全 文 ：〔2〕林宣贤.一种新型的天然保健食品麦绿素的制备与研究〔J〕.食
品科技 , 2005 , 7:91.
〔3〕黄相国 ,沈裕虎.麦绿素及麦绿素产品的开发前景〔J〕.麦类作物
学报 , 2003 , 23(1):79-80.
〔5〕夏勇 ,徐彩菊 ,陈玉满 ,等.麦绿素急性毒性和遗传毒性试验〔J〕.
卫生毒理学杂志 , 2004 ,(4):15-16.
罗浮粗叶木醇提取物治疗鸭乙型肝炎的实验研究
徐　斌 ,谢志春 ,韦金露(广西医科大学流行病学教研室 南宁 530011)
摘要:目的　观察罗浮粗叶木醇提取物体内抗鸭乙型肝炎病毒(duck hepatit is Bvirus , D-HBV)的作用。方法　采用 RT-PCR技术筛选 DHBV
阳性 3日龄广西麻鸭 60只。将麻鸭随机分为空白对照组 ,模型组 ,罗浮粗叶木醇提物高 、中 、低剂量组和阿昔洛韦组。用药前 、用药第七 、十四 、
二十一天及停药第五天 ,取各组麻鸭静脉血 ,采用实时定量荧光 PCR技术检测血清 DHBV DNA 含量 ,并检测血清中 AST 、ALT 含量和 DHBsAg
OD值;停药 5天后取肝脏组织进行病理组织学观察。结果　观察期内 ,罗浮粗叶木醇提物高 、中 、低剂量组与模型组病毒载量随时间的变化趋
势都比较接近 ,差异无统计学意义(P>0.05);罗浮粗叶木醇提物高 、中 、低剂量组与模型组比较 , DHBsAg 差异无统计学意义(P>0.05);罗浮粗
叶木醇提物高 、中 、低剂量组 ALT 、AST 值与模型组比较 ,差异无统计学意义(P>0.05);肝脏病理检查显示各组动物肝脏病变严重程度的差异
无统计学意义(P>0.05)。结论　罗浮粗叶木醇提物高 、中 、低 3个剂量组均未见明显抑制 DHBV 复制的作用和对 DHBV 引起的肝损伤具有
保护作用。
关键词:中草药;罗浮粗叶木醇提物:鸭乙型肝炎病毒;荧光定量 PCR;动物实验
中图分类号:R969　文献标识码:A　文章编号:1006-3765(2010)-02-0037-03
作者简介:徐斌 ,男(1976-), 主管医师 , 硕士研究生 ,主要从事病毒
性肝炎防治
通讯作者:谢志春 , E-mail:ylw anylng@yahoo.com.cn
基金项目:广西壮族自治区研究生教育科研创新项目(No.
2008105981004M230)
　　乙型肝炎是我国高发传染病之一 ,每年有 28 万人死于
HBV感染引起的疾病〔1 、2〕。治疗乙肝的措施主要有护肝 、调
节免疫 、抗病毒 3 个方面 , 抗病毒是治疗乙肝的关键〔3 、4〕。天
然药物具有来源广泛 , 毒性低和副作用小等特点。福建宁化
县畲族群众长期以来利用罗浮粗叶木治疗肝炎及其所至的疲
劳乏力〔5〕 , 另外 ,我国民间应用粗叶木植物治疗肝炎黄疸被收
录在《中华木草》〔6〕中。本实验旨在观察罗浮粗叶木体内抗鸭
乙型肝炎病毒(duck hepatitis Bvirus , DHBV)和保肝护肝效果。
1　材料与方法
1.1　实验动物　1日龄广西麻鸭 130 只 , 购自南宁市饲料兽
药禽苗市场 ,雌雄不拘 , 体质量 40 ～ 50g。
1.2　主要药物　罗浮粗叶木由福建省三明市第二医院胡恩
药师提供 , 70%乙醇 6 次提取后浓缩成含生药 6.62g·g-1 。
阿昔洛韦(ACV), 由南京瑞尔医药有限公司生产 , 含量:1 片
0.1g。
1.3　主要试剂　DHBV 阳性标准血清由本实验室制备 , Taq
DNA聚合酶(Fermentas), dNTPMixture(上海生物工程有限
公司), 6×Loading Buffer(大连宝生物工程有限公司), 天冬氨
酸氨基转移酶试剂盒(上海复星长征医学科学有限公司), 丙
氨酸氨基转移酶试剂盒(上海复星长征医学科学有限公司),
HBsAg酶联免疫检测试剂盒(上海荣盛生物技术有限公司 ,
Taqman 引物探针由捷瑞生物工程(上海)有限公司合成 ,扩增
产物 180bp , 上游引物:5 CCAAGATACTGGAGCCCAAATC
3 ,下游引物:5 GCCCATTGGAGCTTTCCTAAA 3 , probe:
5 FAM-CCGTTGTCCGTCAGATACAGCAAGCCT-TAMARA
3 。
1.4 　主要仪器 　7000 Fast Real-time PCR System(美国
ABI), 2400 型 GeneAmp PCR system(美国 Perkin-Eimer corpo-
ration)UNIVERSAL HOOD Ⅱ型凝胶成像分析系统(美国
Bio-Rad)。
1.5　动物模型的建立　取广西麻鸭100只 ,腹腔注射 DHBV
强阳性血清 0.2mL , 15 天后经颈外静脉采血 1mL , 10000r·
min-1离心 5min 后取血清 , 参考郭龙华等〔27〕报道的裂解液煮
沸法提取 DNA。 用 FQ-PCR法检测 , 选取血清病毒负荷在
104 ～ 106 copies/μL麻鸭。
1.6　荧光定量 PCR体系　反应液组成:上游引物 0.15μL ,
下游引物 0.15μL , Toqman 探针 0.15μL , dNTP 0.25μL , Taq
酶 0.2μL , 10×PCR buffer(without Mg2+)2μL , MgCl2 2μL , 血
清提取物 2μL , 去离子水 13.10μL , 构建 20μL 反应体系。
PCR反应条件:95℃预变性 3min;95℃变性 30s , 56℃退火
30s , 72℃延伸 30s , 共 35 个循环;每次延伸结束时检测荧光强
度。数据读取和分析均由 ABI Prism 7000 SDS 软件完成。
1.7　动物实验　RT-PCR 筛选 DHBV 血清病毒负荷在 104
～ 106 copies/μL麻鸭雏鸭 60 只 , 随机分成 5 组 , 每组 12 只:
模型组 、ACV 组 、罗浮粗叶木醇提物高剂量组 、罗浮粗叶木醇
提物中剂量组 、罗浮粗叶木醇提物低剂量组;另取 PCR筛选
DHBV 为阴性的 12只麻鸭作为空白对照组。各组均喂以普
通饲料 , 自由饮水。将 ACV 研碎溶于水 ,按 200mg/(kg·d)给
ACV 组雏鸭 1 次性灌胃。罗浮粗叶木醇提物高 、中 、低剂量
组分别按 2.86、1.43 、0.72g/(kg·d)给药 , 1 日 1 次;复测体质
·37·
Strait Pharmaceutical Journal Vol 22 No.2 2010
量 1次/周 ,根据体质量调整用药剂量。连续喂药 14d 后 , 停
药观察 5d。
1.8　检测指标　于用药前 、用药第七 、十四天及停药后第五
天各抽取雏鸭颈静脉血 1.5mL , 分离血清 , 分装成两份 , 分别
用于AST 、ALT 、DHBsAg 和病毒载量检测检测。停药后第五
天 ,将全部实验动物处死后剖腹 , 取肝脏组织行常规 HE 染色
后观察炎症情况。
1.9　统计方法　数据处理分析均采用 DPS 统计软件〔7〕。血
清 DHBV DNA含量 、AST 、ALT 的数据采用重复测量资料的
方差分析进行分析 ,病理检查的数据采用 Kmskal-Wallis 法进
行秩和检验。
2　结果
2.1　用药前后病毒载量变化情况　罗浮粗叶木醇提物各剂
量组 DHBV DNA 载最变化的总体趋势与模型组相似 , 差异
无统计学意义(P>0.05);ACV 组的病毒载量与模型组的差
异有统计学意义(P=0.043), 但停药后 DHBV DNA 载量升
至用药前水平。
表 1　各组麻鸭用药前后的病毒载量变化(拷贝数的对数值)
组别 n(只)
测定时间
T0 T7 T14 P5
高剂量组 12 6.29±1.58 7.20±1.40 5.98±1.03 6.41±0.60
中剂量组 12 5.37±1.71 6.12±1.27 6.12±0.92 6.48±1.22
低剂量组 12 6.73±0.89 7.15±0.97 6.67±1.44 6.26±2.36
ACV组 12 6.00±1.50 4.45±3.56 5.05±1.23 5.89±1.37
模型组 12 6.36±2.09 5.83±1.83 5.65±1.48 7.10±1.10
2.2　用药前后 DHBsAg OD 值的变化情况　正常组的 DHB-
sAg OD 值明显低于各感染组 , 差异有统计学意义(P <
0.05),高 、中 、低剂量组以及 ACV 组与模型组比较 , 差异无统
计学意义(P>0.05)。
表 2　各组麻鸭用药前后的 HBsAg OD值变化
组别 n(只)
测定时间
T0 T7 T14 P5
高剂量组 12 0.44±0.25 0.51±0.35 0.44±0.39 1.11±0.53
中剂量组 12 1.16±0.53 0.63±0.28 0.76±0.47 1.04±0.39
低剂量组 12 0.70±0.32 0.76±0.47 0.67±0.38 0.95±0.52
模型组 12 0.52±0.30 0.53±0.32 0.80±0.45 0.88±0.47
ACV组 12 0.42±0.25 0.65±0.25 0.79±0.54 0.97±0.55
正常组 12 0.06±0.01 0.07±0.01 0.08±0.01 0.07±0.01
2.3　用药前后 ALT 、AS T 活性变化情况　整个观察过程中 ,
各个时点正常组的 ALT 、AST 值明显低于各感染组 , 差异有
统计学意义(P<0.05);高 、中 、低剂量组以及 ACV 组与模型
组比较 ,差异无统计学意义(P >0.05)。
2.4　病理检查　在光镜下对每个标本的病变范围进行估计
后 ,以病变范围占全部视野的 1/3 、2/3 作为划分肝脏病变轻 、
中 、重的界线 , 用 Kruskal-Wallis 法进行秩和检验得出χ2=
0.248 , P>0.05 , 各治疗组与模型组鸭子肝脏病变范围 , 即严
重程度总体相同(见表 5)。
表 3　各组麻鸭用药前后的ALT 变化(U·L -1)
组别 n(只)
测定时间
T0 T7 T14 P5
高剂量组 12 35.47±11.72 31.12±16.80 23.18±11.28 44.65±14.51
中剂量组 12 34.66±8.06 30.14±15.29 20.26±7.24 34.81±9.20
低剂量组 12 42.48±9.05 34.03±16.54 18.38±9.10 35.65±10.84
模型组 12 38.85±14.17 31.77±12.30 21.08±12.30 37.01±16.04
ACV 组 12 49.02±11.05 35.93±20.45 27.94±13.32 39.37±20.77
正常组 12 14.33±3.20 15.74±3.80 14.19±1.97 13.15±13.15
表 4　各组麻鸭用药前后的AST 变化(U·L-1)
组别 n(只)
测定时间
T0 T7 T14 P5
高剂量组 12 25.76±7.72 29.36±22.93 31.61±19.41 31.86±12.80
中剂量组 12 21.38±5.45 25.82±7.13 20.04±10.83 26.75±6.03
低剂量组 12 21.75±9.04 23.10±10.52 22.67±14.39 19.00±7.47
模型组 12 21.11±8.53 29.62±8.43 25.69±8.22 23.89±7.12
ACV 组 12 23.39±7.94 29.61±16.60 17.30±5.90 26.80±8.71
正常组 12 12.72±4.27 15.57±3.32 12.50±3.14 14.30±3.65
表 5　停药后 5天各组动物肝病理切片病变范围分级分布
组别 n(只) 无病变 病变范围<1/ 3 病变范围〔1/3 , 2/ 3〕 病变范围>2/ 3
高剂量组 12 1 1 6 4
中剂量组 12 1 2 3 6
低剂量组 12 0 2 5 5
模型组 12 0 3 4 5
ACV 组 12 0 2 6 4
合计 60 2 21 16 21
3　讨论
DHBV 与 HBV 同属嗜肝 DNA 病毒科 , 它们在形态 、结
构 、复制 、组织亲和性等生物学特性等方面十分相似 , 并且
DHBV 可人工感染雏鸭和鸭胚 , 感染持续时间长 ,无明显的自
然转阴现象 , 因此国内外学者目前普遍采用 DHBV 感染 1 ～ 3
日龄雏鸭建立乙型肝炎动物模型进行筛选有效治疗药物 , 因
此本实验应用 1 日龄雏鸭经颈静脉感染 DHBV 的方法来建
立鸭乙型肝炎动物模型进行罗浮粗叶木醇提物抗 HBV 疗效
的初步评价 , 并用阿昔洛韦作为阳性药物对照。
本实验采用的基于 TaqMan 探针的实时荧光定量 PCR
法 , 其基本原理是在常规 PCR技术的基础上加入荧光素标记
的探针 , 以显示 PCR产物的动态积累 , 在得到的 S 型扩增曲
线的前期阶段 , PCR反应符合指数性扩此可以在单纯指数方
程的基础上 , 通过比较产物积累的速度(时间)进而确定初始
模板的分子量。与传统的 Do t免疫印迹法以及基于荧光染料
的实时荧光定量 PCR法相比 ,具有灵敏度高 、特异性强 、所需
时问短等特点。
本次动物实验结果表明:罗浮粗叶木醇提物高 、中 、低剂
量 3 个治疗组都没有显示出明显的抑制鸭血清中 DHBV 活
性和抑制 DHBsAg表达的的作用;罗浮粗叶木醇提物的 3个
·38·
海峡药学　2010年　第 22卷 第 2期
剂量组均无降低 ALT、AST 水平及改善肝功能的作用:本实
验中肝脏 HE 染色病理检查各实验组间无统计学上的差异 ,
说明罗浮粗叶木醇提物的 3 个剂量组均无保护肝脏的作用。
出现这种结果的原因可能为:①用药剂量没达到有效水平;
②观察例数过少 ,导致检验效能低:③鸭乙型肝炎病毒作为人
乙型肝炎病毒的替代模型 ,本身存在种属差异从而影响结果:
④罗浮粗叶木醇提物没有抑制 DHBV 和保肝护肝的作用。
参考文献
〔1〕彭文伟.传染病学(第六版)〔M〕.北京:人民卫生出版社 , 2005 ,
30-39.
〔2〕李立明.流行病学(第六版)〔M〕.北京:人民卫生出版社 , 2005 ,
453-459.
〔3〕Hoofnagle Jay H , Di Bisceglie Adrian M.The t reatment of chronic vi-
ral hepatit is The New England Journal of Medicine.1997 , 336(5):
347-356.
〔4〕Kazuhiro Hanazaki.Ant ivi ral therapy for chronic hepat itis B:A review
Targets-Inflammation &Allergy , 2004 , 3 , 63-70.
〔5〕陈坤全 ,胡思 ,陈清容.关于福建宁化“黄痧药”原植物的研究〔J〕.
海峡药学 , 2005 ,(4):103-104.
〔6〕国家中医药管理局.中华本草〔M〕.上海:上海科技出版社.
1999.第六册 , 445.
〔7〕唐启义 ,冯明光.实用统计分析及其 DPS数据处理系统著〔M〕.
北京:科学出版社 , 2002.
·药品检验·
通 解 口 服 液 的 薄 层 色 谱 鉴 别
何建华(江苏省姜堰市中医院 姜堰 225500)
摘要:建立通解口服液中的大黄 、茜草 、蒲黄的鉴别方法。方法　利用薄层色谱鉴别通解口服液中的大黄 、茜草 、蒲黄。结果　对处方中的三
味药材进行了薄层色谱分析。斑点清晰。相互间分离良好。专属性强。空白试验表明阴性样本对照药材的鉴别没有干扰。结论　该方法简
便可行。重现性好。为通解口服液质量控制提供方法。
关键词:大黄;茜草;蒲黄;通解口服液;薄层鉴别
中图分类号:R927.2　文献标识码:A　文章编号:1006-3765(2010)-02-0039-02
作者简介:何建华 ,女(1967.7-)。毕业于南京中医药大学中药系。
职称:副主任中药师 ,主要从事制剂工作。联系电话:13701433908
Ident ifat ion of Tongjie oral by TLC
HE Jian-hua(Jiangsu JiangYan Hospital Of Traditional Chinese Medicine , Jiangyan ,225500 , China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　To establish a method for the identification of Radix Et Rhizoma Rhei ,Radix Et Rhi-
zoma Rubiae ,pollen Typhae in the priscription of Tong jie o ral.METHDOS　Radix Et Rhizoma Rhei , Radix Et
Rhizoma Rubiae ,pollen Typhae w ere identified by thin-layer-chromatography.RESULTS　Three contents in the
prescription were analy zed.The methods were strong specificitied and the blank test showed no interfer-
ence.CONCLUSION　The methods are simple , sensitive and accurate wi th good reproducibility and can be used
for quatity cont rol of Tongjie o ral.
KEY WORDS:Radix Et Rhizoma Rhei;Radix Et Rhizoma RuBiae;Pollen Typhae;Tongjie oral;TCL
　　通解口服液是我院院内制剂 , 由生大黄 、茜草 、蒲黄等组
成 ,能有效预防和治疗危重患者急性肠功能衰竭和多功能障
碍综合征(MODS), 降低病死率〔1〕。为进一步控制该制剂的
质量。本实验对通解口服液的部分药材进行薄层定型鉴别 ,
结果满意。
1　仪器与试药
超声波仪(KQ 2200E 昆山市超声仪器有限公司);旋转
蒸发仪(RE-52 旋转式蒸发器 上海安亭电子仪器厂);通解口
服液(姜堰市中医院 本院制剂);大黄 、茜草 、蒲黄(泰州医药
有限公司提供);阴性样品(按处方工艺缺味制得制剂);所用
制剂均为分析纯 , 硅胶 G.H 为化学纯。
2　方法与结果
2.1　大黄薄层色谱鉴别　取成品5 mL , 加水 5m L 与盐酸
·39·
Strait Pharmaceutical Journal Vol 22 No.2 2010