。5F 能降低细胞内 ＲOS 的生
成水平，并呈现剂量依赖性。5F 通过某些机制降低
细胞内 ＲOS水平，如果能将其与借助 ＲOS水平诱导
肿瘤细胞凋亡的药物联用，可能在诱导肿瘤细胞凋
亡的同时，有效保护非肿瘤细胞的生存，减轻其他药
物的毒副作用。
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