全 文 ：生命科学与实验研究
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世界
近年来,随着抗生素、合成及半合成抗菌药物在临床的广泛应
用,使许多严重的感染性疾病得到有效控制。然而,由于抗生素的广
泛使用及滥用情况,临床上细菌耐药日益严重。减少细菌耐药和耐
药菌株的产生是当前医学界面临的重要课题[1]。目前,随循证医学的
发展,中药及其复方制剂在抗感染新药的研发方面日益引发关注。
中药有抗菌,缓解和消除细菌耐药的作用。在几千年的临床应用中
仍未发现明显的耐药菌产生。粗叶木属是茜草科中的一个大属,约
有180个种,间断分布于亚洲、非洲至中、南美洲[2]。榄绿粗叶木为粗
叶木属中的一个变种,我国特有,分布于浙江、江西、福建等地,生长
在海拔300~1500米处的林下[3]。现关于榄绿粗叶木的提取物的研究
尚处于初始阶段,民间对治疗肝炎等疾病具有一定疗效,至于榄绿
粗叶木植物在抗菌方面的研究至今却未见相关文献报道。为此,本
研究对榄绿粗叶木甲醇提取物及其抗菌活性进行了研究,并且通过
测定经MESLL处理后细菌培养液总糖浓度在不同时间内的变化,初
步探讨其抑菌机理,以期为临床研发药物提供基础资料。
1 实验材料
1.1 药材和菌株
榄绿粗叶木购自药材市场;实验菌株购自广东环凯微生物科技
有限公司生产的冻干标准菌株,具体名称和编号分别为:金黄色葡
萄球菌(CMCC26003)、铜绿假单胞菌(ATCC27853)、肺炎克雷伯菌
(CMCC 4 6 1 1 7 )、奇异变形杆菌(CMCC 4 9 0 05 )、大肠杆菌
(CMCC25922)。
1.2 试剂和仪器
甲醇(分析纯)、0.9%氯化钠购自广东利泰制药股份有限公司;
多功能粉碎机(上海高翔食品机械厂GX-02);旋转蒸发仪(上海申顺
生物科技有限公司R-1002);电热恒温培养箱(精宏DNP-9162);生
物安全柜(济南鑫贝西生物技术有限公司BSC-1500IIA2-X);高压
蒸汽灭菌锅(日本Hirayama HAV-50);双目显微镜(日本尼康E-
200);电子天平 (瑞安市安特称重设备有限公司LQ-A3002)。
1.3 培养基的营养基质及制备
肉汤培养基:蛋白胨10g/L;牛肉膏3g/L;NaCl5g/L。营养琼脂
培养基:在肉汤培养基基础上加入琼脂25g/L;;pH7.35-7.45。大致
过程:配料;熔化;矫正pH;分装;灭菌;倒板;检定;保存。
1.4 MESLL 制备
收集榄绿粗叶木茎,经鉴定后,洗净并放于阴凉处自然晾干;用
剪刀将其剪成长2～3cm、宽0.5～1 cm碎片,置于多功能粉碎机内
粉碎,用100目筛子过。称量500g,倒入5L棕色玻璃瓶中,加入甲醇浸
泡、过滤,置于旋转蒸发仪中蒸发其上清液,得到甲醇提取物浸膏。
配制成含50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39、0.20、0.10mg/
mL MESLL的溶液。放入4℃冰箱保存,待用。
1.5 菌悬液的制备[4]
将供试的菌株进行活化,取适量一活化培养好的菌株置于装有
9ml无菌水的试管中,制成菌悬液,再用无菌吸管取充分混合的菌悬
液于试管中,加入9ml无菌水,用显微镜直接计数法测菌体个数,调
制浓度为含菌体为108cfu/ml的菌悬液,标记备用。
2 MESLL 体外抗菌实验
2.1 抑菌圈的测定
本实验采用牛津杯结合纸片法测定抑菌圈。①取一无菌平板,
在其底面作四等分,用蜡笔标记菌株名称、黄酮浓度和阴阳性对照。
②分别取0.1ml待试菌悬液注入标记好的培养基表面,并使其均匀
地涂布于平板表面。③用无菌镊子将灭菌过的牛津杯置于预定位
置,再用镊尖轻压牛津杯上部使之与平板紧贴。④用移液枪分别将
100 、50mg/mL两种浓度的MESLL各100ml打入牛津杯内,以相同
方式将生理盐水作为阴性对照打入牛津杯内。⑤用无菌镊子夹取对
该菌敏感的抗生素纸片贴于培养基表面,作为阳性对照。⑥如上方
法和步骤,将其余菌株做相同处理。⑦置于37℃恒温培养箱中培养,
18~24h测量抑菌圈直径,并计算其平均值。
2.2 最小抑菌浓度(MIC)的测定[5-6]
MESLL50 g/L浓度起始,各细菌试验均采用营养肉汤培养基
倍比稀释药液8次,各药液质量浓度依次为:25,12.5,6.25,3.12,1.
榄绿粗叶木茎甲醇提取物体外抗菌活性研究
吴梅姐
(泉州医学高等专科学校 福建泉州 362000)
摘要:目的 研究榄绿粗叶木茎甲醇提取物(以下简称MESLL)的抗菌作用及机理。方法 体外抗菌实验,采用抑菌圈法及MIC法测定了金黄色葡
萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌和大肠杆菌5种临床常见致病性菌株的抗菌活性。②结果 MESLL对金黄色葡萄球菌和肺炎
克雷伯菌均有一定程度的抗菌活性,而对其它3种菌株则无明显抑制作用;结论 MESLL对金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌两种测试菌株具有一定抗菌
活 性 。
关键词:榄绿粗叶木 抗菌活性 抑菌圈 MIC
中图分类号:Q93 文献标识码:A 文章编号:1674-2060(2016)05-0020-02
表 1 MESLL 抑菌圈直径
表 2 MESLL 体外抗菌作用的 MIC
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56,0.78,0.39,0.20 g/L,每孔1ml加入96孔细胞培养板,每稀释度
药液设2个复孔,分别加入各试验菌液50ul,并设各菌液不加药物的
对照孔,37℃培养24小时,观察细菌生长情况。以无细菌生长的药物
最高稀释度为MIC。
3 结果与讨论
3.1 MESLL 对 5 种菌株的抗菌活性的测定
抑菌圈法测定50mg/ml、25 mg/ml 的抗菌效果如表1所示。
阳性对照参照2013年CLSI部分细菌抑菌圈直径和最低抑菌浓度
(MIC)解释标准[7]。总体来看,榄绿粗叶木对供试菌肺炎克雷伯菌的
抑制作用最强,其次为金黄色葡萄球菌。而对铜绿假单胞菌、奇异变
形杆菌等无明显抑制作用,是否与MESLL浓度偏低,有待进一步研
究和探讨。
3.2 MIC 的测定
MESLL对肺炎克雷伯菌和金黄色葡萄球菌均有一定强度的抑
制作用,MIC分别达到0.39和0.2mg/ml,而铜绿假单胞菌、奇异变形
杆菌和大肠杆菌均为25 mg/ml,与抑菌圈结果相对应,具体见表2
4 讨论
4.1 抗菌药物自诞生起为细菌感染性疾病贡献了非凡的成就。
但随着抗菌药物的广泛及不合理应用,细菌耐药性问题近年来已经
发展到了非常严重的地步,医学界虽已采取了一系列积极应对措
施,但细菌对抗生素的耐药性问题仍日趋严重,细菌耐药性依然是
当前国内乃至全世界普遍存在却至今仍无法攻克的难题,已成为了
全球关注的一个热点。如汪复等[8]研究国内主要地区各医院证实细
菌耐药性仍是临床重要问题,依然需要引起高度关注。
4.2 肺炎克雷菌可引起典型的原发性肺炎,也可引起其他各部
位感染。肺炎克雷伯菌是临床感染性疾病和医院感染中常见的、重
要的病原菌。全国细菌耐药监测网和全国医院感染监控网报道,肺
炎克雷伯菌的分离率居第2或第3位。随抗菌药的普遍使用,肺炎克
雷伯菌多药耐药及耐药的菌株问题日益严重[9]。金黄色葡萄球菌,特
别是MRSA等多重耐药菌的出现,使其成为了名副其实的超级细
菌。且据美国CDC统计数据表明,MRSA感染的致死率已超过了艾
滋病、帕金森和谋杀[10]。
4.3 我国自20世纪40年代起研究中药的体外抑菌试验,证明了
一大批中药对各种细菌有抑制作用[11]。,中药及相关提取物制剂是祖
国传统医学的重要组成部分,随着循证医学的发展和中药抗菌机制
及方法的不断出现和更新,特别是“血清药理学”的提出,极大地推动
抗菌中药体内外的研究和开发,让研究者更加重视中药的临床研究,
以此缓解和控制抗生素滥用给人类带来的长期悬而未解的难题。
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