全 文 ：763《癌症》2000年第 19卷第 8期
收稿日期:1999-11-08;修回日期:1999-12-03
基金项目:本课题受广东省科委重大科技攻关项目 (N 0.
9622007-002);国家自然科学基金(批准号 :
39870900)资助
*通讯作者:Tel:86-759-2388501
Fax :86-759-2284104
E-mail:gdm cpres@gdm c.edu.cn
半边旗有效化合物对肺癌细胞 DNA 拓扑异构酶 、
TPK 及 c-myc基因的影响
李金华* , 梁念慈 , 莫丽儿■ , 张 晓 , 何承伟
广东医学院医用生化研究所 , ■化学教研室 , 广东 湛江 524023
【摘 要】 目的:研究半边旗有效化合物 6F 和 A 对肺癌细胞 DNA 拓扑异构酶(TOPO)Ⅰ和Ⅱ活性的影响;化合物A 对
细胞胞浆和胞膜酪氨酸蛋白激酶(TPK)活性及癌基因 c-myc蛋白表达的影响 。方法:通过电泳法测定化合物 6F 和 A 对肺癌
细胞 DNA 拓扑异构酶(TOPO)Ⅰ 、Ⅱ活性的影响;用液体闪烁计数法测定化合物 A 对酪氨酸蛋白激酶(TPK)活性的影响;流
式细胞仪间接荧光检测法测定化合物 A 对 c-myc 基因蛋白表达的影响 。结果:化合物 6F 和 A 可抑制细胞 DNA 拓扑异构酶
Ⅰ 、Ⅱ的活性 , 1.0 mg/L 的 6F 和 A 即开始抑制 TOPO Ⅰ的活性 ,随浓度升高抑制作用增强;0.01 mg/L 的 6F 和 10.0 mg/L
的 A 对 TOPO Ⅱ的活性有强烈的抑制作用;化合物 A 对细胞中胞膜 TPK 活性有一定的抑制作用 ,但对胞浆 TPK 的活性几乎
没有影响;化合物 A 对 c-myc 基因的蛋白表达有抑制作用 。结论:DNA 拓扑异构酶是化合物 6F 和 A 抑制细胞生长的靶点之
一 ,化合物 A 对 TPK 活性有一定的抑制作用 ,对 c-myc基因的蛋白表达有抑制作用 。
关键词:半边旗;DNA 拓扑异构酶;酪氨酸蛋白激酶(TPK);c-myc
中图分类号:R979.1;R734.2文献标识码:A 文章编号:1000-467X(2000)08-0763-05
Effect of active compounds isolated from Pteris Semipinnata L.
on DNA topoisomerases and tyrosine protein kinase and
expression c-myc of in lung adenocarcinoma cells
LI Jin-hua* , LIANG Nian-ci , MO Li-er■ , et al.
Insti tute of Medical B iochem istry , ■Department of Chemistry , Guangdong Medical Col lege ,
Zhanj iang 524023 , P.R.China
【Abstract】Object ive:T o investiga te the effect of active com pounds6F and A from Pte ris Semipinna ta L.
(PsL)on t he activ ites o f DNA topoisomerase(TOPO)Ⅰ and Ⅱ , activ ities of cy tosolic and membrane TPK , and
expression o f oncogene c-myc in lung adenocarcinom a cells.Methods:The effect of compounds6F and A on ac tivi-
ties o f TOPO Ⅰ and Ⅱ w ere assayed by electrophoresis;the e ffect o f com pound A on ac tivities of cy toso lic and
mem brane TPK w as measureed byscintillation counting ;the ef fect o f compound A on expression of oncogene
c-myc w as de term ined by f low cy tom er try indirec t fluo rim etry.Results:Compounds 6F and A inhibited the ac tivi-
ties o f DNA TOPO Ⅰ and Ⅱ , 1.0 mg/L of 6F or A strongly inhibited the activitie s o f TOPO Ⅰ , w hile their
strongly inhibition to TOPO Ⅱ occured with the concentration of 0.01 mg/L and 1.0 mg/L respectively.Com-
pound A mildly inhibited the ac tivi ties of membrane TPK ,but
almost did no t inhibite the activities of cy tosolic TPK.Com-
pound A also inhibited the expression of oncogene c-myc.
Conclusion:Topo isomerases are ta rget o f com pound 6F and
Awhich inhibiting the grow th of tumor cells.Compound A
could slightly inhibit the activities o f TPK , and exhibis a in-
hibito ry effect on the expression of oncogene c-myc.
Key words:Pte ris Semipinna ta L.;DNA topoisomerase;
Tyrosine protein kinase;c-myc
764
DNA拓扑异构酶是一种重要的核酶 , 包括Ⅰ型
(TOPO Ⅰ)和Ⅱ型(TOPO Ⅱ),通过 DNA 链断裂和
重接而改变 DNA 的拓扑结构 , 调节其空间构型变
化 ,在细胞生长过程中起重要作用。TOPO Ⅰ通过非
共价键与底物结合引起单链 DNA 断裂 , 其活性不要
AT P 提供能量[ 1] 。TOPO Ⅱ则利用 ATP 提供能量 ,
切断双链 DNA 形成 DNA -酶复合物 , 引起单链或
双链 DNA 的断裂或再连接而影响 DNA 复制[ 1] 。国
内外许多文献报道[ 2 ～ 4 ] ,临床上重要的化疗药物如
喜树碱 、阿霉素 、鬼臼乙叉甙 (Vp -16)、安吖啶
(m -AMSA)等都是 TOPO Ⅰ或 TOPO Ⅱ的抑制
剂 , 它们以嵌入或非嵌入的形式导致 DNA 单链或
双链的断裂 , 干扰酶的正常功能 。 TPK 是使蛋白
质酪氨酸残基磷酸化的蛋白激酶 , 已证明它与细
胞增殖 、分化 、癌基因活化及信息传递有关[ 5 ] , 在
体外 TOPO Ⅰ和 TOPO Ⅱ均是 TPK 的底物 。某些
被认为是 TPK 的特异性抑制剂也是 TOPO Ⅰ或
TOPO Ⅱ的抑制剂[ 6 ] 。
半边旗是一种民间草药 ,其提取物具有显著体内
外抗肿瘤活性[7 ] , 前文我们报道从中提取的一系列化
合物在体外可抑制多种人癌细胞的生长[ 8] 。本文将研
究半边旗有效化合物 6F 和 A 对 DNA 拓扑异构酶
Ⅰ 、Ⅱ的影响 ,对 TPK 活性及对癌基因 c-myc蛋白
表达的影响 ,以探讨半边旗的抗肿瘤作用机制 。
1 材料与方法
1.1 受试药物和主要试剂
半边旗提取物:6F 和 A 由我所植化室分离纯
化 ,并鉴定结构。用 DMSO 配制成原液(6F 浓度为 10
g/L , A 浓度为 50 g/L),分装冻存 ,临用前稀释成所
需浓度 。RPM I -1640培养基为 Gibco 公司产品;新
生小牛血清购于杭州四季青生物材料公司;pBR322
质粒 DNA 、pUC19质粒 DNA 、亮肽素(Leupeptin)、
大豆胰蛋白酶抑制剂 、 苯咪啶 、鬼臼乙叉甙 (Vp-
16)、喜树碱(CPT)、聚 Glu:Ty r(4:1)、溴化乙锭
(EB)均购于 Sigma 公司;苯甲磺酰氟 (PM SF)为
Merck公司产品;二硫苏糖醇(DT T)购于上海东风
生物技术有限公司;磷酸对硝基苯酯钠盐(PNPP)为
中科院上海生化所产品;SM -0409鼠抗 c-myc 单
克隆抗体购于北京中山生物技术公司;[γ-32P] A TP
购于北京亚辉公司。
1.2 细胞株与细胞培养
肺腺癌细胞系 SPC -A-1购于中山医科大学
实验动物中心。肺癌 SPC-A -1细胞生长于含 15%
灭活小牛血清 、100 u/ml青霉素和 100 mg/L 链霉素
的 RPM I-1640的完全培养基中 , 置 37℃, 5%CO 2
饱和湿度的孵箱内培养。
1.3 DNA 拓扑异构酶的制备
DNA 拓扑异构酶的制备[ 6] :收集(0.5 ～ 1.0)×
108细胞 , 2500 g 离心 10 m in , 沉淀悬浮于核缓冲液
A (内含 1 mmol/L KH2PO4 , 150 mmol/L NaCl ,
5mmol/L MgCl2 , 1 mmol/L EDTA , 0.1 mmol/L
PM SF , 0.01 mmol/L DT T 和 10%的甘油 , pH6.4)
中 , 460 g 离心 10 min。以下步骤均在 4 ℃下操作。细
胞核用缓冲液 A冲洗一遍 ,旋转一次 ,后悬浮于 1 ml
缓冲液 A 和 9 ml缓冲液 B(含 0.3%T ri ton X-100
的缓冲液 A)中 ,轻轻混匀 10 min ,离心 ,沉淀重新悬
浮于 1 ml缓冲液 C (与 A 液基本相同 , 不同的是
N aCl终浓度为 0.35 mol/L), 轻轻混匀 30 min 后 ,
12 000 g 离心 15 m in 。取上清为含 TOPO Ⅰ和
TOPO Ⅱ的粗酶溶液 , 以 Bradfo rd法[ 9 ]测定蛋白含
量 , 酶溶液中加入等体积甘油和 1 g/L BSA , -80℃
保存备用。
1.4 DNA 拓扑异构酶Ⅰ活性的测定[10 ]
在 5μl缓冲液(100 mmol/L T ris-HCl pH8.1 ,
100 mmol/L KCl , 5 mmol/L DT T , 100mg/L BSA)
中加入 0.25 μg 超螺旋 pUC19 质粒 DNA , 1U 酶
(600 ng 核蛋白提取液)液及不同浓度药物 , 反应终
体积 20 μl。将此反应液置于 37℃水浴中温育 30
min 。加入 5μl反应终止液(10%SDS , 0.5%溴酚兰 ,
50%甘油)中止反应 。在 0.8%琼脂糖凝胶中电泳 8
h , 电泳缓冲液为 1×TBE , 溴化乙锭(EB)溶液 (1
mg/L)染色 30 min 。在 260 nm 紫外灯下观察结果 。
1.5 DNA 拓扑异构酶Ⅱ活性的测定
在 5 μl反应缓冲液(200 mmol/L Tris-HCl ,
400 mmol/L KCl , 40 mmol/L M gCl2 , 2 mmol/L
N a2EDTA , 2mmol/L DTT ,120 mg/L BSA , 4mmol/
L ATP ,pH 7.5)中加入 0.3μg 超螺旋 pBP322 DNA ,
李金华 ,等.半边旗有效化合物对肺癌细胞 DNA 拓扑异构酶 、TPK 及 c-myc基因的影响
765《癌症》2000年第 19卷第 8期
1U 酶液及不同浓度的药物 ,反应终体积 20μl。将此
反应液置于 30℃水浴中温孵 30 m in 。加入 5μl反应
终止液(10%SDS , 0.5%溴酚兰 , 50%甘油)中止反
应 。在 0.8%琼脂糖凝胶中电泳 8 h , 电泳缓冲液 1×
TBE ,EB溶液(1 mg/L)染色 30 min , 260 nm 紫外灯
下观察 , 照相记录。
1.6 TPK样品的制备及其活性测定
参考 Krang 氏法[ 11]略作修改
收集处于对数生长期的 SPC -A-1 细胞 (约
1×1010/L)先经 0.9%N aCl洗涤两次 , 再悬浮于 3
m l缓冲液(20 mmol/L T ris-HCl ,pH 7.5 ,2 mmo l/
L Na2EDTA , 0.25 mol/L 蔗糖 , 20 mmol/L DTT ,
0.5 mmo l/L PM SF , 5 mg/L Leupept in)中 ,冰浴超
声破碎细胞(70W ,30 s), 280 g 离心 10 m in ,上清经
100 000 g 离心 1 h 后 , 所得上清即为胞液 TPK 样
品 。沉淀加入适量含 0.5%TritonX-100的上述缓
冲液中 , 再冰浴超声破碎细胞 , 于 100 000 g 离心 1
m in ,上清即为膜性 TPK样品。以酚试剂法测定蛋白
含量。
TPK 活性测定:反应混合体系总体积 50 μl , 内
含 20 mmol/L T ris-HCl pH 7.5 , 50 mmo l/L M g-
Cl2 , 50 mmol/L M nCl2 ,50 mmo l/L NaVO3 , 7 mg/L
PNPP , 840 mg/L 聚 Glu∶Ty l(4∶1), 50 mmol/L
[γ-32P] A TP(含 1μci), TPK 样品液(胞液 TPK 20
μg 蛋白质 ,膜性 TPK 12μg 蛋白质)及相应的有效成
分 A 的浓度(对照管不加)。于室温下反应 10 min ,立
即吸取全部 50 μl反应液平均点于两张直径为 1.5
cm 的Whatman 滤纸上 ,阴干 ,滤纸用 10%三氯醋酸
洗涤七次 ,最后用丙酮洗涤一次 ,阴干后置闪烁杯中 ,
加 10 ml闪烁液于 Bechman液体闪烁计数仪计数。
以上条件测定的活性减去不加聚Glu∶Ty l(4∶1)时
所测得的活性 ,即为 T PK 活性 。
1.7 流式细胞仪间接荧光检测法测定有效成分 A
对癌基因蛋白表达的影响[ 12]
化合物 A 处理细胞 24 h 后 , 胰酶消化 , 离心收
集(约 2×109/L), PBS洗涤两次 , 用 1%的多聚甲醛
于 4 ℃冰箱中固定 10 ～ 15 min , 细胞用 PBS 洗涤两
次后重悬浮于含 0.1%Tri ton x -100的 PBS 中 , 时
间不超过 5 min 。细胞经用 PBS 洗涤一次后 ,加入稀
释后(1∶40)的单抗即一抗 , 4℃孵育 2 h 或过夜。细
胞经 PBS 洗涤一次后 , 加入 FITC 标记的羊抗鼠
IgG(1∶20)即二抗 ,室温下孵育 60 m in ,PBS 洗一次
后上机检测 , 488 nm 激发波长下计数 1×104 个细胞
的阳性表达率。设置阳性对照组 、阴性对照组和药物
处理组 。其中阴性对照组用 PBS 代替一抗 ,其余步骤
均同上 。
2 结 果
2.1 化合物 6F 、 A对 SPC-A-1细胞 DNA 拓扑
异构酶粗酶液中 TOPO Ⅰ活性的影响
当 0.25 μg 的 pUC19超螺旋 DNA 单独与 1U
酶作用后 , DNA 完全松解或断裂 , 但在 6F 、A作用
下 , 酶松解或断裂超螺旋 DNA 的活性受到抑制。1
mg/L 的 6F 和 A即开始抑制酶的活性 , 100 mg/L
的 6F 使酶反应完全中止;100 mg/L 的化合物 A 也
非常强烈地抑制酶的活性(见图 2)。
2.2 6F 和 A 对 DNA 拓扑异构酶 Ⅱ松弛活性的抑
制作用
当 pBR322 DNA 在 1 U 酶作用下 ,完全断裂 ,但
在 PsL 有效成分 6F 、A 的作用下 ,酶活性受到抑制。
0.01 mg/L 的 6F 已能强烈抑制 TOPO Ⅱ的活性 ,
0.1 mg/L 浓度时酶的活性被全部抑制;10.0 mg/L
的 A 亦可强烈抑制酶的活性 , 100.0 mg/L 时 , 酶反
应完全中止(图 3)。
2.3 有效成分 A 对 SPC -A-1细胞中胞膜 TPK
活性的影响
体外实验结果表明:A 对 SPC-A-1细胞中胞
膜 T PK 的活性有一定的抑制作用 , 但对胞浆 TPK
的活性几乎没有影响 。20 mg/L 的 A 对胞膜 T PK 活
性抑制率为 18.6%;当 A 的浓度增加到 100 mg/L
时 ,对胞膜 TPK 活性抑制率仅为 22.7%(见表 1)。
766 李金华 ,等.半边旗有效化合物对肺癌细胞 DNA 拓扑异构酶 、TPK 及 c-myc基因的影响
提示 T PK 不是 A 作用于细胞的靶点 , A 对细胞生长
的抑制作用不是通过直接降低 TPK 的活性而实现
的 。
2.4 有效成分 A 对癌基因 c -myc 蛋白表达的影
响
16.0 mg/L 的化合物 A 作用细胞 24 h 后 ,相对
于对照组细胞 、用药组细胞 c-myc 基因的阳性表达
率从 (57.2±1.20)%下降到 (19.4±4.45)%, P
<0.01。
3 讨 论
以 DNA 拓扑异构酶为靶分子进行抗肿瘤药物
的筛选和研究代表着肿瘤化疗的又一新方向 ,已经证
明拓扑异构酶是许多抗肿瘤药物作用的靶点[13 ,14 ] 。
本文的实验结果表明:半边旗抗肿瘤有效成分 6F 、A
能够抑制肺癌 SPC -A-1细胞 DNA 拓扑异构酶Ⅰ
的活性 , 同时我们也发现 6F 和 A亦能抑制 HL -60
细胞中 TOPO Ⅰ的活性[ 15] , 但是它们抑制 TO PO Ⅰ
的方式不同于已知的 TO PO Ⅰ抑制剂 , 如喜树碱
(CPT)。CPT 等许多拓扑异构酶的抑制剂正是通过
稳定 TOPO-DNA 断裂复合物而起抗肿瘤作用的。
然而我们的实验发现 6F 、A 不能促进 TOPO Ⅰ介导
的 TOPO Ⅰ-DNA 断裂复合物的形成 , 相反却抑制
这种复合物的形成 ,抑制作用随浓度增加而增加。我
们推测 6F 、A 可能也是直接结合到 TOPO Ⅰ而使其
失去解螺旋的活性。
6F 、A 是一含α,β -亚甲基环戊酮结构的对映贝
壳杉烷类化合物 , 据文献报道[12 ]含此结构的化合物
可经 M ichael加成反应与含巯基的酶结合 ,导致酶失
活 。我们的实验也证实了 6F 、A 在体外可与还原型谷
胱甘肽作用 , 从而降低 6F 、A对胃癌 MGC-803细
胞生长的抑制作用。已知拓扑酶Ⅰ中存在必不可少的
巯基 , 这些基团在 DNA 断裂或重连接过程中起重要
的质子受体或供体作用。我们推测 6F 、A 可能与这些
巯基结合使其失去质子供体或受体的作用 , 进而影
响酶的活性 , 是 6F 、A 抑制 TOPO Ⅰ活性的原因之
一 。这提示我们 , 6F 、A可能直接作用于酶分子本身 ,
从而使酶失活。
本实验中 , 我们还发现 6F 、 A 可以抑制 SPC-
A-1细胞 DNA TOPO Ⅱ的活性 。使超螺旋 DNA 不
被断裂或解开 ,但其作用方式完全不同于大多数已知
的 TOPO Ⅱ的抑制剂 , 如 m-AMSA , Vp-16等的
作用方式。6F 、A是抑制了 TOPO Ⅱ介导的 DNA 的
断裂 , 因此我们认为 6F 、A 是在酶和 DNA之间形成
TOPO Ⅱ-DNA 复合物之前直接与酶起作用 , 进而
抑制酶的活性。
酪氨酸蛋白激酶 (TPK)参与激素和生长因
子等胞外信息的传递 , 与细胞的增殖和恶变有关
[ 5 ] 。据报道 DNA TOPO Ⅰ 、TOPO Ⅱ是 TPK 的底
物 , TOPO Ⅱ和 TPK 共有一个共同的 ATP 位点
序列-GXGXXG [ 16 ] , TPK 和 TOPO Ⅱ都催化核
苷酸上的一个磷酸基团和蛋白质上的一个酪氨酸残
基之间的磷酸化反应。许多被认为是 TPK特异抑制剂
的化合物也可以抑制 DNA TOPO Ⅰ或/和 TOPO Ⅱ
的活性。Genistein 第一个被认为是 TPK的特异性抑
制剂 , 也可抑制 DNA TOPO Ⅱ的活性[16 ] 。Genistein
可以和 AT P 竞争结合到生长因子受体酪氨酸蛋
白激酶上 , 推测它也可以结合到 TO PO Ⅱ上的
A TP 位点 , 抑制 TOPO Ⅱ的活性[ 16 ] 。Ty rphostin
的衍生物是 TPK 的抑制剂 , 它们通过直接结合
到 TOPO Ⅰ 、 TOPO Ⅱ分子上而抑制了酶的活
性 , 抑制酶介导的 DNA 断裂 , 与 Genistein 的作
用方式不一样[ 6] 。A和 Ty rphostin 的衍生物一样 ,可
直接与酶结合 ,抑制其解螺旋的活性 ,但 A 对 TPK
767《癌症》2000年第 19卷第 8期
活性影响不大。可以认为 , TPK 不是 A 作用于细胞
的靶点 。
癌基因是细胞内特殊的 DNA 序列 , 该基因的表
达与细胞的癌变及恶性细胞的维持密切相关 ,干扰癌
基因的表达则能够抑制癌细胞的增殖 。 c-myc基因
与许多肿瘤有关 , 在很多人类肿瘤中都有 c-myc基
因的高度表达和扩增。一些 TOPO Ⅱ的抑制剂可以
干扰癌基因的表达 , Rion 的实验表明 [ 17] , 在
TOPO Ⅱ作用下 ,m -AMSA ,VM -26 , 9-OH-E1
(9-羟基玫瑰树碱)能引起 c-myc基因断裂 , 断裂
主要集中在 5-末端及其内含子部位 , 而 5-末端
是 c-myc基因表达的控制点 , 该区 DNA 的断裂导
致其转录的失活 , 抑制细胞增殖 , 在抑制细胞生长的
同时 , 有 c-myc 基因表达的下降。本文的实验结果
表明:半边旗有效成分 A 可以抑制肺癌 SPC-A-1
细胞 c-myc癌基因的蛋白表达。A 对 c-myc基因
蛋白表达的抑制作用与其抑制肿瘤细胞生长是相一
致的。
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[ 编辑及校对:钟均行]