全 文 ：作者简介:海广范 ,女 , 1974年 4月出
生, 河南南阳人 , 硕士。联系电话:
15937317049;E-mail:haiguangfan@163.
com
AboutHAIGuang-Fan:Female,
borninApril, 1974.Masterdegree.
Tel:15937317049;E-mail:haiguang-
fan@ 163.com
收稿日期:2009-08-20
修回日期:2009-12-08
本文编辑:方红玲
■基金项目:河南省科技厅 2008年
科技攻关项目基金资助(编号:
082300450440)
作者单位:453003　河南省新乡市 ,
新乡医学院药学院
通讯作者:刘巨源 , E-mail:liujuyuan
@xxmu.edu.cn
Receiveddate:Aug20, 2009
Accepteddate:Dec8, 2009
Foundation item: Foundation of
HenanProvinceScienceandTechnolo-
gyDeparmentin 2008 Scientificand
Technological Projects ( No:
082300450440)
FromtheColegeofPharmacy, Xinx-
iang MedicalUniversity, Xinxiang
453003, HenanProvince, China
Responsibleauthor:LIUJu-Yuan, E-
mail:liujuyuan@xxmu.edu.cn
【实验研究】
溪黄草乙素对人视网膜母细胞瘤细胞
生长的影响■
海广范　牛秉轩　白素平　刘巨源
EffectofrabdoserrinBoncellgrowthof
humanretinoblastoma
HAIGuang-Fan, NIUBing-Xuan, BAISu-Ping, LIUJu-Yuan
【Keywords】　serraterabdosiaherb;retinoblastoma;tumorcells;celcycle;apopto-
sis
【Abstract】　Objective　ToinvestigatetheeffectofrabdoserrinBoncelgrowth
ofhumanretinoblastoma(Rb).Methods　MTTmethodwasusedtodetecttheeffect
ofrabdoserrinBatdifferentconcentrations(5 μmol· L-1 , 10 μmol· L-1 , 20 μmol·
L-1 , 40 μmol· L-1 and80 μmol· L-1)andatdiferenttimepoints(24 hoursand48
hours)oncelgrowthofhumanRb.TheeffectsofrabdoserrinBonthecelcycleand
celapoptosisofRbwereobservedusingpropidiumiodide(PI)stainingandflowcy-
tometer, respectively.Results　RabdoserrinBcouldinhibitcelproliferationineach
dosegroup.Theopticaldensitywentdownwithandtheapoptoticrateswentupwith
increasingofdose.TheIC50 valuefortheinhibitionofRbcellsbyrabdoserrinBwas130μmol· L-1.TheeffectoninhibitionofRbcelswasincreasedwiththeincreasingof
rabdoserrinB.TheapoptoticratesofRbcels, whichwerepretreatedwithrabdoserrinB
for24 hoursatdifferentconcentrations, 5 μmol· L-1 , 10 μmol· L-1 , 20 μmol· L-1 , 40
μmol· L-1 and80 μmol· L-1 , were(5.13 ±0.82)%, (8.67 ±1.20)%, (14.39 ±
2.07)%, (26.45±3.01)%and(34.18±1.25)%, respectively, andwas(1.07±0.03)%
incontrolgroup.TheapoptoticratesofRbcelswhichwerepretreatedwithrabdoserrin
Bfor48 hourswere(6.49±1.15)%, (11.90±1.54)%, (19.21±2.66)%, (37.10 ±
3.62)% and(47.55±3.19)%, respectively, andwas(2.36 ±0.27)% incontrolgroup.
TheapoptoticrateofRbcelsineverydosegroupwasobviouslyincreasedaftertreating
withrabdoserrinBfor24hoursor48hours, andwithacertaindosedependentmanner,
whichindicatedthattheeffectofrabdoserrinBoncellapoptosiswasraisedwiththein-
creasingofdose.Conclusion　RabdoserrinBcanchangecellcycleofRb, inhibitcels
intoG2/Mphase, andfurtherinduceapoptosisofRbcelstrains.
[ RecAdvOphthalmol2010;30(4):332-334]
【中图分类号】　R774.1　　【文献标志码】　A
【文章编号】　1003-5141(2010)04-0332-03
【关键词】　溪黄草;视网膜母细胞瘤;肿瘤细胞;细胞周期;凋亡
【摘要】　目的　研究溪黄草乙素对人视网膜母细胞瘤(retinoblastoma, Rb)细胞生长的影响。方法　MTT法测定不同浓度(5
μmol· L-1 、10 μmol· L-1 、20 μmol· L-1、40 μmol· L-1和 80 μmol· L-1)和不同时间(分别作用 24h和 48 h)溪黄草乙素对人
Rb细胞株增殖的影响;碘化丙啶染色 ,流式细胞术观察溪黄草乙素对 Rb细胞周期及细胞凋亡的影响。结果　溪黄草乙素各个
剂量组对 Rb细胞的增殖均有显著抑制作用 , OD值随溪黄草乙素浓度升高而下降 , 抑制率随浓度增加而增加。溪黄草乙素对
Rb细胞株的 IC50为 130 μmol· L-1 ,且随着溪黄草乙素剂量增加对 Rb细胞株抑制作用增强。不同剂量组(对照组 、 5 μmol·L-1组 、10μmol· L-1组 、20 μmol· L-1组 、 40μmol· L-1组 、80 μmol· L-1组)溪黄草乙素作用 Rb细胞 24h后 , 细胞凋亡率分别
为:(1.07±0.03)%、(5.13±0.82)%、(8.67±1.20)%、(14.39±2.07)%、(26.45±3.01)%、(34.18±1.25)%;作用 Rb细胞
48 h后 ,细胞凋亡率分别为:(2.36 ±0.27)%、(6.49 ±1.15)%、(11.90±1.54)%、(19.21 ±2.66)%、(37.10±3.62)%、
(47.55±3.19)%。表明溪黄草乙素作用 Rb细胞 24h和 48 h后 Rb细胞的凋亡率在各个剂量组均显著升高 , 也呈现一定的剂
量-效应关系 , 提示溪黄草乙素对 Rb细胞凋亡率的影响随着剂量增加而升高。结论　溪黄草乙素可阻滞细胞进入 G2/M期 , 进
而诱导 Rb细胞株凋亡。
[眼科新进展　2010;30(4):332-334]
　　溪黄草因其喜生于山谷溪旁 ,新鲜叶片揉碎有
黄汁而得名 。溪黄草为唇形科香茶菜属植物 ,狭基
线纹香茶菜 (IsodonlophanthoidesHaravar.gerandi-
anausHara)为溪黄草的主要资源。溪黄草原为民间
·332· 　http://www.ykxjz.com 眼 科新进展　 2 0 10年 4月　第 30卷 　第 4期RecAdvOphthalmol　Vol.30 No.4April2010
DOI :10.13389/j.cnki.rao.2010.04.002
常用草药 ,现已作为中药材广泛用于细菌和病毒感
染 、肿瘤 、肝脏疾病等的预防和治疗 [ 1] 。近年来 ,随
着对溪黄草研究的日渐深入 ,其抗肿瘤活性逐渐成
为研究的重点。溪黄草主要活性成分为二萜类和黄
酮类化合物 ,二萜类对人肺癌细胞等具有一定的抗
癌活性 [ 2] 。金人玲等 [ 3]分离并鉴定出溪黄草乙素 ,
发现其具有明显的抗癌活性。本实验通过观察不同
浓度溪黄草乙素对人视网膜母细胞瘤(retinoblasto-
ma, Rb)细胞的抑制作用 ,探讨其对 Rb细胞细胞周
期和细胞凋亡的影响 ,进一步研究其抗肿瘤作用。
1　材料与方法
1.1　药品与试剂　新生小牛血清(杭州四季青公
司);RPMI1640培养基和胰蛋白酶(Gibco公司);溪
黄草乙素 ,新乡医学院药学院实验室提取 ,临用前用
DMSO溶解 ,并用 RPMI1640培养基稀释 ,使 DMSO
浓度低于 0.5 g·L-1;MTT和碘化丙啶(propidiumi-
odide, PI)(广州威佳生物科技有限公司)。二甲基
亚砜(dimethylsulfoxide, DMSO),美国 Sigma公司提
供 。
1.2　Rb细胞　Rb细胞由新乡医学院实验室冻存。
复苏后 Rb细胞在含有体积分数 10%新生小牛血
清 、100×103 U· L-1青霉素 、100×103 U· L-1链霉
素的 RPMI1640培养基中贴壁生长 ,于 37 ℃、体积
分数 5%CO2培养箱中培养 ,每 2 d换液一次 ,培养
瓶铺满时用 2.5 g· L-1胰蛋白酶消化传代 , 10 d后
细胞培养至对数生长期备用。
1.3　仪器　超净工作台(江苏苏净集团有限公司);
流式细胞仪(美国 BeckmanCoulter公司);倒置显微
镜 XDS-200D(NikonCo);CO2培养箱(ThermoForma
Co.LTD);酶标仪(ThermoMultiskunMk3公司)。
1.4　MTT法测定 Rb细胞的存活率　取对数生长
期人 Rb细胞 ,人 Rb细胞计数约 10×106 L-1 ,接种
于 96孔板中 ,每孔液体 100 μL,细胞贴壁后弃去原
液 ,换成含体积分数 0.5%新生小牛血清的 RPMI
1640培养液饥饿培养。 24 h后更换培养液 ,加入溪
黄草乙素 ,使其浓度分别为 5 μmol·L-1、10 μmol·
L-1、20μmol· L-1、40μmol· L-1 、80 μmol·L-1 ,同
时设置人 Rb细胞作为对照组 ,每组均设置 6个复
孔 ,继续培养 24h,每孔加 15 μLMTT, 4 h后弃去所
有液体 ,加 115 μLDMSO溶解 , 37 ℃静置 0.5 h,酶
标仪 570 nm检测 ,波长 630 nm参考。计算 Rb细胞
抑制率和 IC50。抑制率 =(1-测定组 OD值 /对照组
OD值)×100%。
1.5　流式细胞仪检测溪黄草乙素对 Rb细胞细胞周
期和细胞凋亡的影响　取对数生长期的人 Rb细胞 ,
PBS洗 2遍 , 2.5 g· L-1胰蛋白酶消化 ,用含体积分
数 10%新生小牛血清的 RPMI1640培养基制备成
浓度为 1×109 L-1的细胞悬液 ,于六孔板中每孔接种
2 mL。将六孔板置于 37 ℃、体积分数 5%CO2培养
箱培养 , 24 h后加入溪黄草乙素 ,使其终浓度分别 5
μmol· L-1 、10 μmol· L-1 、20 μmol· L-1 、40μmol·
L-1、80 μmol·L-1;对照组只加相同体积的培养液 。
在给药后 24 h和 48h, Rb细胞用 2.5g·L-1胰蛋白
酶消化 ,离心收集 Rb细胞 , Rb细胞沉淀用体积分数
70%乙醇悬浮 ,在 4 ℃冰箱中固定过夜 。固定后的
细胞用 PBS洗 2遍并悬浮 ,加入 PI染液 , 37 ℃避光
温育 30min,在流式细胞仪上测定 Rb细胞各期 DNA
量 ,分析细胞周期并测定凋亡率(激发波长 488 nm,
发射波长 630 nm)。
1.6　统计学处理　本研究所有数据使用 SPSS12.0
统计软件分析处理 ,所有实验结果采用均数 ±标准
差( x±s)表示 ,组间比较采用单因素方差分析 。 P<
0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　MTT实验结果　MTT法检测溪黄草乙素对 Rb
细胞生长的抑制作用结果见表 1。由表 1可以看出 ,
随着溪黄草乙素浓度的增加 , OD值逐渐减小 ,抑制率
逐渐增加 ,说明随着药物剂量的增加活细胞数量逐渐
减少 ,对 Rb细胞的抑制作用逐渐增强。 80 μmol·
L-1剂量组对 Rb细胞的抑制作用最强。经统计学处
理 ,溪黄草乙素对 Rb细胞的 IC50为 130μmol·L-1。
表 1　溪黄草乙素对 Rb细胞的抑制作用
Table1　InhibitiveeffectofrabdoserrinBonreti-
noblastomacels ( x±s, n=6)
Group ODvalue Inhibitiverate/%
Control 0.58±0.10 0.03±0.00
5μmol· L-1 0.53±0.07 8.63±0.14■
10μmol· L-1 0.50±0.09 13.80±2.06■■
20μmol· L-1 0.45±0.02 23.42±2.45■■
40μmol· L-1 0.37±0.04■ 36.21±3.08■■
80μmol· L-1 0.29±0.05■■ 50.04±2.26■■
Note:Comparedwithcontrolgroup, ■P<0.05, ■■P<0.01
2.2　溪黄草乙素对 Rb细胞周期和细胞凋亡的影响
用流式细胞仪检测溪黄草乙素作用 Rb细胞 24 h和
48h后细胞周期和细胞凋亡率见表 2-表 3。对照组
Rb细胞分布于各个细胞周期。溪黄草乙素作用 Rb
细胞 24h后 40μmol·L-1组和 80μmol· L-1组 G2 /
M期细胞数量明显减少 ,与对照组相比差异均有统
计学意义(均为 P<0.05)。溪黄草乙素作用 Rb细
胞 48 h后 20 μmol· L-1组 、40 μmol· L-1组和 80
μmol· L-1组 G2/M期细胞数量明显减少 ,与对照组
相比差异均有统计学意义(均为 P<0.05)。表明溪
黄草乙素具有抑制 Rb细胞向 G2 /M期移行的作用 ,
并且该作用呈现一定的剂量-效应关系 。溪黄草乙
素作用 Rb细胞 24 h和 48 h后 Rb细胞的凋亡率在
各个剂量组均显著升高 ,也呈现一定的剂量-效应关
系 ,提示溪黄草乙素对 Rb细胞凋亡率的影响随着剂
量增加而升高。细胞处理 48h后凋亡率明显比处理
24h凋亡率升高 ,提示细胞凋亡率可能有随作用时
·333·眼 科新进展 　 20 10年 4月 　第 30卷 　第 4期RecAdvOphthalmol　Vol.30 No.4April2010 http://www.ykxjz.com
间延长而升高。
表 2　溪黄草乙素作用 24 h后对 Rb细胞周期和细胞凋亡率的影响
Table2　EffectofrabdoserrinBoncelcycleandapoptoticratesofRbcels24hourslater ( x±s, n=6)
Group G0/G1(%) S(%) G2 /M(%) Apoptoticrate(%)
Control 63.73±3.19 22.68±1.62 13.64±1.57 1.07±0.03
5μmol· L-1 60.21±2.33 25.09±1.43 14.71±1.85 5.13±0.82＊
10μmol· L-1 57.83±2.41 27.65±2.55 25.50±2.20 8.67±1.20＊
20μmol· L-1 70.90±2.18 19.96±2.15 10.31±1.64 14.39±2.07＊＊
40μmol· L-1 78.05±5.73 26.66±3.54 6.27±0.11＊ 26.45±3.01＊＊
80μmol· L-1 81.27±3.02 15.47±2.01 3.25±0.28＊＊ 34.18±1.25＊＊
Note:＊P<0.05, ＊＊P<0.01comparedwithcontrolgroup
表 3　溪黄草乙素作用 48 h后对 Rb细胞周期和细胞凋亡率的影响
Table3　EffectofrabdoserrinBoncelcycleandapoptoticratesofRbcels48hourslater ( x±s, n=6)
Group (G0/G1)/% S/% (G2 /M)/% Apoptoticrate/%
Control 61.30±3.88 21.41±1.90 17.28±2.05 2.36±0.27
5μmol· L-1 63.72±4.25 19.26±2.34 18.23±1.07 6.49±1.15＊
10μmol· L-1 63.91±3.46 21.35±2.39 15.64±1.62 11.90±1.54＊
20μmol· L-1 71.98±4.35 19.97±3.05 8.02±1.44＊ 19.21±2.66＊＊
40μmol· L-1 74.70±3.18 22.18±1.47 4.12±0.15＊＊ 37.10±3.62＊＊
80μmol· L-1 80.93±5.82 17.94±1.20 1.15±0.01＊＊ 47.55±3.19＊＊
Note:Comparedwithcontrolgroup, ＊P<0.05, ＊＊P<0.01
3　讨论
溪黄草含萜类 、黄酮类 、酚类 、氨基酸等多种化
学成分 ,并具有消炎 、护肝等作用 。廖雪珍等 [ 4]对溪
黄草水提物进行了消炎 、护肝和毒性试验 , 结果表
明 ,溪黄草水提物具有抑制二甲苯致小鼠耳部炎症
反应 ,能对抗醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增
加 ,降低四氯化碳引起的小鼠急性肝损伤后血清谷
丙转氨酶升高的作用 。谢华娣等 [ 5]研究表明 ,溪黄
草具有显著的抑制 HBsAg和 HBeAg分泌的作用。
溪黄草乙素是金人玲等[ 3]首次从溪黄草茎叶中获得
的一种乙醇提取物 ,属于萜类化合物 。据报道溪黄
草乙素对 Hela细胞具有显著的抑制作用[ 6] 。溪黄
草乙素对 Rb细胞的研究尚未见相关报道。本实验
通过观察不同剂量溪黄草乙素对 Rb细胞的作用 ,研
究其对 Rb细胞凋亡的作用 。
细胞凋亡是细胞死亡的一种自然生理学过程 ,
指在一定生理或者病理条件下细胞内特定基因操
纵 、调控的细胞死亡方式 ,因此也被称为程序性细胞
死亡。多数植物性抗肿瘤药物对肿瘤细胞都具有一
定的抑制生长 、促进肿瘤细胞凋亡的作用 。因此 ,细
胞凋亡调控异常在恶性肿瘤的发展过程中具有非常
重要的意义 ,肿瘤防治的关键是抑制细胞的增殖和
(或)促进细胞的凋亡 [ 7] 。
本实验 MTT法检测结果提示溪黄草乙素 5
μmol· L-1组 、10 μmol· L-1组 、20 μmol· L-1组 、40
μmol· L-1组和 80 μmol·L-1组均能够不同程度抑
制 Rb细胞的生长和增殖 ,且呈现一定剂量-效应关
系 。其中以 40 μmol·L-1组和 80μmol·L-1组抑制
作用最为显著 。溪黄草乙素对 Rb细胞的 IC50值为
130μmol· L-1。流式细胞仪检测不同浓度溪黄草
乙素作用 Rb细胞 24h后对细胞周期和凋亡率结果
也显示:40 μmol· L-1组和 80 μmol· L-1组 G2 /M
期细胞数量明显减少;溪黄草乙素作用 Rb细胞 48h
后 20μmol· L-1组 、 40 μmol· L-1组和 80 μmol·
L-1组 G2/M期细胞数量明显减少 ,表明溪黄草乙素
作用 Rb细胞 24h和 48h后均可以抑制 Rb细胞向
G2/M期的移行 ,抑制细胞的分裂和增殖 。该作用呈
现一定的剂量-效应关系 。溪黄草乙素作用 Rb细胞
24h和 48h后 Rb细胞的凋亡率在各个剂量组均显
著升高 ,并且 48 h凋亡率在各个剂量组都比 24 h明
显升高 ,提示该作用也呈现一定的剂量-效应和随作
用时间延长而增高的趋势 。由上述结果可以推测溪
黄草乙素可以通过改变细胞周期来诱导细胞凋亡 。
综上所述 ,溪黄草乙素对人 Rb细胞具有一定的
抗肿瘤活性 ,可通过改变细胞周期来诱导肿瘤细胞
的凋亡 。有关溪黄草乙素改变细胞周期诱导凋亡的
具体作用机制还有待今后进一步研究。
参考文献
1　陈林娇 , 李植华 ,赖小平.世界香茶菜属植物地理分布及其药用前
景 [ J].中药材 , 1996, 19(4):169-173.
2　白素平 , 杨振华 ,范秉琳.毛叶香茶菜二萜成分的细胞毒活性研究
[ J].新乡医学院学报 , 2005, 22(5):407-410.
3　金人玲 ,程培元 ,徐光漪.溪黄草乙素的结构研究 [ J] .中药通报 ,
1987, 12(10):39-39.
4　廖雪珍 ,廖惠芳 ,叶木荣 , 黄桂英 ,周莉玲 ,赖小平.线纹香茶菜 、狭
基线纹香茶菜 、溪黄草水提物抗炎 、保肝作用初步研究 [ J] .中药
材 , 1996, 19(7):363-365.
5　谢华娣 ,陈鸿珊.十味溪黄草颗粒对乙型肝炎病毒的体外抑制作
用 [ J].广东药学 , 2004, 14(6):60-63.
6　肖树雄 ,黄诺嘉 , 林伟忠 , 马丽莎.溪黄草研究进展 [ J].中草药 ,
2000, 31(12):950-951.
7　OhataM, KoyamaY, SuzukiT, HayakawaS, SaekiK, Nakamura
Y, etal.Efectsofteaconstituentsoncellcycleprogressionof
humanleukemiaU 937cels[ J].BiomedRes, 2005, 26(1):1-7.
·334· 　http://www.ykxjz.com 眼 科新进展　 2 0 10年 4月　第 30卷 　第 4期RecAdvOphthalmol　Vol.30 No.4April2010