全 文 ：分子探针法快速发现半边旗中迈克尔反应受体分子
刘建群，高俊博，刘小红，舒积成，张　锐
（江西中医药大学 现代中药制剂教育部重点实验室，江西 南昌３３０００４）
摘　要：目的：快速发现半边旗中的迈克尔反应受体分子，为该类活性成分的进一步研究奠定基础。方
法：以乙醇钠为催化剂，将半边旗提取液与紫外分子探针对硝基苯甲酰乙酸乙酯进行柱前衍生迈克尔加
成反应。反应完毕后，加入乙酸中和催化剂终止反应得反应液。将反应液与半边旗原提取液在相同条
件下进行 ＨＰＬＣ对比分析。发生加成反应的迈克尔反应受体分子色谱峰面积将相应减小，并产生迈克
尔加成产物的新色谱峰。综合保留时间、色谱峰形和ＤＡＤ紫外光谱图确定原提取液和反应液 ＨＰＬＣ
图谱中的迈克尔反应受体分子。结果：从半边旗提取液 ＨＰＬＣ图谱上鉴定出迈克尔反应受体分子８
个，其中２个色谱峰化合物进行迈克尔加成反应速度较快，基本反应完全。根据半边旗化学成分及其
ＤＡＤ紫外光谱特征判断，这些迈克尔反应受体分子可能为对映贝壳杉烯二萜成分。结论：首次采用对
硝基苯甲酰乙酸乙酯分子探针法快速发现了半边旗中迈克尔反应受体分子。
关键词：分子探针；ＨＰＬＣ；半边旗；迈克尔反应受体分子
中图分类号：Ｒ２８４．１　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：１６７３－２１９７（２０１４）０６－００１９－０３
收稿日期：２０１３－１１－３０
作者简介：刘建群（１９７０－），男，博士，江西中医药大学教授，硕士生导师，研究方向为中药活性成分及质量评价。
　　半边旗（Ｐｔｅｒｉｓ　ｓｅｍｉｐｉｎｎａｔａ）系凤尾蕨科凤尾蕨属植
物，以全草入药，主要分布于华南、西南及浙江、江西、福建、
台湾、湖南等地。其味苦、辛、凉，收载于《中药大词典》，具
有清热解毒、止血、止泻、消肿止痛及治疗蛇伤、菌痢、肠炎、
肝炎和抗肿瘤等功效［１－２］。文献［３－５］报道半边旗的活性成分
有对映贝壳杉烯二萜、蕨素倍半萜以及黄酮等化合物。其
主要活性成分对映贝壳杉烯二萜具有较广谱的抗肿瘤活
性。例如，梁念慈等［６－８］报道的５Ｆ、６Ｆ等对映贝壳杉烯二萜
具有较好的抗鼻咽癌、结肠癌、胰腺癌、肺癌和白血病作用。
对映贝壳杉烯二萜是一类重要的迈克尔反应受体分子。迈
克尔加成反应［９］是指亲电的共轭体系与亲核的负电体系进
行的共轭亲核加成反应。含有烯键或炔键与吸电子基团
（如羰基、氰基等）共轭相连形成的亲电共轭体系的化合物
称为迈克尔反应受体分子。迈克尔反应受体分子具有许多
重要的药理活性，如酶抑制活性［１０］、抗病毒活性［１１］、抗肿瘤
活性［７，１２］和抗炎活性［１３］等。研究表明，对映贝壳杉烯二萜
的抗肿瘤活性与其Ｄ环中具有ｅｘｏ－亚甲基环戊酮结构有
关。该结构可以与受体氨基酸的亲核基团，如氨基、羟基及
巯基等发生不可逆迈克尔加成反应，从而体现出较好的抗
肿瘤活性［１４］。为深入研究开发迈克尔反应受体分子，

本文
４　讨论
《保健食品检验和评价技术规范》（２００３版）规定的抗疲
劳检测指标及判断标准为：小鼠负重游泳实验游泳时间延
长，血乳酸、血清尿素氮含量下降，肝糖原／肌糖元含量上
升。如果耐力指标以及三项生化指标中两项符合判断标
准，即可判定该受试样品具有缓解疲劳的作用。本研究通
过游泳实验对小鼠的耐力指标及生化指标进行了检测，并
对补骨脂醇提物和水煎物的抗疲劳活性进行了比较。
补骨脂具有抗肿瘤、治疗骨质疏松、雌激素样、抗氧化、
增强免疫功能以及治疗白癜风等药理作用，应用广泛［５］。
本实验研究显示，补骨脂醇提物可以显著延长小鼠负重游
泳时间，降低乳酸血清含量，升高肝糖原含量。根据抗疲劳
判断标准可以判定补骨脂醇提物具有缓解疲劳的作用，但
是补骨脂醇提物抗疲劳的确切机制有待进一步深入研究，
相比之下，补骨脂水煎液抗疲劳活性不明显，可能不适宜作
为抗疲劳药物。
参考文献：
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（责任编辑：尹晨茹）
—９１—
首次建立了基于分子探针对硝基苯甲酰乙酸乙酯的 ＨＰＬＣ－
ＤＡＤ法快速发现半边旗中迈克尔反应受体分子的方法，本
研究为迈克尔反应受体分子活性成分的发现提供了新的方
法。
１　仪器与材料
Ａｇｉｌｅｎｔ　１２００型液相色谱仪（配备ＤＡＤ检测器，美国安
捷伦公司）。对硝基苯甲酰乙酸乙酯（分析纯，Ｓｉｇｍａ公司）。
半边旗药材（２０１３年１月采自江西省萍乡市，经作者刘建群
鉴定为凤尾蕨属植物半边旗Ｐｔｅｒｉｓ　ｓｅｍｉｐｉｎｎａｔａ　Ｌ．的全草，
凭证标本ＮＯ．２０１３０１０１保存于作者单位）。
２　方法
２．１　半边旗提取液制备
准确称取半边旗药材１ｇ，用２０ｍＬ无水乙醇浸泡１５
ｍｉｎ，７０℃水浴回流提取４５ｍｉｎ，过滤，减压蒸干，用无水乙醇
溶解并定容至１０ｍＬ，得半边旗提取液的贮备液，备用。
取１．４４×１０－３　ｍｏｌ／Ｌ乙醇钠的乙醇溶液１ｍＬ，加入冰
醋酸１０μＬ，摇匀，加入半边旗提取液贮备液１ｍＬ，无水乙醇
１ｍＬ，摇匀，过０．４５μｍ有机滤膜，得半边旗提取液。
２．２　半边旗迈克尔加成反应液制备
取１．７３×１０－３　ｍｏｌ／Ｌ对硝基苯甲酰乙酸乙酯的乙醇溶
液１ｍＬ，加入１．４４×１０－３　ｍｏｌ／Ｌ乙醇钠的乙醇溶液１ｍＬ，振
摇反应５ｍｉｎ。加入上述半边旗提取液的贮备液１ｍＬ，摇匀，
２５℃反应１ｈ后加入冰醋酸１０μＬ终止反应，０．４５μｍ有机滤
膜过滤，得半边旗迈克尔加成反应液。
２．３　ＨＰＬＣ色谱条件
Ｄｉａｍｏｎｓｉｅｕｉｌ　Ｃ１８柱（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ，５μｍ），流速为
１ｍＬ／ｍｉｎ，柱温为 ２５℃，检测波长为 ２３４ｎｍ，进样量为
２０μＬ，流动相：水－甲醇，梯度条件：０ｍｉｎ（５％ＭｅＯＨ）→
５０ｍｉｎ（１００％ＭｅＯＨ）→６０ｍｉｎ（１００％ＭｅＯＨ）。取半边旗提
取液和半边旗迈克尔加成反应液各２０μＬ注入色谱仪，在相
同色谱条件下，记录 ＨＰＬＣ色谱图。
３　结果与讨论
迈克尔反应受体分子一般含有α，β－不饱和酮，如对映贝
壳杉烯，其α，β－不饱和酮的双键可以与分子探针对硝基苯甲
酰乙酸乙酯的活泼亚甲基发生迈克尔加成反应，加成反应方
程式见图１。半边旗提取液和半边旗迈克尔加成反应液
ＨＰＬＣ色谱见图２。与反应液色谱图比较，提取液中部分色
谱峰面积减少，反应液色谱图中出现新色谱峰。迈克尔反应
受体分子及其与对硝基苯甲酰乙酸乙酯迈克尔加成反应产
物的紫外光谱见图３，迈克尔反应受体分子紫外光谱中只有
一个吸收峰，最大吸收波长为２３４ｎｍ左右，为α，β－不饱和酮
ｎ→π＊跃迁形成，与文献［１５－１６］报道的α，β－不饱和酮对映贝
壳杉烯二萜的紫外光谱图基本一致。综合对映贝壳杉烯二
萜为半边旗的主要活性成分，因此我们初步判断这些迈克
尔反应受体分子为对映贝壳杉烯二萜。加成反应产物的紫
外光谱最大吸收波长为２６６ｎｍ左右，其峰形和最大吸收波
长与对硝基苯甲酰乙酸乙酯基本一致，说明加成产物的主
要共轭系统与对硝基苯甲酰乙酸乙酯基本一致，从侧面说
明迈克尔反应受体分子的α，β－不饱和酮的双键被加成。
综合保留时间、色谱峰形和ＤＡＤ紫外光谱图，在原提
取液和反应液 ＨＰＬＣ图谱中，初步确定８个迈克尔反应受
体分子色谱峰（１～８号峰，见图２）。这些化合物经过迈克
尔加成反应后，有的色谱峰峰面积减小，有的完全反应消
失，其色谱峰面积减小相对值（峰面积差／原峰面积）见表１。
在加成反应液 ＨＰＬＣ色谱图中，根据ＤＡＤ紫外光谱图判断
２号和６号峰附近的色谱峰均不符合２号和６号峰的紫外
光谱特征，因此说明２号和６号峰已完全反应，其加成反应
速度较快。容易发生加成反应的迈克尔反应受体分子具有
较强的亲电性，可能容易与受体氨基酸发生作用，从而体现
出较好的抗肿瘤活性。前期研究表明，迈克尔加成反应速
率可能与其抗肿瘤活性存在正相关性。因此，２号和６号色
谱峰化合物可能具有较好的抗肿瘤活性，值得关注。根据
ＤＡＤ图谱分析，笔者从半边旗迈克尔加成反应液的 ＨＰＬＣ
色谱图中初步发现６个迈克尔加成产物色谱峰（①～⑥号
峰，见图２）。实验结果表明该方法可快速发现迈克尔反应
受体分子，为后续针对性分离鉴定这些活性成分奠定了基
础。
图１　迈克尔反应受体分子与对硝基苯甲酰乙酸
乙酯迈克尔加成反应式
图２　迈克尔加成产物ＨＰＬＣ色谱
—０２—
图３　ＨＰＬＣ－ＤＡＤ紫外光谱
表１　迈克尔反应受体分子色谱峰及其加成
反应后峰面积减小相对值
色谱峰号 保留时间（ｍｉｎ） 峰面积减小相对值（％）
１　 １３．４５７，１３．７５９　 ２３．１１
２　 ２０．４０７　 １００
３　 ２４．７５４　 １７．１８
４　 ３７．７０８　 ２８．６７
５　 ３８．５６５　 ２１．６７
６　 ４７．７６８　 １００
７　 ５０．６２６　 ２５．９９
８　 ５４．３４５　 ３２．５６
参考文献：
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ｄｉｂｅｎｚｏｙｌｍｅｔｈａｎｅ，ｄｉｂｅｎｚｏｙｌｐｒｏｐａｎｅ，ａｎｄ　ｄｉｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅａｃｅ－
ｔｏｎｅ：Ｒｏｌｅ　ｏｆ　Ｍｉｃｈａｅｌ　ａｃｃｅｐｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｍｉｃｈａｅｌ　ｄｏｎｏｒｓ［Ｊ］．Ｂｉ－
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（责任编辑：尹晨茹）
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